Summary
Aqui apresentamos o ensaio de liberação do mediador, usando uma linha celular de leucemia basofílica de rato transfeminada com o receptor IgE humano, para simular a desgranulação de células efeitos tipicamente observadas em reações alérgicas tipo 1. Este método investiga a atividade biológica dos alérgenos de forma altamente sensível, reprodutível e adaptável.
Abstract
Ensaios de liberação de mediadores analisam a degranulação mediada por iglu e secreção mediada por mediadores por células de efeito, como células de mastro e basófilos, após estimulação com diluições seriais de alergênicos putativos. Portanto, esses ensaios representam uma ferramenta essencial que imita o processo de degranulação in vivo, que ocorre após exposição a alérgenos em pacientes sensibilizados ou em testes de picada de pele. Além disso, esses ensaios são geralmente empregados para investigar o potencial alergênico das proteínas e a reatividade da reatividade do sera dos pacientes. Aqui, descrevemos um simples protocolo de 2 dias usando uma linha celular de leucemia basófila de rato imortalizada transfecida e humanizada com o receptor humano de alta afinidade IgE plasma-membrana (FcεRI). Esta variante do ensaio de liberação do mediador é um sistema robusto, sensível e reprodutível em células in vitro sem a necessidade de imobilizar o antígeno em matrizes sólidas. O protocolo consiste nas seguintes etapas: (1) complementar a inativação do soro humano, (2) colheita, semeadura e sensibilização passiva das células, (3) estimulação com antígeno para causar liberação de mediadores, e (4) medição da atividade β-hexosaminidase como substituto para os mediadores inflamatórios liberados, como histamina. O ensaio representa uma ferramenta útil para avaliar a capacidade da ligação transversal alérgeno-IgE para desencadear a degranulação celular e pode ser implementada para padronizar extratos de alergênicos, comparar a reatividade dos pacientes com alérgenos menores ou grandes e a extratos alergênicos (pólen, casulo de gato, etc.), para investigar a potência dos homólogos alérgenos, isoformes e variantes do fold (por exemplo, hipoalergenicidade), bem como os efeitos dos ligantes sobre a atividade alergênica. Uma aplicação mais recente inclui o uso do ensaio para monitorar a eficácia do tratamento no curso da imunoterapia alergênico.
Introduction
As reações de hipersensibilidade tipo I, caracterizadas pela produção de Imunoglobulina E (IgE) específica para um respectivo antígeno, afetam quase um terço da população mundial. Essas reações estão associadas a diversas manifestações alérgicas, como asma e rinoconjuntivite, podendo até levar a reações sistêmicas de risco de vida1. Ao contrário dos testes in vivo, abordagens imunoquímicas, como o ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA), são apenas adequadas para investigar a ligação alvo de anticorpos, mas não abordam o aspecto funcional das proteínas que podem causar reações de hipersensibilidade imediatas. A imobilização dos alérgenos em suportes sólidos (por exemplo, placas ELISA) pode causar alterações em sua integridade estrutural e na destruição de epítopos relevantes para alergia2. Mesmo os testes de picada de pele (SPT), a ferramenta mais comum para confirmar a sensibilização contra certos alérgenos, têm seus limites relativos à detecção de alergia alimentar mediada pelo IgE sintomático ou disponibilidade de alérgenos3,4. A fim de encontrar um método ético, altamente específico, sensível e econômico para testar a potência biológica dos alérgenos para causar uma reação de hipersensibilidade tipo I, os chamados ensaios de liberação de mediadores foram estabelecidos.
O princípio desses ensaios baseia-se em eventos que seguem a fase de sensibilização e a capacidade de acompanhamento do IgE de se ligar à cadeia α dos receptores de alta afinidade expressos na superfície das células efeitos, como células de mastro e basófilos. O IgE é produzido principalmente por células plasmáticas no tecido linfoide associado à mucosa. Embora seja a imunoglobulina menos abundante (cerca de 0,05% em indivíduos não atópicos) no sangue, possui uma atividade biológica extraordinariamente alta sendo a principal causa para sintomas alérgicos. A meia-vida do IgE pode aumentar de 2-3 dias para várias semanas e até mesmo meses quando ligados a seus receptores em células efeitos. A subsequente ligação de um antígeno à região variável de duas moléculas de IgE ligadas ao receptor leva à sua ligação cruzada seguida pela indução de uma cascata de sinalização a jusante na célula efeitora que leva à desgranulação e a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios causando vasodilatação, como histamina, proteases serinas (por exemplo, tryptase), e protaglandinas5,6. A secreção de citocinas como interleucina 4 (IL-4) e IL-13 são responsáveis pela manutenção da resposta inflamatória do auxiliar T 2 (Th2) e pela mudança de classe das células B para células plasmáticas produtoras de IgE5,8,9. Por outro lado, o tromboxano liberado causa broncoconstrição, e os leucoltrienos estimulam a contração muscular lisa, bem como o vazamento vascular, e desempenham um papel crucial na inflamação das vias aéreas levando à asma ou rinite alérgica10,11.
Foram estabelecidas ferramentas de pesquisa para analisar a maioria dos mediadores acima mencionados, embora com algumas grandes desvantagens. Ensaios de tryptase são abordagens clínicas adequadas para a medição de anafilaxia sistêmica através da ativação de células de mastro, mas sua sensibilidade e especificidade em diagnósticos de alergia é muito imprecisa em comparação com métodos padrão-ouro, como o SPT. Por outro lado, os ensaios de leucotrieno cisteína não são capazes de diagnosticar alergias a β-lactams ou anti-inflamatórios não esteroides12. Protocolos para a medição da histamina como um grande mediador liberado em reações alérgicas já foram estabelecidos na década de 1960. Uma vez liberada no sangue periférico, a histamina é imediatamente degradada por metilatransferases de histamina resultando em uma meia-vida plasmática de apenas alguns minutos, tornando sua análise bastante desafiadora13. Além de sua instabilidade, o monitoramento da histamina mostrou-se ter baixa especificidade e sensibilidade para alergias medicamentosas, bem como proteínas alimentares comerciais e venenosde vespas 12.
Modelos in vitro com linhas celulares efeitosas têm sido introduzidos como uma alternativa aos procedimentos intensivos de isolamento e cultivo de basófilos de pacientes alérgicos para realizar ensaios de liberação. Portanto, foi estabelecido o ensaio baseado em leucemia basofílica de rato (RBL-) utilizando a linha celular RBL-2H3. Uma vez que esta linha celular não é capaz de ligar igE humano, foi pela primeira vez transfeinada com a cadeia de α, β-, e γ-cadeia do receptor humano de membrana plasmática IgE (FcεRI). Vários clones foram gerados e testados para níveis de expressão e homogeneidade da cadeia de α humana, dos quais o clone RBL-30/25 emergiu como o candidato mais promissor para testes in vitro. A cascata de sinalização induzida pela ativação do receptor do clone transfectado foi testada através de ensaios de mobilização de cálcio. Como indicador de desgranulação e substituto para liberação de histamina, a enzima lysosômica β-hexosaminidase foi medida, o que tem a vantagem significativa da maior estabilidade14. A liberação do mediador utilizando células RBL-30/25 chega a até 100% e é, portanto, usada para testar soro derivado de pacientes alérgicos. O ensaio foi testado para a liberação do mediador após desafiar células sensibilizadas com extratos comerciais de alergênicos. Isso levou à constatação de que há uma enorme variação na composição (de até 60 vezes em relação ao teor total de proteínas) de extratos de alergênicos derivados de diferentes fabricantes e utilizados para abordagens diagnósticas (por exemplo, SPT) ou abordagens terapêuticas3,15,16.
Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do protocolo RBL para realizar o ensaio de liberação do mediador usando soro de doadores alérgicos. Durante a sensibilização passiva, o IgE no soro é capturado pelo receptor FcεR1 de alta afinidade expresso na superfície das células basofílicas. Após a estimulação do antígeno, IgEs ligados específicos para o antígeno são interligadas, desencadeando desgranulação celular e liberação do mediador β-hexosaminidase. A atividade de β-hexosaminidase é posteriormente medida usando um substrato adequado. Para o ensaio, foram utilizadas células huRBL-2H3 e denominadas huRBL no protocolo a seguir. O protocolo descreve uma série padrão de diluição de antígeno com 8 passos diluídos 1:10 variando de 1 μg/mL a 0,1 pg/mL de alergênico.
Protocol
A aprovação ética para o uso de soro derivado de pacientes alérgicos de pólen de bétula foi obtida do comitê ético holandês (número de aprovação: NL65758.018.18).
1. Procedimentos de segurança
- Trabalhe em condições estéreis usando uma bancada de segurança biológica classe 2 durante o primeiro dia do experimento (Biossegurança Nível 2). Siga as diretrizes de segurança da instituição para o uso de soro humano.
2. Complementar a inativação do sera humano
- Colher uma cultura densa de células P3X63Ag8.653 (denominadas células Ag8 a partir de agora), a partir do frasco de cultura celular e transferi-las para um tubo de centrifugação.
- Use o seguinte meio de cultura para estas células: Meio Essencial Mínimo das Águias Modificadas com concentração de soro reduzido, penicilina-estreptomicina de 1% (100 unidades Pen., 0,1 mg/mL Strep.), 5% de bezerro fetal inativado térmico/soro bovino (FCSi).
- Centrífuga células Ag8 por 5 min a 250 x g em temperatura ambiente.
- Suspenda a pelota celular para uma concentração final de aproximadamente 1 x 106 células/mL no meio huRBL (Águia Média Essencial Mínima com Modificação Alfa, 4 mM L-Glutamine, 5% FCSi, 1% G418 (100% estoque: 10 g/125 mL dH2O).
NOTA: Mantenha as células Ag8 passando para uso futuro também. - Diluir sera humana 1:10 em suspensão de células Ag8. A diluição final do soro no ensaio será 1:20.
NOTA: Para sera com IgE específico baixo pode ser usado 1:5 (diluição final 1:10). - Incubar por 1h a 37 °C e 5%-7% CO2.
3. Colheita e semeadura de células huRBL
- Aspire o meio de um frasco de cultura celular T-75 cuidadosamente sem tocar nas células huRBL (as células huRBL são aderentes). Certifique-se de que as células estão em torno de 50%-90% confluentes.
NOTA: Dependendo da confluência celular, o conteúdo celular de um frasco de cultura celular T-75 denso é geralmente suficiente para uma a duas placas de 96 poços. - Lave as células duas vezes adicionando 10 mL da solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicione DPBS ao lado oposto do frasco e não diretamente nas células.
- Aspirar DPBS e adicionar 5 mL de trippsina pré-aquecida EDTA (0,05%/0,02% EDTA diluída em DPBS) para descolamento celular.
- Incubar o frasco por 5 min a 37 °C.
- Desprender células tocando cuidadosamente o frasco.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 mL e encha com meio huRBL ou DPBS para diluir a trippsina-EDTA.
- Centrifugar as células a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire o supernasce e resuspenda a pelota em 5 mL de meio huRBL para contagem celular.
- Conte as células e dilui-as no meio huRBL para obter uma concentração final de 2 x 106 células/mL.
- Use uma placa estéril de 96 poços e adicione 50 μL de suspensão celular huRBL por poço, o que equivale a 1 x 105 células/bem.
4. Sensibilização passiva das células huRBL
- Centrifugar a suspensão Ag8/soro pré-incubada por 5 min a 250 x g.
- Transfira 50 μL da suspensão Ag8/soro centrifuada para cada poço contendo células huRBL sem perturbar a pelota da célula Ag8.
- Inclua o controle de antígeno, que são sensibilizados, mas células não estimuladas (não adicionam antígeno), servindo como uma indicação para o platô/fundo do sinal inferior. Os poços de controle de origem e máxima de lise não precisam ser sensibilizados com soro. Adicione 50 μL de meio huRBL para controlar poços.
- Cubra a placa com a tampa e incubar durante a noite a 37 °C e 5%-7% DE CO2.
5. Degranulação estimulada por antígeno e liberação de mediador
- Prepare a diluição de antígeno no tampão de 1x Tyrode (9,5 g/L Tyrode,00% de gsina de soro bovino (BSA), 0,5 g/L Carbonato de hidrogênio de sódio (NaHCO3) em dH2O) com antecedência. É necessário um valor final de 100 μL por poço.
NOTA: Nem todos os alérgenos, purificados de fontes naturais ou recombinantes produzidos, podem estar estáveis no tampão de 1x Tyrode. Portanto, realize testes de estabilidade no buffer de 1x Tyrode antes do procedimento de ensaio. Alternativamente, diluir o tampão de 1x Tyrode em óxido de deutério (D2O) para aumentar a relação sinal-ruído do ensaio. - Faça 8 diluições do antígeno de interesse de uma série de diluição de 1:10 em tubos de reação começando com 10 ou 1 μg/mL de proteína.
NOTA: Teste sempre a série de diluição com antecedência. Alternativamente, adapte a série de diluição de 1:10 (por exemplo, 1:5, 1:20 ou 1:30) para cobrir a curva de lançamento completa. Além disso, a concentração inicial pode variar dependendo da configuração experimental. - Para lavar as células huRBL banhadas na placa de 96 poços, remova primeiro o meio celular contendo soro, aspirando cuidadosamente, invertendo e tocando a placa em papel absorvente.
- Lave as células com 200 μL de 1x tampão de Tyrodes por poço. Trate todos os poços da mesma forma.
NOTA: Adicione a solução de lavagem lentamente às células para não perturbá-las. - Deixe-o por aproximadamente 30 s e repita o passo de lavagem três vezes no total.
- Depois de adicionar a solução de lavagem pela última vez, deixe a solução nos poços até ficar pronto para continuar adicionando a diluição do antígeno.
NOTA: Evite expor células ao ar por muito tempo. - Transfira 100 μL de solução de antígeno para cada poço contendo as células huRBL pré-sensibilizadas.
NOTA: Se analisar vários parâmetros diferentes, transfira as amostras individuais da série de diluição para uma placa adicional de 96 poços não vinculantes (use o mesmo layout da placa huRBL) e transfira-as posteriormente com uma pipeta multicanal diretamente na placa da célula huRBL. Dessa forma, expor as células ao ar por muito tempo pode ser evitado, o que pode resultar em um fraco desempenho do ensaio (menor/nenhum sinal). - Cobrir poços de controle (células de fundo máximas e não sensibilizadas) com 100 μL de tampão de 1x Tyrode. Não estimule esses poços de controle com o antígeno.
- Além disso, adicione 100 μL do buffer de 1x Tyrode aos poços sensibilizados sem antígeno da série de diluição, que é necessário para levar em conta a liberação espontânea independente de antígeno de células sensibilizadas durante a análise de dados.
- Incubar células huRBL por 1h a 37 °C e 5%-7% CO2.
6. Medição da fluorescência da atividade β-hexosaminidase
- Trate os poços do controle máximo de lise com 10 μL de 10% Triton X-100 por poço e misture corretamente para lise as células completamente e obtenha a liberação de 100% de β-hexosaminidase.
- Adicione 50 μL de solução de substrato em uma nova placa de 96 poços não vinculante. Solução de substrato para uma placa de 96 poços: 5 mL de tampão de ensaio cítrico de 0,1 M, pH 4.5; e 80 μL de 10 mM 4-metilumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminida.
- Transfira 50 μL de supernasceção celular de todos os poços para a nova placa contendo a solução do substrato.
NOTA: Pipeta o supernatante cuidadosamente fora da placa huRBL para não interromper as células huRBL. - Incubar a placa com solução de substrato e supernaciante celular por 1 h a 37 °C para permitir a conversão do substrato fluorogênico.
NOTA: Mantenha a placa huRBL para ensaio de viabilidade celular. - Adicione 100 μL de solução de parada (15 g/L glycine, 11,7 g/L NaCl dissolvido em dH2O, pH 10.7) por poço.
- Meça a fluorescência em excitação de 360 nm e emissão de 465 nm usando um leitor de placas.
7. Análise de dados
- Para cálculos básicos de versão percentual, use qualquer software de planilha.
- Para a subtração de fundo/remoção da linha de base, subtraia a média dos poços de fundo de todos os outros poços.
- Calcule a média dos poços máximos de lise e os dados expressos da série de diluição em porcentagem. Dessa forma, pode-se expressar dados como uma porcentagem de liberação celular normalizada para a liberação máxima de enzimas causada pela lise celular.
- As curvas completas de liberação de mediadores de dose-resposta são melhor representadas como gráficos XY com a concentração de antígeno em um tronco no eixo X e porcentagem de liberação de mediador no eixo Y.
- Adicione os valores do controle sem antígeno como uma linha tracejada para indicar o fundo ou o platô inferior.
NOTA: Vários soros tratados da mesma forma podem ser comparados usando esta estratégia de normalização. Para comparação direta, recomenda-se ainda calcular a meia liberação máxima, que é a concentração de antígeno (em ng/mL) necessária para a meia liberação máxima definida como a média dos valores máximos e mínimos por curva. A concentração de antígeno para estimular a liberação semi-máxima é calculada pela interpolação do valor de liberação meia máxima em uma linha de regressão logarítmica.
Representative Results
O ensaio de liberação do mediador, baseado em células huRBL(Figura 1A e B),resulta em uma curva dose-resposta em forma de sino(Figura 1C). Para representação simplificada dos dados, a concentração de antígeno necessária para a liberação de mediador meio máximo pode ser calculada por meio de regressão linear(Figura 1D). Um ensaio de viabilidade celular é realizado para excluir efeitos citotóxicos derivados do soro sensibilizador ou do antígeno utilizado para estimulação(Figura 1E). O ensaio pode ser usado para testar a reatividade de sera diferente a um certo antígeno. No nosso caso, 4 de 5 sera, derivados de pacientes alérgicos de pólen de bétula, responderam à estimulação bet v 1. O soro nº 1 apresentou a maior versão mediadora(Figura 2). O soro #5 não respondeu à estimulação bet v 1 e, assim, pode reagir a outros alergênicos de pólen de bétula (por exemplo, Bet v 2, profilin). Esses dados indicam que bet v 1 é um potente alergênico responsável por sintomas alérgicos mediados pelo IgE. Utilizando o ensaio huRBL, pode-se avaliar a reatividade cruzada do IgE aos alérgenos homólogos(Figura 3). Aqui, ambos os pacientes alérgicos de pólen de bétula responderam bem à Bet v 1, enquanto apenas o paciente #2 respondeu também a Cor a 1, o alergênico alimentar Bet v 1-homólogo encontrado em avelãs. Com base nesses dados, o paciente #2 provavelmente tem maior cor um níveis de IgE 1-cross-reactive do que o paciente #1, resultando em sintomas de alergia oral sobre o consumo de avelã. Até mesmo a avaliação da natureza hipoalergênica das variantes mutantes dos alérgenos (potência reduzida) pode ser analisada e comparada à sua contraparte do tipo selvagem(Figura 4). No exemplo fornecido, a curva de liberação da variante da dobra mudou-se para uma maior concentração de antígeno em comparação com o alérgeno do tipo selvagem, resultando em uma concentração significativamente maior de antígeno necessário para provocar a liberação meia máxima(Figura 4B). Esses dados implicam que a variante mutante/dobra gerada é menos alergênica em comparação com a proteína do tipo selvagem. Esta potência reduzida para desencadear a degranulação mediada pelo IgE destaca o caráter hipoalergênico da variante da dobra. Com base neste ensaio, a variante do fold é um candidato interessante para a imunoterapia específica para alergênicos, uma vez que pode causar efeitos colaterais associados à IgE durante o tratamento.
Figura 1: Células RBL humanizadas e uma curva representativa em forma de sino de liberação de β-hexosaminidase em forma de sino. As células RBL são aderentes aos frascos de cultura, o que lhes dá uma forma semelhante a uma vara, pois estão tentando se prender(A). Um nível ideal de confluência para as células a serem colhidas não é mais do que 90% (B). As células são mostradas sob ampliação de 40x e 10x, respectivamente. Células sensibilizadas com soro humano de um indivíduo alérgico de pólen de bétula reagindo após desafio com a aposta recombinante v 1 (rBet v 1), o maior alergênico de pólen de bétula(C). Como substituto para a liberação do mediador, a atividade β-hexosaminidase é medida em supernantes celulares. A curva em forma de sino resulta de uma ocupação monovalente de epítopos de antígeno no IgE devido ao excesso de alérgeno, o que inibe competitivamente a ligação transversal alérgeno-IgE em altas concentrações de antígeno. Outra explicação para a baixa liberação em altas concentrações de alérgenos é a inibição de vias intracelulares na presença de excesso de antígeno. Para determinação da concentração de alérgenos necessária para a obtenção da liberação semi-máxima, utilizou-se uma linha de regressão logarítmica com base nos valores experimentais que representam a parte linear da inclinação da curva de liberação do mediador (D). A linha pontilhada vermelha representa a linha de regressão logarítmica utilizada para o cálculo. A fórmula da linha de regressão é mostrada em vermelho. A meia liberação máxima é definida como: meia liberação máxima = (valor mínimo de liberação + valor máximo de liberação)/2. No exemplo, a liberação de meia máxima calculada foi de 20,6%. O soro humano representativo utilizado neste experimento foi diluído 1:20 para incubação com células huRBL, e a concentração de antígeno utilizada para estimulação variou de 100 μg/mL a 0,004 pg/mL de Bet v 1. Um ensaio de viabilidade celular, neste caso um ensaio MTT, foi realizado com as demais células após estimulação de antígeno para avaliar a influência do soro sensibilizador, bem como da diluição do antígeno na viabilidade celular e contagem celular (E). Células de fundo não tratadas e células lísedas (máxima lise) são mostradas como linha pontilhada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas representativas de β-hexosaminidase por cento liberação de cinco sera humanos diferentes. A mesma faixa de concentração de antígeno de rBet v 1 foi incubada com células huRBL que foram sensibilizadas com soro de diferentes indivíduos sensibilizados com pólen de bétula. Há uma clara diferença de liberação percentual entre os diferentes pacientes correspondentes à gravidade de seus sintomas. Observe que o paciente #5 não é reativo ao alergênico de pólen de bétula principal Bet v 1. Todos os cinco sera humanos utilizados para obter essas curvas de liberação de mediadores foram diluídos igualmente 1:20 para incubação com células huRBL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reatividade cruzada do IgE derivado de soro de pólen de bétula sensibilizou pacientes com o Bet v 1 alergênico de avelã Homônus Cor a 1. Dois soros representativos de pacientes sensibilizados para pólen de bétula reagem fortemente à Bet v 1, bem como em menor grau ao alergênico homólogo Cor a 1. O paciente 2 apresenta uma reação significativa ao Cor a 1 e, portanto, provavelmente exibirá sintomas de alergia oral no consumo de avelã, em comparação com o paciente 1, onde a liberação do mediador é quase insignificante. A linha pontilhada representa o controle sem antígeno, que são células sensibilizadas com o sera humano, mas não estimuladas com um alérgeno, e, portanto, serve como indicação para o platô/fundo do sinal inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação da liberação percentual entre rBet v 1 tipo selvagem e uma variante de dobra hipoalergênica. O mesmo soro de um indivíduo sensibilizado com pólen de bétula foi incubado com rBet v 1 tipo selvagem (wt) e uma variante hipoalergênica do alergênico de pólen de bétula principal(A). Embora a liberação do mediador seja vista em ambos os antígenos, há uma clara mudança para concentrações mais altas de antígeno ao comparar a variante do fold com o tipo selvagem rBet v 1 para a mesma versão por cento. Uma forma padrão de comparar a diferença na liberação percentual de diferentes antígenos é calcular a concentração de antígeno necessário para atingir a metade da liberação máxima(B). Isso geralmente é realizado em réplicas biológicas (testes da mesma faixa de antígeno para cada alérgeno em sera humano diferente). Normalmente, para tirar conclusões significativas, a liberação do mediador é realizada com sera de pelo menos 8 a 10 pacientes diferentes. Aqui os resultados de quatro seras diferentes são traçados como exemplo. Foi utilizado um teste temparelhado para análise estatística. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Possíveis perguntas e solução de problemas | Solução |
| Variabilidade de ensaio para ensaio devido à capacidade de resposta celular alterada | Certifique-se de que o número do ciclo de passagem da célula não exceda 20 a 30 passagens. Faça estoques congelados em passagens antecipadas para experimentos futuros. |
| Em vez disso, dependem de réplicas biológicas (uso de sera diferentes) do que técnicas. | |
| Sera contém baixos níveis de IgE específico | Uma diluição final inferior do soro pode ser usada (i. e. 1:10) em vez de 1:20. Por outro lado, o sera contendo altos níveis de IgE específico pode ser ainda mais diluído (1:30 ou 1:40). |
| Não há células suficientes para executar o ensaio | Certifique-se de que a confluência em um frasco T-75 esteja em torno de 50-90%. Passagem mais frascos. |
| Efeitos citotóxicos do sera, ou seja, devido à inativação complementar incompleta | Realize um ensaio de viabilidade celular, além do ensaio de liberação do mediador. Aumente a concentração de Ag8 para evitar inativação de complemento incompleta. |
| Sinal baixo | Melhore a relação sinal-ruído do ensaio diluindo o tampão de 1x Tyrode em óxido de deutério (D2O) em vez de dH2O, ou usando uma soro com níveis mais elevados de IgE específico para o alergênico de interesse. |
| O alérgeno não é estável no tampão de Tyrode (por exemplo, precipitação) | Faça testes de estabilidade no buffer de 1x Tyrode antes do procedimento de ensaio. A substituição do buffer de Tyrode não é recomendada. |
| Problemas para encontrar a concentração inicial certa para o respectivo alérgeno | Adaptação da série de diluição para cobrir a curva de liberação completa (mais etapas de diluição, diluição de 1:20 em vez de 1:10). |
| Desempenho ruim de ensaio indicado por sinal baixo/não | Evite efeitos citotóxicos de estimulação de soro ou antígeno (por exemplo, alergênicos enzimáticos). Lave e mergulhe as células cuidadosamente. Evite a exposição ao ar por muito tempo e evite que as células sequem. |
| Como saberei se o platô de sinal inferior é atingido? | Adicione controles "sem antígeno" ao seu prato. Estas são células sensibilizadas, que só foram estimuladas com 1x tampão de Tyrode, mas sem um alérgeno. |
| Preciso de um controle positivo além dos poços máximos de lise? | Como controle positivo adicional, uma combinação de soro e antígeno conhecida por causar desgranulação pode ser usada ou um anticorpo anti-FcεR1. |
| De quantos poços preciso? | Isso depende da sua série de titulação, do número de antígenos e sera que você quer analisar. Planeje o layout das placas de 96 poços de acordo com quantas sera/antígenos você vai testar. Não se esqueça de adicionar os "controles de antígeno", as células de fundo (não sensibilizadas, não estimuladas) bem como os poços máximos de lise. |
| Quantas sera devo testar? E preciso de réplicas? | Embora o ensaio seja bastante robusto, há alguma variabilidade de ensaio para ensaio devido à capacidade de resposta celular alterada. Portanto, recomenda-se confiar em réplicas biológicas (utilizando sera diferente) do que em réplicas técnicas. Um mínimo de oito sera diferentes é suficiente para analisar alérgenos. No entanto, como mostrado na Fig. 4B, resultados significativos já podem ser obtidos utilizando menos sera. |
Tabela 1: Solução de problemas.
Discussion
O ensaio de liberação de mediato baseado em células huRBL é um método robusto que pode ser facilmente executado e implementado em qualquer laboratório. O único requisito é que as células precisem ser cultivadas em condições estéreis. O ensaio é usado para avaliar a probabilidade de uma fonte alergênico ou alergênica evocar a degranulação de IgE e basófilo17. O ensaio pode ser facilmente adaptado a qualquer fonte alergên em alergênico ou alergênico, desde que o soro do paciente com um alto nível de IgE específico, reconhecendo o alergênico de interesse, esteja disponível. Recomenda-se realizar um ensaio de viabilidade celular, além do ensaio de liberação do mediador, a fim de explicar quaisquer efeitos citotóxicos potenciais que possam resultar em um fraco desempenho do ensaio. Isso pode ser devido à inativação complementar incompleta do soro ou outros efeitos citotóxicos derivados do soro. Mesmo o antígeno em si, por exemplo, por causa da atividade proteolítica/enzimática, pode prejudicar as células huRBL. Geralmente estamos usando um ensaio de viabilidade celular com MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) para avaliar potenciais efeitos citotóxicos. O ensaio pode ser facilmente realizado com as células huRBL deixadas após a célula supernante ser coletada e transferida (ver etapa 6.3. do protocolo). Comparado a outros métodos imunoquímicos, como ELISAs e manchas ocidentais, para determinar o potencial alergênico de alérgenos individuais ou extratos complexos baseados na ligação alergênico-IgE, este ensaio pode detectar não apenas a ligação do IgE a um alérgeno, mas também pode medir a funcionalidade de ambos, IgE humano e o alergênico, para provocar a degranulação basófila mediada pelo IgE18. Assim, pode auxiliar no estudo da gravidade dos sintomas alérgicos ex vivo utilizando o soro dos pacientes. O ensaio é relatado como mais consistente e eficiente do que os testes clássicos de anafilaxia cutânea passiva, uma vez que o ensaio utiliza as células RBL-2H3, que são relativamente fáceis de manusear e produzem menos variabilidade em resultados em comparação com células primárias, como células de mastro ou basófilos humanos19,20. Além disso, o ensaio fornece uma boa representação da atividade biológica dos alérgenos e pode estimar com precisão o teor total de alergênicos em uma determinada amostra complexa3. Para solucionar problemas certas etapas do protocolo, consulte a Tabela 1.
Quanto à aplicabilidade desta versão do ensaio de liberação do mediador, tem sido utilizada principalmente para fins de pesquisa, mas também para a padronização de extratos alergênicos com base em sua atividade biológica. Isso inclui a análise de diferentes lotes de soluções SPT, solução de teste de provocação, bem como extratos utilizados para imunoterapia específica para alérgenos; como mostrado para pólen, casinha de gato, ácaro de pó da casa e extratos de amendoim, bem como veneno de abelha3,17,21. A técnica pode ser aplicada especialmente no diagnóstico de alergias alimentares, pois pode detectar até mesmo quantidades mínimas de constituintes alergênicos em produtos alimentares complexos como amendoim, leite, trigo e ovos22. Nesse sentido, também tem sido relatada como uma ferramenta valiosa para a avaliação da alergenicidade dos alergênicos alimentares animais, como tropomyosinas, podendo auxiliar na distinção de potentes alérgenos dos não alérgenos23. Como ferramenta de pesquisa, o ensaio é utilizado para estudar o impacto do processamento de alimentos, bem como para avaliar a influência da ligação de ligantes aos alérgenos e seu efeito sobre a alergenicidade24,25. Por exemplo, a vinculação de Bet v 1 aos ligantes mostrou-se não afetar a ligação transversal alergênico-IgE, embora tenha causado um aumento em sua estabilidade térmica e proteolítica25. O ensaio pode ser usado para comparar a reatividade do paciente com alérgenos menores e grandes, bem como para investigar a reatividade cruzada de hologues e isoformas alergênicos, como mostra nosso exemplo usando a Bet v 1 e o alergênico homólogo Cor a 1(Figura 3). Em relação aos isoformes alergênicos, o ensaio de liberação do mediador foi utilizado para identificar o alergênico principal Amb a 1,01 como o isoforme ige-reativo mais potente em pólen de ervasdaninhas (Ambrosia artemisiifolia). Em comparação, os outros dois isóformes identificados em extratos de pólen de ervas daninhas, Amb a 1,02 e Amb a 1,03, apresentaram reatividade reduzida ao IgE26dos pacientes .
Nos últimos anos, o ensaio tem sido aplicado para estudar potenciais compostos antialérgicos e novas variantes hipoalergênicas de alérgenos, auxiliando na identificação de candidatos adequados para imunoterapia específica para alérgenos27,28. Outra abordagem nova é usar o ensaio para monitorar a eficácia do tratamento no curso da imunoterapia específica para alergênicos. Nesse sentido, nosso grupo de pesquisa desenvolveu um sistema de inibição de ensaios huRBL, que se correlacionava bem com a redução do escore de sintomas do paciente durante a imunoterapia específica para alérgeno29. O ensaio também foi proposto para estudar os efeitos imunossupressores do TGFβ1 na degranulação mediada pelo IgE induzida por alérgenos30.
As limitações do ensaio são que, embora as células huRBL possuam algumas características de células de mastro ou basófilos, elas não imitam completamente a função natural dessas células efeitos. Por exemplo, as células de mastro expressam amplamente o receptor de reconhecimento de padrão Receptor 4 (TLR4), necessário para o reconhecimento de patógenos, enquanto é completamente deficiente nas células RBL-2H331. Devido a essa diferença de funcionalidade, o ensaio não imita totalmente a situação da vida real, que precisa ser mantida em mente ao interpretar os dados. Além disso, uma vez que as células huRBL são células basofílicas cancerígenas, mudanças nas condições de cultura e cultivo prolongado podem levar a diferenças fenotípicas levando a resultados alterados entre diferentes laboratórios20. Outro aspecto é a escolha da concentração de alérgenos que deve ser levada em conta ao adaptar este método, uma vez que altas concentrações de alergênicos podem resultar em desgranulação mediada não-IgE devido à presença de altas quantidades de proteases ou endotoxinas18. Outras limitações são a dependência da soro humana com níveis de IgE específicos relativamente altos (classe RAST 5-6), e a necessidade de sistemas de cultura celular, que continua sendo um obstáculo que precisa ser superado para implementar a técnica no cotidiano clínico.
Além dessas limitações, o ensaio huRBL representa uma valiosa ferramenta de pesquisa para o diagnóstico e tratamento de doenças alérgicas e pode ser utilizado em uma ampla gama de aplicações.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Dr. Stefan Vieths do Departamento de Alergia Molecular, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Alemanha, por fornecer as células RBL humanizadas/FcεRI-transfected e por dar seu consentimento para escrever este artigo de metodologia de pesquisa. Queremos agradecer à Profª Doutora Fátima Ferreira por dar um excelente feedback. Gostaríamos ainda de agradecer ao Prof. Dr. Ronald van Ree e ao Dr. Jaap Akkerdaas do Departamento de Imunologia Experimental, Centros Médicos da Universidade de Amsterdã, localização AMC, Amsterdã, Holanda, por dar seu consentimento para publicar dados representativos fornecidos neste artigo de métodos, que foram gerados no curso do projeto BM4SIT - inovações para alergia (www.BM4SIT.eu). O trabalho dos autores foi apoiado pelo Fundo Austríaco de Ciência (Projeto P32189), pelo programa prioritário da Universidade de Salzburgo, Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, pelo programa de doutorado Imunidade em Câncer e Alergia-ICA financiado pelo Fundo de Ciência austríaco (FWF W01213), e pelo projeto BM4SIT (número de bolsas 601763) do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B. Allergen-induced mediator release tests. Allergy. 58 (7), 553-558 (2003).
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
