Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Lignende Vev

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

Her rapporterer vi en metode for 3D bioprinting murine kortikale astrocytter for biofabricating nevral-lignende vev for å studere funksjonaliteten til astrocytter i sentralnervesystemet og mekanismene som involverer glialceller i nevrologiske sykdommer og behandlinger.

Abstract

Astrocytter er glialceller med en viktig rolle i sentralnervesystemet (CNS), inkludert nevronal støtte og funksjonalitet. Disse cellene reagerer også på nevrale skader og virker for å beskytte vevet mot degenerative hendelser. In vitro-studier av astrocytters funksjonalitet er viktig for å belyse mekanismene som er involvert i slike hendelser og bidra til å utvikle terapier for å behandle nevrologiske lidelser. Denne protokollen beskriver en metode for å biofabrikkere en nevrallignende vevsstruktur rik på astrocytter ved 3D-bioprinting astrocytter-ladet bioink. En ekstruderingsbasert 3D-bioprinter ble brukt i dette arbeidet, og astrocytter ble ekstrahert fra C57Bl/6 mus valpenes hjerne kortikaler. Bioink ble tilberedt ved å blande kortikale astrocytter fra opptil passasje 3 til en biomaterialeløsning sammensatt av gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA) og fibrinogen, supplert med laminin, som presenterte optimale bioprintforhold. 3D-bioprintforholdene minimert cellestress, noe som bidro til den høye levedyktigheten til astrocyttene under prosessen, der 74,08% ± 1,33% av cellene var levedyktige rett etter bioprinting. Etter 1 uke med inkubasjon økte levedyktigheten til astrocytter betydelig til 83,54% ± 3,00%, noe som indikerer at 3D-konstruksjonen representerer et passende mikromiljø for cellevekst. Den biomaterialeriale sammensetningen tillot celletilknytning og stimulert astrocytisk oppførsel, med celler som uttrykker den spesifikke astrocyttene markør glial fibrillary acidic protein (GFAP) og har typisk astrocytisk morfologi. Denne reproduserbare protokollen gir en verdifull metode for biofabricate 3D nevrallignende vev rik på astrocytter som ligner cellenes innfødte mikromiljø, nyttig for forskere som tar sikte på å forstå astrocytters funksjonalitet og deres forhold til mekanismene som er involvert i nevrologiske sykdommer.

Introduction

Astrocytter er den mest tallrike celletypen i Sentralnervesystemet (CNS) og spiller en nøkkelrolle i hjernens homeostase. I tillegg til varig nevronstøtte er astrocytter ansvarlige for modulering av nevrotransmittere opptak, opprettholde blod-hjerne barriere integritet, og regulere nevronal synaptogenesis1,2. Astrocytter har også en viktig rolle i CNS-betennelse, som reagerer på skader på hjernen i en prosess som fører til astrocitær reaktivitet eller reaktiv astrogliose3,4, danner et glial arr som forhindrer sunn vevsutstilling til degenerative midler5. Denne hendelsen resulterer i endringer i astrocytters genuttrykk, morfologi og funksjon6,7. Derfor er studier som involverer astrocytters funksjonalitet nyttig for utvikling av terapier for å behandle nevrologiske lidelser.

In vitro-modeller er avgjørende for å studere mekanismer relatert til nevrologiske skader, og selv om vellykket isolasjon og todimensjonal (2D) kultur av kortikale astrocytter er etablert8, klarer denne modellen ikke å gi et realistisk miljø som etterligner innfødt celleadferd og for å reprodusere kompleksiteten i hjernen9. . I 2D-tilstand påvirker dårlig mekanisk og biokjemisk støtte, lavcelle- og cellematriseinteraksjoner og cellesammenslåing fraværet av basal-apikal-polaritet, påvirker cellesignaldynamikk og eksperimentelle resultater som fører til endret cellemorfologi og genuttrykk, som kompromitterer responsen på behandlinger10. Derfor er det avgjørende å utvikle alternativer som gir et mer realistisk nevralt miljø, med sikte på å oversette resultatene til klinikken.

Tredimensjonal (3D) cellekultur representerer en mer avansert modell som rekapitulerer med økte troskapsegenskaper i organer og vev, inkludert CNS11. Når det gjelder glialkultur, bidrar 3D-modeller til vedlikehold av astrocytter morfologi, cellebasal-apikal polaritet og cellesignalering12,13. 3D bioprinting teknologi dukket opp som et kraftig verktøy for biofabricate 3D levende vev på en kontrollert måte ved hjelp av celler og biomaterialer for å gjenskape strukturen og egenskapene til innfødte vev. Bruken av denne teknologien har ført til en betydelig forbedring av resultatprediksjon og har bidratt til regenerativ medisin anvendt på CNS14,15,16.

Protokollen som er beskrevet her beskriver isolasjonen og kulturen til kortikale astrocytter. Protokollen beskriver også en reproduserbar metode for bioprint astrocytter innebygd i gelatin / gelatin methacryloyl (GelMA) / fibrinogen, supplert med laminin. I dette arbeidet ble en ekstruderingsbasert bioprinter brukt til å trykke den biomateriale sammensetningen som inneholder kortikale astrocytter med en tetthet på 1 x 106 celler / ml. Bioprinting skjær stress ble minimert ved å kontrollere utskriftshastigheten, og astrocytter viste høy levedyktighet etter prosessen. Bioprinted konstruksjoner ble dyrket i 1 uke, og astrocytter var i stand til å spre, feste og overleve i hydrogelen, opprettholde astrocytisk morfologi og uttrykke en bestemt markør glial fibrillary surt protein (GFAP)4.

Denne prosedyren er kompatibel med stempeldrevne ekstruderingsbaserte bioprintere og kan brukes til å biotrykke astrocytter avledet fra forskjellige kilder. Den 3D bioprinted modellen foreslått her er egnet for et bredt spekter av nevrale ingeniørapplikasjoner, for eksempel studier av mekanismene involvert i astrocytter funksjonalitet i sunt vev og forstå utviklingen av nevrologiske patologier og behandlingsutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrene som involverte dyr fulgte internasjonale retningslinjer for dyrebruk i forskning (http://www.iclas.org) og ble godkjent av Komiteen for etikk i forskning på Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Mus hjerne disseksjon

  1. Overfør 10 ml kald Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) til en 100 mm kulturrett og 1 ml til en 1,5 ml mikrotube. Forbered en mikrotube per dyr.
    MERK: Både kulturretten og mikrorøret må holdes på is.
  2. Forbered astrocytter kulturmedium ved hjelp av DMEM F12 + 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2% glutamin og 1% Penicillin-Streptomycin (P / S). Steriliser mediet ved å filtrere med et filter på 0,2 μm.
  3. Euthanize C57Bl/6 mus valper (postnatal dag 1) ved halshugging ved hjelp av en skarp operasjonssaks. Bruk tang, trekk huden og eksponer skallen. Sørg for at både saks og tang er sterilisert med 70% etanol.
  4. Klipp skallen fra foramen magnum til toppen av hodet langs sagittalplanet ved hjelp av en skarp buet spiss saks.
    MERK: Pass på at det encefaliske vevet ikke er skadet.
  5. Bruk en spatel som tidligere var sterilisert med etanol 70%, løft hjernen fra kranialhulen og legg den i kulturretten som inneholder 10 ml kald HBSS.
  6. Plasser kulturretten som inneholder hjernen under stereomikroskopet, og bruk to stumpe spisse tang, fjern meningene fra hjernen (Figur 1).
  7. Skill kortikalene fra resten av hjernen ved å rulle dem forsiktig bort fra hjernelinjen ved hjelp av en slikkepott.
  8. Samle begge kortikalene og overfør dem umiddelbart til det samme mikrorøret som inneholder 1 ml kaldt HBSS.

2. Astrocytter isolasjon og kultur

  1. Under laminærstrømmen, kutt kortikale vevet i små biter ved hjelp av en buet mikrosaks, og vask dem med 1 ml HBSS ved å pipettere opp og ned 3x. Vent til vevet slår seg ned. Fjern HBSS og legg til fersk HBSS, gjenta prosessen to ganger til.
  2. Fjern HBSS og inkuber vevet med 1 ml 0,05% trypsin ved 37 °C i 5 minutter.
    MERK: Bare trypsin fordøyelsen er tilstrekkelig på dette tidspunktet.
  3. Mekanisk dissosiere vevet ved forsiktig pipettering opp og ned 15x.
    MERK: Fullstendig dissosiasjon av vevet observeres ved økningen i suspensjonsturbiditeten og ved fravær av store fragmenter av vev i suspensjonen.
  4. Overfør løsningen til et 15 ml konisk rør, nøytraliser trypsinaktivitet ved å legge til et likt volum FBS, og filtrer løsningen i et cellesilfilter på 0,4 μm for å fjerne ikke-dissosierte fragmenter.
  5. Vask filteret med 1 ml astrocytter medium, samle cellefjæringen som passerte gjennom silen, og sentrifuger den i 5 min ved 200 x g og 25 °C. Etter sentrifugering, kast supernatanten og suspender pelletsen i 1 ml astrocytter kulturmedium.
  6. Overfør cellefjæringen til en T25-kulturflaske, utgjør volumet av mediet til 3,5 ml, og inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Forsikre deg om at cellene etter 24 timer er tilhenger. Deretter erstatter du mediet og endrer det hver tredje dag.
  8. Etter 7 dager, fjern mikroglia og oligodendrocytter fra kulturen ved å vaske cellene med 2 ml 1x PBS.
  9. Bytt ut PBS-løsningen med astrocyttens kulturmedium og la kulturflasken ligge i en orbital shaker ved 180 o/min over natten.
    MERK: Astrocytter danner et sammenfallende monolag på omtrent 10-12 dager med kultur.

3. Syntese av gelatin methacryloyl (GelMA)

  1. Vei 10 g gelatin oppnådd fra svinehud og oppløs i 100 ml PBS ved å la oppløsningen røre på en varmeplate ved 240 o/min og 50 °C til fullstendig oppløsning.
  2. Under en hette, tilsett 2 ml metakrylanhydrid (MA) for en lav grad av funksjonalisering, og la gelatinemulsjonen røre ved 240 rpm og 50 °C i 2 timer.
    FORSIKTIG: MA faresetning: H302 + H332 (skadelig ved svelging eller innånding), H311 (giftig i kontakt med huden), 314 (forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader), 315 (forårsaker hudirritasjon), H317 (kan forårsake en allergisk hudreaksjon), H318 (forårsaker alvorlig øyeskade), 331 (giftig ved innånding), H332 (skadelig ved innånding), H335 (kan forårsake irritasjon i luftveiene). Retningslinjer for håndtering: P261 (unngå innånding av støv/røyk/gass/tåke/damp/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (HVIS I ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern kontaktlinser, hvis de er til stede og enkle å gjøre. Fortsett skyllingen. Ring umiddelbart et GIFTSENTER/lege), P301 + P312 + P330 (HVIS DET SVELGES: Ring et GIFTSENTER/lege hvis du føler deg uvel. Skyll munnen).
    MERK: Tilsett MA veldig sakte, dråpe for dråpe.
  3. Fortynn gelatin-MA-oppløsningen i 100 ml forvarmet PBS (50 °C) for å oppnå 200 ml endelig volum og la oppløsningen røre ved 240 o/min og 50 °C i 10 minutter.
  4. Klipp ~ 20 cm dialysemembran (molekylær cutoff 12-14 kDa) og suge den i deionisert vann til den er myk.
    MERK: Fyll membranene med deionisert vann for å sikre at det ikke er hull eller feil.
  5. Bruk en trakt, overfør gelatin-MA-løsningen til membranene.
    MERK: Lukk begge sider og la det være ekstra plass inne for å tillate blanding.
  6. Plasser membranene som inneholder gelatin-MA-løsningen i en beholder med 2 L destillert vann for dialyse, la dem røre ved 40 °C i 5 dager (500 o/min).
    MERK: Dekk beholderen for å unngå vannfordampning.
  7. Bytt destillert vann to ganger på en dag. Hver gang snur du membranene opp ned for homogenisering.
  8. På den femte dagen blander du 200 ml forvarmet ultrarent vann (40 °C) til den dialyzed gelatin-MA, og la den røre i 15 minutter ved 40 °C.
  9. Overfør gelatin-MA-løsningen til 50 ml koniske rør opp til 25 ml og la rørene forbli ved -80 °C i 2 dager.
    MERK: Oppbevar rørene horisontalt for å lette lyofilisering.
  10. Lyofiliser de frosne løsningene i 3-5 dager og oppbevar den lyofiliserte GelMA beskyttet mot fuktighet.

4. Bioink forberedelse

MERK: For å oppnå 1 ml bioink, anbefales det å fremstille minst 3 ml biomaterialeoppløsning, da det kan være tap under filtrering.

  1. Fremstilling av fibrinogenoppløsning
    1. Forbered saltoppløsning (NaCl 0,9%) i deionisert vann, og oppløs 10 mg fibrinogen fra storfeplasma i 1 ml saltoppløsning for å oppnå en konsentrasjon på 10 mg / ml.
      MERK: Som fibrinogen adsorber til glass, ikke bruk glassflasker for å forberede fibrinogenoppløsningen.
    2. La oppløsningen stå under agitasjon ved 37 °C til fullstendig oppløsning av fibrinogen.
      MERK: For fibrinogenoppløsning, bruk et roterende system plassert inne i en ovn ved 37 °C. Magnetisk agitasjon (180 rpm) av fibrinogen på en varm plate ved 37 °C er også egnet. Under denne tilstanden tar 10 mg / ml fibrinogen ca. 40 minutter å oppløse.
  2. Fremstilling av gelatin/GelMA-oppløsning
    1. Vei 0,12 g gelatin og tilsett den i 1,9 ml forvarmet PBS (40 °C) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 4 % (w/v) gelatin. Vortex for å lette oppløsningen.
    2. Hold emulsjonen ved 40 °C til fullstendig oppløsning.
    3. Vei 0,06 g lyofilisert GelMA og overfør til gelatinoppløsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2% (w / v) GelMA. Vortex for å lette oppløsningen.
    4. Hold oppløsningen ved 40 °C til den er fullstendig oppløsning.
  3. Fremstilling av astrocytter-ladet gelatin/GelMA/fibrinogen bioink
    1. Pipette 0,9 ml av 10 mg/ml fibrinogenoppløsningen og overføres til gelatin/GelMA-oppløsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3 mg/ml fibrinogen.
    2. Vei 0,015 g fotoinitiator (PI) og overfør til gelatin/GelMA/fibrinogenløsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5% (w/v) PI. Bland oppløsningen ved å vippe røret opp og ned og hold det ved 40 °C beskyttet mot lys for å unngå PI-nedbrytning.
      MERK: Fyll bioink ved 4 °C i maksimalt 24 timer.
    3. Under laminærstrømmen filtrerer du løsningen ved hjelp av et 0,2 μm filter i et sterilt 15 ml konisk rør.
      MERK: Den biomaterialede løsningen skal være ved 37-40 °C for å tillate filtrering.
    4. Overfør 980 μL av den biomaterialerke løsningen til et 15 ml konisk rør.
    5. Fortynn laminin i saltløsning for å oppnå en lagerløsning på 100 μg / ml.
    6. Pipette 20 μL laminin og overføring til røret som inneholder bioink for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 μg / ml laminin.
    7. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned, unngå bobler. Hvis noen bobler vedvarer, sentrifugerer du det koniske røret ved 200 x g i 2 min. Hold bioink ved 37 °C til den blandes med cellene.
    8. Trypsinize primære astrocytter med 0,05% trypsin i 5 min.
      MERK: Bruk astrocytter fra avsnitt 1 til 3.
    9. Nøytraliser trypsinaktiviteten med FBS med et forhold på 1: 1 og overfør cellene til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger den på 200 x g i 5 min.
    10. Tell cellene og overfør 1 x 106 celler til et annet konisk rør. Sentrifuger den på 200 x g i 5 min.
    11. Fjern supernatanten som etterlater et lite volum (~200 μL) for å suspendere cellepelleten, ved å trykke forsiktig på bunnen av det koniske røret.
    12. Overfør 1 ml gelatin/GelMA/fibrinogenoppløsning til røret som inneholder cellene, og rør forsiktig opp og ned for å homogenisere, og oppnå en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml.

5. Forberedelse av krysskoblingsløsningen

  1. Trombin rekonstituering
    1. Forbered en lagerløsning av trombin 100 U/ml i sterilt deionisert vann med 0,1 % (m/v) bovint serumalbumin (BSA) i et konisk rør på 15 ml. Lager i mikrorør ved -20 °C.
      MERK: Som trombin adsorber til glass, ikke bruk glassflasker til å forberede lagerløsningen eller lagre aliquots.
  2. Fremstilling av trombin-CaCl2-løsning
    1. Pipette 100 μL trombin lagerløsning og overføring til et 50 ml konisk rør som inneholder 8,9 ml sterilt deionisert vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 U / ml trombin.
    2. Forbered en 10% (w / v) CaCl2-løsning i deionisert vann og steriliser med et 0,2 μm filter.
    3. Overfør 1,1 ml av 10% CaCl2-løsningen til det koniske røret som inneholder trombin, for å oppnå et endelig forhold på 1: 9 (CaCl2 til trombin).
      MERK: Klargjør krysskoblingsløsningen på volumet som skal brukes i eksperimentet, og unngå lagring.

6. Bioprinting astrocytter-ladet bioink ved hjelp av en ekstruderingsbasert bioprinter

  1. Design av nevralt vev
    1. Bruke G-koden: Konstruere et rutenett på 6 x 6 mm (kvadrert form) med 1 mm avstand mellom hver biotrykte linje på X- og Y-aksen, og 6 lag på Z-aksen (0,2 mm mellom hver linje); sett ekstrudering (E) til 0,01 mm, og øk 0,001 mm ved hvert nye lag på Z-aksen; og sett utskriftshastigheten (F) til 400 mm/min (Tilleggsinformasjon).
  2. Oppsett av bioprinter
    1. Utsett maskinen for UV-lys i 15 minutter, og tørk den deretter av med etanol 70%.
    2. Slå på bioprinteren ved hjelp av strømbryteren. Koble maskinen til datamaskinen via en USB-kabel. Åpne den kontrollerende programvaren for å koble den til bioprinteren og laste inn fildesignet.
  3. Fremstilling av bioprinting sprøyten
    1. Overfør den astrocytter-ladede gelatin/GelMA/fibrinogenbioinken til en 5 ml plastsprøyte ved hjelp av en 1000 μL pipette.
      MERK: Overfør sakte for å unngå bobledannelse.
    2. Koble en steril 22 G stump kanyle til sprøyten.
      MERK: La sprøyten ligge på 4 °C i 2 minutter.
    3. Koble sprøyten til bioprinterhodet og skyll bioink manuelt for å fjerne de resterende boblene.
  4. Bioprinting
    MERK: Bioprintingen ble utført utenfor laminær hetten.
    1. Legg en 35 mm kulturrett på bioprinterbordet og plasser nålen 0,1 mm fra kulturfatoverflaten for å tillate bevegelse av nålen.
      MERK: Bruk én 35 mm kulturrett til hver bioprinting.
    2. Trykk skriv ut-knappen.
    3. Når bioprintingen er over, må du sørge for at sprøyten beveger seg bort fra fatet. Lukk deretter kulturretten og forbered deg på krysskoblingsprosessen.
      MERK: Bioprintingen av en konstruksjon tar ca. 1 min og 10 s.
  5. Krysskobling av biotrykket konstruksjon og kultur
    1. Plasser kulturretten under UV-lys ved 2 mW/cm2 i 2 x 60 s (opp og ned) for GelMA-krysskobling.
    2. Under laminærstrømmen overfører du den biotrykte konstruksjonen til en 24-brønnsplate ved hjelp av en steril spatel.
    3. Tilsett 500 μL trombin/CaCl2-oppløsning og la den stå i 30 minutter for å tillate fibrin krysskobling.
    4. Fjern krysskoblingsløsningen og vask konstruksjonen med 2 ml PBS 1x. Deretter erstatter du PBS med 1 ml astrocytter kulturmedium og inkuberer ved 37 °C og 5 % CO2. Bytt medium hver tredje dag.

7. Vurdering av astrocytter levedyktighet

  1. Levedyktighet av bioprinted astrocytter
    1. Overfør den biotrykte konstruksjonen til en 35 mm kulturrett ved hjelp av en slikkepott.
    2. Vask konstruksjonen med 1 ml 1x PBS.
    3. Deponer 100 μL av Live/Dead-reagenset over konstruksjonen og hold det ved 37 °C i 30 minutter, og hold det beskyttet mot lys.
    4. Fjern Live/Dead-reagenset og vask konstruksjonen med 1 ml 1x PBS.
    5. Overfør prøven til en konfokal tallerken ved hjelp av en slikkepott, og observer cellene i konstruksjonen under et konfokalt mikroskop ved hjelp av 488 og 570 nm eksitasjon for bildeoppkjøp.
      MERK: Bruk en forstørrelse på 10x for en generell visualisering av cellene i konstruksjonen.
    6. Kontroller at prøven sitter flatt. Om nødvendig, plasser en deksle over prøven for å øke flatheten.
      MERK: Under avbildningen må du sørge for at den konfektfatet er godt forseglet for å hindre at prøven tørker ut.
    7. Beregn antall levedyktige (grønne) og døde (røde) ved hjelp av en beregningsprogramvare.
  2. Levedyktighet av 2D astrocytter kultur
    1. Frø 0,5 x 106 astrocytter (passasje 1-3) i en 35 mm konfokal tallerken, tilsett astrocytter medium og inkuber dem ved 37 °C og 5 % CO2.
    2. Når cellene er sammenfølende, fjern kulturmediet og vask med 1 ml 1x PBS.
    3. Deponer 200 μL av Live/Dead-reagenset, og hold retten ved 37 °C i 30 minutter, beskyttet mot lys.
    4. Fjern Live/Dead-reagenset og vask cellene med 1 ml 1x PBS.
    5. Ta retten til et konfokalt mikroskop kombinert med et digitalt kamera, og bruk 488 og 570 nm eksitasjon for bildeinnkjøp.
    6. Beregn antall levedyktige (grønne) og døde (røde) ved hjelp av en beregningsprogramvare.

8. Immunostaining av astrocytter

  1. Glial fibrillary surt protein (GFAP) farging av 3D bioprinted astrocytter
    MERK: For å undersøke tilstedeværelsen av andre cellemarkører, endre det primære antistoffet tilsvarende.
    1. Fjern mediet fra brønnen og vask konstruksjonen med 1 ml 3x PBS.
    2. Tilsett 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS til brønnen til konstruksjonen er helt dekket og la den stå i 2 timer ved 4 °C.
    3. Fjern PFA og vask konstruksjonen med 1 ml 3x PBS.
      MERK: Denne prosedyren kan settes på pause i flere måneder hvis den oppbevares ved 4 °C i PBS. Pass på at brønnplaten er forseglet for å unngå PBS-fordampning.
    4. Behandle prøven med glycin 0,1 mol/l i 5 min.
    5. Vask med 1 ml 1x PBS i 5 min.
    6. Permeabiliser prøven med PBS som inneholder 0,1 % Triton X-100 og 10 % FBS i 1 time ved 25 °C under orbital agitasjon.
    7. Inkuber konstruksjonen med kylling anti-GFAP (primær antistofffortynning 1:500) ved 4 °C over natten.
    8. Aspirer det primære antistoffet og vask prøven med 1 ml PBS i 5 min, 3 ganger.
      MERK: Primær antistoff kan brukes på nytt flere ganger når det oppbevares ved 4 °C.
    9. Inkuber prøven med Alexa fluor 488-konjugert antikylling (sekundær antistofffortynning 1:500) og 1 μg/ml DAPI i 1 time ved 25 °C under orbital agitasjon.
      MERK: Hold prøven beskyttet mot lys.
    10. Vask prøven med 1 ml PBS i 5 min, 3 ganger.
    11. Overfør konstruksjonen til en 35 mm konfokal tallerken.
      MERK: Pass på at retten er godt forseglet for å hindre at prøven tørker ut.
  2. Glial fibrillary surt protein (GFAP) farging av 2D astrocytter kultur
    1. Frø 0,5 x 106 astrocytter (passasje 1-3) i en 35 mm konfokal tallerken, tilsett astrocytter medium og inkuber dem ved 37 °C og 5 % CO2.
    2. Når cellene er sammenfølende, fjern kulturmediet og vask dem med 1 ml 1x PBS.
    3. Gjenta trinn 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrocytter cytoskjelett farging
    1. Gjenta trinn 8.1.1-8.1.6.
    2. Tilsett 200 μL 50 μg/ml fluorescerende konjugert falloidinoppløsning i PBS og 1 μg/ml DAPI over konstruksjonen.
    3. Inkuber i 1 time ved 25 °C under orbital agitasjon, og hold prøven beskyttet mot lys.
    4. Vask prøven med 1 ml PBS i 5 min 3 ganger , og overfør konstruksjonen til en konfokal tallerken ved hjelp av en slikkepott.
      MERK: Pass på at retten er godt forseglet for å hindre at prøven tørker ut.

9. Konfekt bildebehandling

  1. Ta oppvasken til et konfokalt mikroskop kombinert med et digitalt kamera for bildebehandling (359, 488 og 570 nm eksitasjon).
  2. Bruk forstørrelse på 10x for en generell visualisering og 40 eller 63x for zoomede bilder av celler.
    MERK: Kontroller at prøven sitter flatt. Om nødvendig, plasser en deksle over prøven for å øke flatheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette arbeidet hadde som mål å utvikle et nevralt lignende vev ved hjelp av 3D-bioprintingsteknologien for å deponere lag for lag primær astrocytter-ladet gelatin / GelMA / fibrinogen bioink. Astrocytter ble ekstrahert og isolert fra hjernebarken til muspupper (figur 1), lagt til en biomaterialesammensetning, slik at biofabrikasjonen av en levende 3D-konstruksjon.

Den datamaskinassisterte designen (CAD) ble utviklet ved hjelp av G-koden (Supplemental file) som en sammenkoblet ramme av firkantet form (0,6 x 0,6 mm), med porer på 1 mm, med sikte på å lette diffusjonen av næringsstoffer og oksygen. Delbildet bestod av 6 lag plassert oppå hverandre, og endret seg i en vinkel på 90° i hvert lag (Figur 2A i). Den designede strukturen hadde ca. 5 mm høy (figur 2A ii), slik at vevsmanipulering kunne manipuleres. Bioinksammensetningen tillot også fabrikasjon av konstruksjoner av forskjellige former (Figur 2B).

Utarbeidelsen av bioink sammensatt av gelatin, GelMA og fibrinogen besto av to krysskoblingstrinn. For det første ble GelMA krysskoblet under UV-lys, hvor inter og intramolekylære kovalente bindinger dannes, etterfulgt av fibrin krysskobling. I dette trinnet cleaves trombin enzymatisk fibrinogenkjeder, noe som resulterer i dannelse av fibrinfibre17, en reaksjon stabilisert av Ca2 + ioner18. Deretter danner GelMA og fibrinfibre et stabilt interpenetrert polymernettverk (IPN) supplert med laminin, egnet støtte for cellevedlegg og spredning19,20 (Figur 2C).

Før bioprinting, etter 12 dager med isolasjon, ble astrocytter preget av tilstedeværelsen av GFAP, en proteinbestanddel av astrocytt mellomliggende filamenter4 (Figur 3A). Deretter ble trypsiniserte astrocytter blandet med gelatin/GelMA/fibrinogenoppløsningen med en tetthet på 1 x 106 celler/ml, noe som genererer en astrocytter-ladet bioink. Bioink ble overført til en 5 ml sprøyte koblet til en 22 G stump nål, og komponerte bioprinterhodet (Figur 3B i). Nålen tillot bioink ekstrudering uten tilstopping og forhindrer høy skjærspenning til cellene.

På grunn av de viskoelastiske egenskapene til gelatin, som oppfører seg som væske ved høyere temperaturer og som en gel ved lavere temperaturer21, beholdt den biotrykte konstruksjonen formgjengivelse (Figur 3B ii). Etter bioprinting av to påfølgende lag med bioink ble dannelsen av en veldefinert struktur observert (Figur 3C), med celler fanget i biomaterialet.

Etter bioprinting og krysskoblingsprosesser ble konstruksjonen inkubert med astrocyttmedium, og etter 1 dag med bioprinting presenterte de fleste cellene fortsatt en rund morfologi (Figur 3D). Bioprinted stillas opprettholdt integritet etter 7 dager med inkubasjon, og selv om noen runde celler ble observert, spredte et stort antall astrocytter seg gjennom hele konstruksjonen, og presenterte astrocytisk morfologi og sammenkobling (Figur 3E).

Fordi parametrene for bioprinting, for eksempel hastighet, direkte kan påvirke celle levedyktighet, ble forskjellige bioprintinghastigheter (400, 600 og 800 mm / min) testet og astrocytter overlevelse evaluert ved hjelp av Live / Dead-analysen med calcein-AM (levende celler, grønn fluorescens) og ethidium homodimer-III (EthD-II) (døde celler, rød fluorescens). Prosentandelen av levedyktige celler ble kvantifisert ved hjelp av en beregningsprogramvare, ved å beregne antall levende og døde celler. Celle levedyktighet ble evaluert på tidspunktet 0 (rett etter bioprinting), og resultatene viste at med lavere hastighet, 400 mm/min, levedyktige celler representerte 74,08 % ± 1,33 % av de totale cellene, og var signifikant høyere enn celler som ble biotrykt ved henholdsvis 600 og 800 mm/min (60,25 % ± 1,93 % og 62,94 ± 6,18 %) (figur 4A). Derfor ble hastigheten på 400 mm / min brukt i dette arbeidet.

Før bioprinting ble 2D-dyrkede astrocytter karakterisert som prosentandelen levedyktige celler, og levedyktigheten til bioprintede astrocytter ble normalisert til denne tilstanden. Resultatene viste at 2D-kulturen presenterte 90,98 % ± 0,94 % av levedyktige celler. Levedyktigheten til biotrykte astrocytter (dag 7) var 83,54 % ± 3,00 %, noe som representerer 0,92 ± 0,03 av 2D-verdien, som var betydelig høyere enn dag 0 (0,81 ± 0,01) (figur 4B). Bilder av astrocytter farget med levende/død reagens presenteres i figur 4C, og viser at cellene etter biotrykk hadde en rund morfologi (Figur 4C i). Etter 1 uke med inkubasjon spredte astrocytter seg over hele konstruksjonen (Figur 4C ii), som viser en distinkt morfologi av celler fra 2D-kultur ( Figur4C iii).

Bioprinted astrocytter ble farget for å vise celletetthet og cellemorfologi i konstruksjonen. Figur 5A viser en bioprintet konstruksjon etter 7 dager med inkubasjon, med høy tetthet av astrocytter farget med falloidin, et F-aktin cytoskjelettfargestoff. Selv om få runde celler ble observert, presenterte astrocytter hovedsakelig en stjernelignende morfologi. Bioprinted astrocytter viste seg å være GFAP-positive når de ble farget etter 7 dager med bioprinting, noe som indikerer at cellene opprettholdt sin astrocytiske fenotype (Figur 5B i). Figur 5B ii og 5B iii viser Z-stablede bilder av de biotrykte GFAP+-astrocyttene i konstruksjonen. Disse resultatene indikerer at bioinksammensetningen ga et biokompatibelt mikromiljø for å fremme astrocytters vedheft, spredning og vekst.

Figure 1
Figur 1: Ekstraksjon av hjerne- og cortex-separasjon for primær astrocytterkultur. Primære astrocytter ble isolert fra cortex av C57Bl/6 mus valper (postnatal dag 1) hjerne. Etter å ha hentet hjernen fra dyret, ble meningene fjernet under et mikroskop, og cortex separert etterfulgt av vevs fordøyelse og astrocytter kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av 3D bioprinting prosess. (A) CAD-fil designet for 3D-bioprinting av nevralt vev som viser (i) 2 lag, toppvisning og (ii) 6 lag, sidevisning, av konstruksjonen. (B) Bilder som viser bioinkens kapasitet til å skrive ut strukturer av forskjellige former (i) kvadrat, (ii) kapillær og (iii) stjerne. (C) Ordning av biomaterialer krysskobling etter 3D bioprinting viser, hvor GelMA er krysskoblet under UV-lys etterfulgt av fibrin krysskobling i en trombin: Ca2 + bad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: 3D-boprinting av astrocytter-ladet gelatin/GelMA/fibrinogenbioink. (A) Karakterisering av astrocytter etter 12 dager med isolasjon og kultur, farget for GFAP, grønn og DAPI, blå. (B) (i) Oppsett av skrivehode og (ii) 3D bioprintet konstruksjon rett etter bioprinting. (B) Tolags konstruksjon som viser det biotrykte delbildet. Forstørrelse av 4x. (C) Bilde av bioprinted astrocytter 1 dag etter bioprinting, viser celler i en rund morfologi. (D) Bilde av bioprinted astrocytter 7 dager etter bioprinting prosessen, viser celler med astrocytisk morfologi med få runde celler, noe som indikerer deres affinitet med mimetisk vev. Forstørrelse av 10x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vurdering av biotrykt astrocytters levedyktighet. (A) Levedyktighet av astrocytter bioprinted ved forskjellige hastigheter. (B) Levedyktigheten av biotrykte astrocytter på (i) dag 0 (rett etter bioprinting) og (ii) etter 7 dager med bioprinting, normalisert til levedyktighet av astrocytter i 2D-kultur. Statistisk analyse ved hjelp av Enveis Anova med Tukeys test, n = 3, *p < 0,05. (C) Fluorescerende bilder av astrocytter farget med Live /Dead reagens. Bioprinted astrocytter på (i) dag 0 (rett etter bioprinting), (ii) dag 7, og (iii) 2D-kultur av astrocytter. Forstørrelse av 10x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering av 3D bioprinted astrocytter. Immunfluorescens av 3D bioprinted astrocytter etter 7 dager med inkubasjon farget for (A) F-aktin (falloidin, rød) og kjerner (DAPI, blå) med forstørrelse på 10x og 40x og for (B) GFAP, grønn (i) med forstørrelse på 10x, (ii) Z-stablet som viser X-Y-Z-aksen til den biotrykte konstruksjonen, og (iii) bilde som viser X-Z-aksen til GFAP + astrocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D bioprinting-teknologien har dukket opp som et biofabrikasjonsalternativ som gjør det mulig å konstruere raffinerte konstruksjoner som strukturelt og fysiologisk ligner innfødt vev22, inkludert hjernen23. Biofabrikasjonen av nevrallignende vev gir mulighet for in vitro innfødt mikromiljøet modellering, som er et viktig verktøy for å forstå de cellulære og molekylære mekanismene forbundet med utvikling og behandling av mange sykdommer som påvirker CNS11. På grunn av glialcellenes viktige rolle i nevral funksjonalitet har kortikale astrocytter blitt brukt i mange studier, for eksempel hjerneutvikling24, biomolekyler transport25, neurite utvekst26, og i hjernelignende vev biofabrication14.

Metoder for ingeniørarbeid av 3D-kultur av astrocytter ble rapportert tidligere, ved hjelp av forskjellige biomaterialer og stillasteknikker27,28,29. På samme måte ble det også rapportert en metode for 3D-bioprinting av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer)-avledede nevrale aggregater, og viste kapasiteten til disse bioprintede cellene til å skille og modne in vitro30. Det er imidlertid ingen rapporter om metoder for biofabrikasjon av 3D-brioprinted astrocytter konstruksjoner i litteraturen. Deretter tok denne protokollen sikte på å beskrive en reproduserbar metode for 3D bioprinting kortikale astrocytter.

I denne protokollen ble astrocytter isolert fra hjerne kortikalene til C57Bl / 6 mus valper, en dyremodell mye brukt i forskning31,32, som kan erstattes av astrocytter avledet fra andre kilder, for eksempel hiPSCer og ryggmarg. Etter isolasjon, kultur og subkultur forblir astrocytter i en proliferativ tilstand opp til passasje 3, som er det maksimale antallet splitting som anbefales på grunn av deres iboende begrensning av spredning8. Det ble bekreftet at spredning av astrocytter fra passasje 4 var begrenset, og var vanskelig å oppnå ønsket mengde celler for 3D-bioprinting.

I den beskrevne metoden ble det brukt en konsentrasjon på 1,0 x 106 celler/ml biomaterialeoppløsning, som et konseptbevis for å evaluere cellenes kapasitet til å overleve bioprintingsprosessen og for å opprettholde deres levedyktighet og iboende egenskaper under kultur i hydrogelen. I det forrige arbeidet ble et 3D bioprinted nevrallignende vev biofabrikkert av kokulturerende astrocytter og nevroner, og for å øke cellulær interaksjon var astrocytter konsentrasjonen 8,0 x 106 celler / ml14. Deretter kan konsentrasjonen av celler optimaliseres for spesifikke studier.

En bioink for 3D bioprinting består av celler og en biomateriale eller en kombinasjon av biomaterialer33. I denne protokollen ble det brukt en kombinasjon av gelatin/GelMA/fibrinogen, som viste seg å være gunstig for både bioprinting og vedlikehold av astrocytter i kulturen. Produksjonen av en biotrykkbar bioink er utfordrende ved bruk av ekstruderingsbasert bioprintingsteknikk. Den biomaterialeriale sammensetningen må ha viskoelastiske egenskaper som samtidig tillater ekstrudering av bioink, samtidig som 3D-formen beholdes etter utskriftsprosessen34. I tillegg bør det være i stand til å opprettholde celle levedyktighet under prosessen, som avhengig av bioprinting forhold, kan forårsake skjær stress til cellene som fører til døden35.

Bioprintability ble sikret av gelatin, en biomateriale som har optimale viskoelastiske egenskaper på grunn av sin sol-gel overgangskapasitet36. Dette gjør det mulig for gelatinmakromolekyler å omorganisere og oppføre seg som væske under ekstrudering, og som en gel etter bioprinting, opprettholde 3D-strukturen. I tillegg, som en kollagenavledning, består gelatin av glycin-aminosyrepeptid trilling repetisjoner, noe som sikrer cellespesifisitet21. Imidlertid er intra- og intermolekylære bindinger av gelatin svake, og på grunn av termoreverbarheten har gelatin ingen stabilitet ved 37 °C, og frigjøres fra konstruksjonen under cellekulturen. Derfor ble GelMA et alternativ som en stabil hydrogel, på grunn av de kovalente bindingene dannet etter UV-lysutstilling, opprettholder cellespesifikk egenskaper19. De fysiske egenskapene til GelMA, for eksempel porøsitet, nedbrytning og elastisk modulus, kan justeres for å passe til forskjellige vevsteknikkapplikasjoner19. Stivheten til GelMA stillaser kan styres ved å variere methacryloyl substitusjon37, slik at man kan oppnå en stivhet som ligner på vevet som skal modelleres. Det vil seg ved å redusere graden av funksjonalisering, kan en lavere stivhet oppnås37. Derfor, på grunn av mykheten i musehjernen38,39 og den direkte effekten av ekstracellulær matrise (ECM) stivhet på celleadferd40, i denne protokollen ble det foreslått en lav grad av gelatinfunksjonalisering. I de tidligere verkene ble gelmahydrgelenes evne til å etterligne CNS fysiske egenskaper, som viser høy egnethet for dyrking av astrocytter, nevroner og nevrale stamceller14,41,42 rapportert.

Foruten GelMA, fibrinogen, en innfødt biopolymer som danner fibrinfibre gjennom enzymatisk reaksjon, har også blitt mye brukt til biofabricate nevralt-lignende vev, viser høy spesifisitet og tilbyr et passende mikromiljø for nevrale celler å feste og vokse30,43,44. Andre biomaterialer, som alginat og chitosan, har blitt brukt til å biotrykke nevrallignende vev, blandet til gelatin, GelMA og/eller fibrinogen, med sikte på å forbedre utskriftsevnen og de fysiske egenskapene til 3D-stillasene14,30. I den nåværende metoden ble det oppnådd en optimal bioprintabilitet, fysisk stabilitet og cellespesifikkitet ved hjelp av gelatin, GelMA og fibrinogen som komponenter i bioink. For å øke astrocyttenes anerkjennelse til mikromiljøet, ble laminin-en komponent i hjernen ECM-ble brukt til å supplere bioink.

I denne protokollen ble gelatin brukt i en konsentrasjon på 4% (w / v), noe som tillot sol-gel-overgangen til bioink ved 25 °C innen ca. 10 minutter. En raskere gelasjon kan oppnås ved å øke konsentrasjonen av gelatin. Sterilisering ved filtrering ved hjelp av 0,2 μm filter kan imidlertid bli kompromittert. Bioinkfiltrering er et kritisk skritt, og bekrefter at høyere konsentrasjoner av gelatin (>5% m / v) kan forhindre filtrering. Et alternativ for å oppnå et raskere geleringspunkt under bioprinting er å la sprøyten som inneholder bioink ved 4 °C i 2 minutter før du kobler den til bioprinterhodet. Etter bioprinting er det avgjørende å opprettholde konstruksjonen ved 25 °C for å unngå å destabilisere 3D-strukturen og opprettholde en gelled tilstand før UV-utstillinger. Spesielt bør konstruksjonen være solid når fibrinogen crosslinker-løsningen legges til platen. For GelMA-krysskobling er det viktig å vende prøven (2 x 60 s hver side) for å sikre UV-utstillinger gjennom hele konstruksjonen. For fibrinogen krysskobling, bør crosslinker-løsningen dekke konstruksjonen helt. Derfor, hvis du bruker en større tallerken eller plate, bør volumet justeres. Etter krysskobling skal hydrogelen se homogen ut under fasekontrastmikroskopi, og cellene skal være homogent fordelt gjennom hele konstruksjonen, med en rund morfologi.

Denne protokollen tillot gelatin / GelMA / fibrinogen bioink å skrive ut strukturer av forskjellige former, opprettholde integriteten og 3D-formen på konstruksjonene. På grunn av temperaturbegrensningene for å nå 25 °C inne i laminærstrømmen, ble bioprintingen utført i kulturrommet utenfor laminærstrømmen. Bioprintingstiden var ca. 1 min for hver prøve, og det ble ikke observert forurensning under cellekulturen.

Celleintegritet kan påvirkes av bioprinting, på grunn av skjærspenningen forårsaket i prosessen35. Dette kan kontrolleres ved å optimalisere utskriftsparametere, for eksempel utskriftshastighet. I dette arbeidet ble forskjellige bioprinthastigheter testet, 400, 600 og 800 mm / min, og observerte en betydelig reduksjon i celle levedyktighet når hastigheten ble økt fra 400 til 600 mm / min. Ved 400 mm/min forble rundt 74% av cellene levedyktige etter bioprinting, og denne verdien økte betydelig etter 7 dager med inkubasjon (>80%). Derfor ble lavere hastigheter ikke brukt for å unngå overdreven utstilling av celler til miljøet. Astrocyttenes 2D-kultur viste høyere levedyktighet (~90 %) sammenlignet med de biotrykte cellene. Men som vist av fluorescerende bilder, påvirkes morfologi av typen kultur. Mens 2D-celler var flate, hadde astrocytter i 3D-miljø en stjernelignende form, sammenkoblet med hverandre ved cellulære prosesser.

Spesielt var det mimetiske mikromiljøet gunstig for kortikale astrocytter kultur, da celle levedyktigheten økte betydelig etter 1 uke, noe som tyder på celleproliferasjon i konstruksjonen. Laminin, et glykoprotein tilstede i hjernen ECM, ble lagt til bioink med sikte på å oppnå en høyere overholdelse av astrocyttene tilhydrogelen 14. Cytoskeleton F-aktinfarging viste at biotrykte astrocytter var i høy tetthet i konstruksjonen, noe som indikerer at cellekonsentrasjonen som brukes i denne protokollen tillot astrocytter sammenkobling. Immunohistokjemi for GFAP lokalisering, en markør korrelert med astrocytter omfattende arborisering og celle hypertrofi45, bekreftet av F-aktin farging, viste at celler presenterte typisk astrocytisk morfologi, noe som indikerer at det mimetiske 3D-systemet var gunstig for celler å feste og oppføre seg som i sitt opprinnelige miljø.

Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv og reproduserbar prosedyre for 3D bioprinting kortikale astrocytter. På grunn av betydningen av astrocytter i nevroinflammasjonsrespons på skade, samt i regulering av nevronfunksjonalitet, kan studier som involverer denne glialcellen bidra til mange aspekter i forståelsen av sykdommer som påvirker CNS. Derfor er 3D-in vitro-modellen som presenteres her nyttig i fremtidige applikasjoner som tar sikte på å studere astrocytt-nevroninteraksjoner, funksjonaliteten til astrocytter i hjernepatologier og potensialet til astrocytter som terapeutiske mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av The São Paulo Research Foundation (FAPESP), tilskuddsnummer 2018/23039-3 og 2018/12605-8; Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq), tilskuddstall 465656/2014-5 og 309679/2018-4; koordinering for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES), finanskode 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

Bioengineering Utgave 173 astrocytter 3D bioprinting biofabrikasjon vevsteknikk nevralt vev sentralnervesystemet
3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Lignende Vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter