Summary
Her presenterer vi mediatorutgivelsesanalysen, ved hjelp av en rottebassofil leukemicellelinje transfektert med den menneskelige IgE-reseptoren, for å simulere degranulering av effektorceller som vanligvis observeres i type 1 allergiske reaksjoner. Denne metoden undersøker allergenenes biologiske aktivitet på en svært følsom, reproduserbar og skreddersydd måte.
Abstract
Mediatorutgivelsesanalyser analyserer in vitro immunoglobulin E (IgE)-mediert degranulering og sekresjon av mediatorer ved effektorceller, som mastceller og basofiler, ved stimulering med serielle fortynninger av putative allergener. Derfor representerer disse analysene et viktig verktøy som etterligner in vivo degranulation prosessen, som oppstår ved allergeneksponering hos sensibiliserte pasienter eller i hudstikktester. I tillegg brukes disse analysene vanligvis til å undersøke det allergifremkallende potensialet til proteiner og reaktivitet av pasientens seras reaktivitet. Her beskriver vi en enkel 2-dagers protokoll ved hjelp av en udødeliggjort rotte basofil leukemicellelinje transfektert og humanisert med den menneskelige høyaffinitet IgE plasmamembranreseptoren (FcεRI). Denne varianten av mediatorutgivelsesanalysen er et robust, følsomt og reproduserbart in vitro cellebasert system uten å måtte immobilisere antigenet til faste matriser. Protokollen består av følgende trinn: (1) utfylle inaktivering av human sera, (2) høsting, såing og passiv sensibilisering av cellene, (3) stimulering med antigen for å forårsake mediatorfrigjøring, og (4) måling av β-hexosaminidase aktivitet som surrogat for de utgitte inflammatoriske mediatorene, for eksempel histamin. Analysen representerer et nyttig verktøy for å vurdere kapasiteten til allergen-IgE krysskobling for å utløse celle degranulering og kan implementeres for å standardisere allergenekstrakter, å sammenligne pasienters reaktivitet med mindre eller store allergener og med allergifremkallende ekstrakter (pollen, kattedander, etc.), for å undersøke styrken til allergen homologer, isoformer og foldvarianter (f.eks. hypoallergenicitet), samt effekten av ligander på den allergifremkallende aktiviteten. En nyere applikasjon inkluderer bruk av analysen for å overvåke behandlingseffekten i løpet av allergenimmunoterapi.
Introduction
Type I overfølsomhetsreaksjoner, preget av Immunoglobulin E (IgE) produksjon spesifikk for et respektive antigen, påvirker nesten en tredjedel av verdens befolkning. Disse reaksjonene er forbundet med flere allergiske manifestasjoner som astma og rhinokonjunktivitt og kan til og med føre til systemiske livstruende reaksjoner1. I motsetning til in vivo-tester er immunkjemiske tilnærminger, som den enzymbundne immunosorbente analysen (ELISA), utelukkende egnet for å undersøke målbindingen av antistoffer, men adresserer ikke det funksjonelle aspektet av proteiner som kan forårsake umiddelbare overfølsomhetsreaksjoner. Immobiliseringen av allergenene på faste støtter (f.eks. ELISA-plater) kan forårsake endringer i deres strukturelle integritet og ødeleggelse av allergirelevante epitoper2. Selv hudstikktester (SPT), det vanligste verktøyet for å bekrefte sensibilisering mot visse allergener, har sine grenser for påvisning av symptomatisk IgE-mediert matallergi eller allergentilgjengelighet3,4. For å finne en etisk, svært spesifikk, sensitiv og kostnadseffektiv metode for å teste allergenenes biologiske styrke for å forårsake en type I overfølsomhetsreaksjon, er de såkalte meglerutgivelsesanalysene etablert.
Prinsippet om disse analysene er avhengig av hendelser etter sensibiliseringsfasen og IgEs medfølgende evne til å binde seg til α-kjeden av høyaffinitetsreseptorene uttrykt på overflaten av effektorceller, som mastceller og basofiler. IgE produseres hovedsakelig av plasmaceller i det mucosal-assosierte lymfoidvevet. Selv om det er den minst rikelig immunglobulin (rundt 0,05% hos ikke-atopiske individer) i blodet, har den en ekstraordinær høy biologisk aktivitet som hovedårsaken til allergiske symptomer. Halveringstiden til IgE kan øke fra 2-3 dager til flere uker og til og med måneder når bundet til reseptorene på effektorceller. Etterfølgende binding av et antigen til variabelområdet av to reseptorbundne IgE-molekyler fører til krysskobling etterfulgt av induksjon av en nedstrøms signalkaskade i effektorcellen som fører til deganilering og frigjøring av flere proinflammatoriske mediatorer som forårsaker vasodilatasjon, som histamin, serinproteaser (f.eks. tryptase) og prostaglandiner5,6,7. Sekresjonen av cytokiner som interleukin 4 (IL-4) og IL-13 er ansvarlig for vedlikehold av den inflammatoriske T-hjelperen 2 (Th2) respons og klasseveksling av B-celler til IgE-produserende plasmaceller5,8,9. På den annen side forårsaker frigjort trombosan bronkokonstriksjon, og leukotriener stimulerer jevn muskelkontraksjon samt vaskulær lekkasje, og spiller en avgjørende rolle i luftveisbetennelse som fører til astma eller allergisk rhinitt10,11.
Det er etablert forskningsverktøy for å analysere de fleste av de nevnte meglerne, men med noen store ulemper. Tryptaseanalyser er egnede kliniske tilnærminger for måling av systemiske anafylaksi gjennom mastcelleaktivering, men deres følsomhet og spesifisitet i allergidiagnoser er for unøyaktig sammenlignet med gullstandardmetoder som SPT. På den annen side er cysteinyl leukotrienanalyser ikke i stand til å diagnostisere allergier mot β-laktamer eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler12. Protokoller for måling av histamin som en stor mellommann utgitt i allergiske reaksjoner var allerede etablert på 1960-tallet. Når det slippes ut i perifert blod, blir histamin umiddelbart degradert av histamin metyltransferaser som resulterer i en plasma halveringstid på bare noen få minutter, noe som gjør analysen ganske utfordrende13. Bortsett fra ustabiliteten, ble overvåkingen av histamin vist å ha lav spesifisitet og følsomhet for narkotikaallergier samt kommersielle matproteiner og vepsgifter12.
In vitro-modeller med effektorcellelinjer har blitt introdusert som et alternativ til de arbeidsintensive prosedyrene for isolasjon og dyrking av basofiler fra allergiske pasienter for å utføre frigjøringsanalyser. Derfor er rottebassofil leukemi- (RBL-) basert analyse ved hjelp av RBL-2H3 cellelinjen etablert3. Siden denne cellelinjen ikke er i stand til å binde menneskelig IgE, ble den først transfektert med α-, β- og γ-kjeden til den menneskelige IgE plasmamembranreseptoren (FcεRI). Flere kloner har blitt generert og testet for uttrykksnivåer og homogenitet i den menneskelige α-kjeden, hvorav klonen RBL-30/25 dukket opp som den mest lovende kandidaten for in vitro-testing. Signalkaskaden forårsaket ved reseptoraktivering av den transfekterte klonen ble testet via kalsiummobiliseringsanalyser. Som en indikator for degranulering og surrogat for histaminfrigjøring ble det lysosomale enzymet β-hexosaminidase målt, noe som har den betydelige fordelen med høyere stabilitet14. Mediatorutgivelsen ved hjelp av RBL-30/25-celler når opptil 100% og brukes derfor til å teste sera avledet fra allergiske pasienter. Analysen ble testet for meglerutgivelsen etter å ha utfordret sensibiliserte celler med kommersielle allergenekstrakter. Dette førte til at det er en enorm variasjon i sammensetningen (opptil 60 ganger angående det totale proteininnholdet) av allergenekstrakter avledet fra forskjellige produsenter og brukt til diagnostiske (f.eks. SPT) eller terapeutiske tilnærminger3,15,16.
Heri gir vi en detaljert beskrivelse av RBL-protokollen for å utføre meglerutgivelsesanalysen ved hjelp av serum fra allergiske donorer. Under passiv sensibilisering fanges IgE i serumet av den høye affiniteten FcεR1 reseptor uttrykt på overflaten av basofile celler. Ved antigenstimulering er bundne IgEs spesifikke for antigenet kryssbundet, utløsende cellederiangulering og frigjøring av mediatoren β-hexosaminidase. Aktiviteten til β-hexosaminidase måles deretter ved hjelp av et passende substrat. For analysen ble huRBL-2H3-celler brukt, og kalt huRBL i følgende protokoll. Protokollen beskriver en standard antigenfortynningsserie med 8 trinn fortynnet 1:10 fra 1 μg/ml til 0,1 pg/ml allergen.
Protocol
Etisk godkjenning for å bruke sera avledet fra bjørk pollen allergiske pasienter ble hentet fra den nederlandske etiske komiteen (godkjenningsnummer: NL65758.018.18).
1. Sikkerhetsprosedyrer
- Arbeid under sterile forhold ved hjelp av en biologisk sikkerhetsklasse 2 arbeidsbenk i løpet av den første dagen av eksperimentet (Biosafety Level 2). Følg institusjonens sikkerhetsretningslinjer for bruk av humant serum.
2. Komplement inaktivering av menneskelig sera
- Høst en tett kultur av P3X63Ag8.653 celler (kalt Ag8 celler heretter), fra cellekulturflasken og overfør dem til et sentrifugeringsrør.
- Bruk følgende kulturmedium for disse cellene: Modifisert Eagles Minimum Essential Medium med redusert serumkonsentrasjon, 1% Penicillin-Streptomycin (100 enheter Penn., 0,1 mg/ml Strep.), 5% varmeinaktivert fosterkalv/bovint serum (FCSi).
- Sentrifuger Ag8 celler i 5 min ved 250 x g ved romtemperatur.
- Re-suspendere cellepellet til en endelig konsentrasjon på ca 1 x 106 celler / ml i huRBL medium (Minimum Essential Medium Eagle med Alpha Modifikasjon, 4 mM L-Glutamine, 5% FCSi, 1% G418 (100% lager: 10 g / 125 ml dH2O).
MERK: Oppretthold Ag8-celler ved å passere for fremtidig bruk også. - Fortynn menneskelig sera 1:10 i Ag8 celle suspensjon. Endelig serumfortynning i analysen vil være 1:20.
MERK: For sera med lav spesifikk IgE kan en 1:5 (1:10 endelig fortynning) brukes. - Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 %-7 % CO2.
3. Høsting og såing av huRBL-celler
- Aspirer mediet fra en T-75 cellekulturflaske forsiktig uten å berøre huRBL-cellene (huRBL-celler er tilhenger). Forsikre deg om at cellene er rundt 50% -90% sammenløp.
MERK: Avhengig av cellesamløpet er celleinnholdet i en tett T-75 cellekulturflaske vanligvis nok for en til to 96-brønnsplater. - Vask cellene to ganger ved å tilsette 10 ml av Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS). Tilsett DPBS på motsatt side av kolben og ikke direkte på cellene.
- Aspirer DPBS og tilsett 5 ml forvarmet 1x trypsin-EDTA (0,05% / 0,02% EDTA fortynnet i DPBS) for celleavløsning.
- Inkuber kolben i 5 min ved 37 °C.
- Løsne celler ved å tappe kolben forsiktig.
- Overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugeringsrør og fyll opp med huRBL medium eller DPBS for å fortynne trypsin-EDTA.
- Sentrifuger cellene ved 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer den supernatante og resuspend pellet i 5 ml huRBL medium for celletelling.
- Tell cellene og fortynn dem i huRBL-medium for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 x 106 celler / ml.
- Bruk en steril 96-brønnsplate og tilsett 50 μL huRBL celleoppheng per brønn, noe som tilsvarer 1 x 105 celler / brønn.
4. Passiv sensibilisering av huRBL-celler
- Sentrifuger den forhåndsinkuberte Ag8/serumfjæringen i 5 min ved 250 x g.
- Overfør 50 μL av sentrifugert Ag8/serumfjæring til hver brønn som inneholder huRBL-celler uten å forstyrre Ag8-cellepelleten.
- Inkluder ingen antigenkontroll, som er sensibiliserte, men ustimulerte celler (ikke tilsett antigen), som tjener som en indikasjon på bunnsignalplatået / bakgrunnen. Bakgrunns- og maksimumslyskontrollbrønner trenger ikke å sensibiliseres med serum. Tilsett 50 μL huRBL medium for å kontrollere brønner i stedet.
- Dekk platen med lokket og inkuber over natten ved 37 °C og 5%-7% CO2.
5. Antigenstimulert degranulering og mediatorutgivelse
- Forbered antigenfortynning i 1x Tyrodes buffer (9,5 g/L Tyrodes salter, 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5 g/L natrium hydrogenkarbonat (NaHCO3) i dH2O) på forhånd. En endelig mengde på 100 μL per brønn er nødvendig.
MERK: Ikke alle allergener, verken renset fra naturlige kilder eller rekombinant produsert, kan være stabile i 1x Tyrodes buffer. Utfør derfor stabilitetstester i 1x Tyrodes buffer før analyseprosedyren. Alternativt kan du fortynne 1x Tyrodes buffer i deuteriumoksid(D2O) for å øke signal-til-støy-forholdet mellom analysen. - Gjør 8 fortynninger av antigenet av interesse for en 1:10 fortynningsserie i reaksjonsrør som starter med enten 10 eller 1 μg / ml protein.
MERK: Test alltid fortynningsserien på forhånd. Alternativt kan du tilpasse 1:10-fortynningsserien (f.eks. 1:5, 1:20 eller 1:30) for å dekke hele utløserkurven. I tillegg kan startkonsentrasjonen variere avhengig av det eksperimentelle oppsettet. - For å vaske huRBL-celler belagt på 96-brønnsplaten, fjern det seraholdige cellemediet først ved å forsiktig aspirere, invertere og banke platen på absorberende papir.
- Vask celler med 200 μL 1x Tyrodes buffer per brønn. Behandle alle brønner på samme måte.
MERK: Legg vaskeløsningen langsomt til cellene for ikke å forstyrre dem. - La det stå i ca 30 s og gjenta vasketrinnet tre ganger totalt.
- Etter å ha lagt til vaskeløsningen for siste gang, la løsningen i brønnene være klar til å fortsette med å legge til antigenfortynning.
MERK: Unngå å utsette cellene for luft for lenge. - Overfør 100 μL antigenoppløsning til hver brønn som inneholder de pre-sensibiliserte huRBL-cellene.
MERK: Hvis du analyserer flere forskjellige parametere, overfør de enkelte prøvene av fortynningsserien til en ekstra ikke-bindende 96-brønnsplate (bruk samme layout som på huRBL-platen) og overfør dem etterpå med en flerkanals pipette direkte på huRBL-celleplaten. På denne måten kan du unngå å utsette cellene for luft for lenge, noe som kan føre til dårlig analyseytelse (lavere / ingen signal). - Dekk kontrollbrønner (maksimal lysis og ikke-sensibiliserte bakgrunnsceller) med 100 μL 1x Tyrodes buffer. Ikke stimmuler disse kontrollbrønnene med antigenet.
- I tillegg legger du til 100 μL av 1x Tyrodes buffer til de sensibiliserte ikke-antigenbrønnene i fortynningsserien, som er nødvendig for å ta hensyn til antigenuavhengig spontan frigjøring av sensibiliserte celler under dataanalyse.
- Inkuber huRBL-celler i 1 time ved 37 °C og 5 %-7 % CO2.
6. Fluorescensmåling av β-hexosaminidase aktivitet
- Behandle brønnene til maksimal lysiskontroll med 10 μL 10% Triton X-100 per brønn og bland riktig for å lyse cellene helt og oppnå 100% frigjøring av β-hexosaminidase.
- Tilsett 50 μL substratløsning i en ny ubindende 96-brønnsplate. Substratløsning for en 96-brønnsplate: 5 ml 0,1 M sitronassisk analysebuffer, pH 4,5; og 80 μL 10 mM 4-metylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukosaminid.
- Overfør 50 μL celle supernatant av alle brønner til den nye platen som inneholder substratløsningen.
MERK: Rør supernatanten forsiktig av huRBL-platen for ikke å forstyrre huRBL-cellene. - Inkuber platen med substratoppløsning og celle supernatant i 1 time ved 37 °C for å tillate konvertering av det fluorogene substratet.
MERK: Oppbevar huRBL-platen for celle levedyktighetsanalyse. - Tilsett 100 μL stoppløsning (15 g/l glycin, 11,7 g/l nacl oppløst i dH2O, pH 10,7) per brønn.
- Mål fluorescensen ved 360 nm eksitasjon og 465 nm utslipp ved hjelp av en plateleser.
7. Dataanalyse
- Hvis du vil ha grunnleggende beregninger av prosentversjon, bruker du eventuell regnearkprogramvare.
- For fjerning av bakgrunnsavsnitt/baseline trekkes gjennomsnittet av bakgrunnsbrønnene fra alle andre brønner.
- Beregn gjennomsnittet av maksimale lysisbrønner og uttrykk data fra fortynningsserien i prosent. På denne måten kan man uttrykke data som en prosentandel av cellefrigjøring normalisert til maksimal enzymfrigjøring forårsaket av cellelys.
- Komplette doseresponsmedierutløsningskurver er best representert som XY-grafer med antigenkonsentrasjonen på en logg på X-aksen og prosentandelen av mediatorutgivelse på Y-aksen.
- Legg til verdiene for no-antigen-kontrollen som en stiplet linje for å angi bakgrunnen eller det nederste platået.
MERK: Flere tilsvarende behandlede sera kan sammenlignes med denne normaliseringsstrategien. For direkte sammenligning anbefales det videre å beregne den halve maksimale frigjøringen, som er antigenkonsentrasjonen (i ng / ml) som er nødvendig for halv maksimal frigjøring definert som gjennomsnittet av de maksimale og minimale verdiene per kurve. Antigenkonsentrasjonen for å stimulere halv maksimal frigjøring beregnes ved interpolering av den halve maksimale frigjøringsverdien til en logaritmisk regresjonslinje.
Representative Results
Mediatorutgivelsesanalysen, basert på huRBL-celler (figur 1A og B), resulterer i en klokkeformet doseresponskurve ( figur1C). For forenklet datarepresentasjon kan antigenkonsentrasjonen som er nødvendig for den halve maksimale medietorutløsningen, beregnes ved hjelp av lineær regresjon (figur 1D). En celle levedyktighetsanalyse utføres for å utelukke cytotoksiske effekter avledet fra enten sensibiliserende serum eller antigenet som brukes til stimulering (Figur 1E). Analysen kan brukes til å teste reaktivitet av forskjellig sera til et bestemt antigen. I vårt tilfelle svarte 4 av 5 sera, avledet fra bjørk pollen allergiske pasienter, på Bet v 1 stimulering. Serum #1 viste den høyeste meglerutgivelsen (Figur 2). Serum #5 reagerte ikke på Bet v 1 stimulering og kan dermed reagere på andre bjørk pollen allergener (f.eks, Bet v 2, profilin). Disse dataene indikerer at Bet v 1 er et potent allergen som er ansvarlig for IgE-medierte allergiske symptomer. Ved å bruke huRBL-analysen kan kryssreaktivitet av IgE til homologe allergener vurderes (figur 3). Her reagerte begge bjørk pollen allergiske pasienter godt på Bet v 1, mens bare pasient # 2 reagerte også på Cor a 1, Bet v 1-homolog matallergenet som finnes i hasselnøtter. Basert på disse dataene har pasient #2 mest sannsynlig høyere Cor et 1-kryss-reaktivt IgE-nivå enn pasient #1, noe som resulterer i orale allergi symptomer ved hasselnøttforbruk. Selv vurderingen av den hypoallergene naturen til mutante varianter av allergener (redusert styrke) kan analyseres og sammenlignes med deres ville motpart (figur 4). I det medfølgende eksemplet skiftet frigjøringskurven til foldvarianten mot en høyere antigenkonsentrasjon sammenlignet med wild-type allergenet, noe som resulterte i en betydelig høyere konsentrasjon av antigen som er nødvendig for å provosere halv maksimal frigjøring (Figur 4B). Disse dataene antyder at den genererte mutant/ foldvarianten er mindre allergifremkallende sammenlignet med villtypeproteinet. Denne reduserte styrken til å utløse IgE-mediert degranulering fremhever den hypoallergene karakteren til foldvarianten. Basert på denne analysen er foldvarianten en interessant kandidat for allergenspesifikk immunterapi siden det kan forårsake redusert IgE-assosierte bivirkninger under behandlingen.
Figur 1: Humaniserte RBL-celler og en representativ klokkeformet kurve av IgE-allergen krysskoblingsindusert β-hexosaminidase-frigjøring. RBL-celler følges av kulturflaskene, noe som gir dem en stanglignende form når de prøver å feste seg (A). Et ideelt nivå av samløp for celler som skal høstes er ikke mer enn 90% (B). Celler vises under forstørrelse på henholdsvis 40x og 10x. Celler som ble sensibilisert med menneskelig serum av en bjørk pollen allergisk person reagerer på utfordring med rekombinant Bet v 1 (rBet v 1), den store bjørk pollen allergen (C). Som surrogat for meklerutgivelse måles β-hexosaminidase-aktiviteten i celle supernatanter. Den klokkeformede kurven er et resultat av en monovalent okkupasjon av antigen epitoper på IgE på grunn av overskudd av allergen, som konkurransedyktig hemmer allergen-IgE krysskobling ved høye antigenkonsentrasjoner. En annen forklaring på den lave frigjøringen ved høye allergenkonsentrasjoner er hemming av intracellulære veier i nærvær av overflødig antigen. For bestemmelse av allergenkonsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå halv maksimal frigjøring, ble det brukt en logaritmisk regresjonslinje basert på de eksperimentelle verdiene som representerer den lineære delen av hellingen til mediatorutløsningskurven (D). Den rødprikkete linjen representerer den logaritmiske regresjonslinjen som brukes til beregning. Formelen for regresjonslinjen vises i rødt. Halvmaksimal frigivelse er definert som: halv maksimal frigivelse = (minimum frigivelsesverdi + maksimal frigivelsesverdi)/2. I eksemplet var den beregnede halve maksimale utgivelsen 20,6%. Det representative menneskelige serumet som ble brukt i dette eksperimentet ble fortynnet 1:20 for inkubasjon med huRBL-celler, og antigenkonsentrasjonen som brukes til stimulering varierte fra 100 μg / ml til 0,004 pg / ml av Bet v 1. En celle levedyktighetsanalyse, i dette tilfellet en MTT-analyse, ble utført med de resterende cellene etter antigenstimulering for å vurdere påvirkningen av sensibiliserende serum samt av antigenfortynning på celle levedyktighet og celleantall (E). Ubehandlede bakgrunnsceller og lysede celler (maksimal lysis) vises som prikket linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative kurver av β-hexosaminidase prosent frigjøring av fem forskjellige menneskelige sera. Det samme antigenkonsentrasjonsområdet til rBet v 1 ble inkubert med huRBL-celler som ble sensibilisert med sera av forskjellige bjørk pollen sensibiliserte individer. Det er en klar forskjell på prosentfrigjøring mellom de ulike pasientene som tilsvarer alvorlighetsgraden av symptomene. Legg merke til at pasient #5 ikke er reaktiv mot det store bjørk pollen allergen bet v 1. Alle de fem humane seraene som ble brukt til å oppnå disse mediatorutgivelseskurvene, ble fortynnet likt 1:20 for inkubasjon med huRBL-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kryssreaktivitet av IgE avledet fra sera av bjørk pollen sensibiliserte pasienter med Bet v 1 homolog hasselnøtt allergen Cor a 1. To representative sera av pasienter sensibilisert til bjørk pollen reagerer sterkt på Bet v 1 samt i mindre grad til homolog allergen Cor a 1. Pasient 2 viser en signifikant reaksjon på Cor a 1, og vil dermed sannsynligvis vise orale allergi symptomer ved hasselnøttforbruk, sammenlignet med pasient 1 der mediatorutgivelsen er nesten ubetydelig. Den stiplede linjen representerer no-antigenkontrollen, som er celler sensibilisert med den menneskelige sera, men ikke stimulert med et allergen, og dermed tjener som indikasjon for bunnsignalplatået / bakgrunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av prosentutgivelse mellom rBet v 1 wild-type og en hypoallergen foldvariant. Det samme serumet til en bjørk pollen-sensibilisert person ble inkubert med rBet v 1 vill type (wt) og en hypoallergen fold-variant av den store bjørk pollen allergen (A). Selv om mediatorutgivelse er sett i begge antigener, er det et klart skifte mot høyere antigenkonsentrasjoner når man sammenligner foldvarianten med wild type rBet v 1 for samme prosentutgivelse. En standard måte å sammenligne forskjellen i prosent frigjøring av forskjellige antigener er å beregne konsentrasjonen av antigen som trengs for å oppnå halv maksimal frigjøring (B). Dette utføres vanligvis i biologiske replikeringer (testing av samme antigenområde for hvert allergen i forskjellige menneskelige sera). Vanligvis, for å trekke noen betydelige konklusjoner, utføres meglerutgivelsen med sera fra minst 8 til 10 forskjellige pasienter. Her er resultatene av fire forskjellige sera plottet som et eksempel. En parvis t-test ble brukt til statistisk analyse. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Potensielle spørsmål og feilsøking | Løsning |
| Analyse-til-analyse-variasjon på grunn av endret cellerespons | Pass på at cellepassasjesyklusnummeret ikke overstiger 20 til 30 passasjer. Lag frosne lagre ved tidlige passasjer for fremtidige eksperimenter. |
| Heller stole på biologiske replikeringer (bruk av forskjellige sera) enn tekniske. | |
| Sera inneholder lave nivåer av spesifikk IgE | En lavere endelig serumfortynning kan brukes (dvs. 1:10) i stedet for 1:20. På den annen side kan sera som inneholder høye nivåer av spesifikk IgE fortynnes ytterligere (1:30 eller 1:40). |
| Ikke nok celler til å utføre analysen | Pass på at samløpet i en T-75 kolbe er rundt 50-90%. Passasje flere kolber. |
| Cytotoksiske effekter av sera, dvs. | Utfør en celle levedyktighetsanalyse i tillegg til mediatorutgivelsesanalysen. Øk Ag8-konsentrasjonen for å unngå ufullstendig komplementinaktivering. |
| Lavt signal | Forbedre signal-til-støy-forholdet mellom analysen ved å fortynne 1x Tyrodes buffer i deuteriumoksid (D2O) i stedet for dH2O, eller ved å bruke en sera med høyere nivåer av spesifikk IgE for allergenet av interesse. |
| Allergenet er ikke stabilt i Tyrodes buffer (f.eks. nedbør) | Gjør stabilitetstester i 1x Tyrodes buffer før analyseprosedyren. Det anbefales ikke å bytte ut Tyrodes buffer. |
| Problemer med å finne riktig startkonsentrasjon for det respektive allergenet | Tilpasning av fortynningsserier for å dekke hele utløserkurven (flere fortynningstrinn, 1:20 fortynning i stedet for 1:10). |
| Dårlig analyseytelse indikert med lavt/ingen signal | Unngå cytotoksiske effekter fra enten sera eller antigenstimulering (f.eks. enzymatiske allergener). Vask og suge cellene forsiktig. Unngå lufteksponering for lenge og forhindre at celler tørker ut. |
| Hvordan vet jeg om det nederste signalplatået nås? | Legg til "ingen antigen" kontroller på tallerkenen din. Disse er sensibilisert celle, som bare ble stimulert med 1x Tyrodes buffer, men uten allergen. |
| Trenger jeg positiv kontroll i tillegg til de maksimale lysisbrønnene? | Som ekstra positiv kontroll kan en serum- og antigenkombinasjon kjent for å forårsake degranulering brukes eller et anti-FcεR1 antistoff. |
| Hvor mange brønner trenger jeg? | Det avhenger av titreringsserien din, antall antigener og sera du vil analysere. Planlegg oppsettet for 96-brønnsplatene i henhold til hvor mange sera / antigener du skal teste. Ikke glem å legge til "ingen antigenkontroller", bakgrunnscellene (ikke-sensibilisert, ikke-stimulert) samt de maksimale lysisbrønnene. |
| Hvor mange sera bør jeg teste? Og trenger jeg replikeringer? | Selv om analysen er ganske robust, er det en viss analyse-til-analysevariabilitet på grunn av endret cellerespons. Derfor anbefales det å heller stole på biologiske replikeringer (ved hjelp av annen sera) enn på tekniske replikeringer. Minimum åtte forskjellige sera er tilstrekkelig til å analysere allergener. Som vist i Fig. 4B, kan imidlertid betydelige resultater allerede oppnås ved hjelp av mindre sera. |
Tabell 1: Feilsøking.
Discussion
Den heri beskrevne huRBL cellebaserte meglerutgivelsesanalysen er en robust metode som enkelt kan utføres og implementeres i ethvert laboratorium. Det eneste kravet er at celler må dyrkes under sterile forhold. Analysen brukes til å vurdere sannsynligheten for et allergen eller allergifremkallende kilde for å fremkalle pasientens IgE-krysskobling og basofil degranulering17. Analysen kan lett tilpasses ethvert allergen eller allergifremkallende kilde så lenge pasientens serum med et høyt nivå av spesifikk IgE, som gjenkjenner allergenet av interesse, er tilgjengelig. Det anbefales å utføre en celle levedyktighetsanalyse i tillegg til mediatorutgivelsesanalysen for å ta hensyn til potensielle cytotoksiske effekter som kan føre til dårlig analyseytelse. Dette kan skyldes ufullstendig komplement-inaktivering av sera eller andre serum-avledede cytotoksiske effekter. Selv antigenet selv, for eksempel på grunn av proteolytisk / enzymatisk aktivitet, kan skade huRBL-cellene. Vi bruker vanligvis en celle levedyktighetsanalyse med MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) for å evaluere potensielle cytotoksiske effekter. Analysen kan enkelt utføres med huRBL-cellene igjen etter at celle supernatanten ble samlet inn og overført (se trinn 6.3. i protokollen). Sammenlignet med andre immunkjemiske metoder, som ELISAer og vestlig blotting, for å bestemme det allergifremkallende potensialet til enten individuelle allergener eller komplekse ekstrakter basert på allergen-IgE-binding, kan denne analysen oppdage ikke bare bindingen av IgE til et allergen, men kan også måle funksjonaliteten til både menneskelig IgE og allergenet, for å provosere IgE-mediert basofil degranulering18. Dermed kan det hjelpe til med å studere alvorlighetsgraden av allergiske symptomer ex vivo ved hjelp av pasientens sera. Analysen rapporteres å være mer konsistent og effektiv enn de klassiske passive kutane anafylaksitestene siden analysen benytter RBL-2H3-cellene, som er relativt enkle å håndtere og produserer mindre variasjon i resultater sammenlignet med primærceller, for eksempel mastceller eller menneskelige basofiler19,20. I tillegg til dette gir analysen en god representasjon av allergenenes biologiske aktivitet og kan nøyaktig estimere det totale allergeninnholdet i et gitt komplekst utvalg3. Hvis du vil feilsøke bestemte trinn i protokollen, kan du se tabell 1.
Når det gjelder anvendelsen av denne versjonen av meglerutgivelsesanalysen, har den for det meste blitt brukt til forskningsformål, men også for standardisering av allergifremkallende ekstrakter basert på deres biologiske aktivitet. Dette inkluderer analyse av forskjellige partier av SPT-løsninger, provokasjonstestløsning, samt ekstrakter som brukes til allergenspesifikk immunterapi; som vist for pollen, katt dander, husstøvmite og peanøttekstrakter, samt bie gift3,17,21. Teknikken kan brukes spesielt ved diagnostisering av matallergier, da den kan oppdage selv minimale mengder allergifremkallende bestanddeler i komplekse matvarer som peanøtter, melk, hvete og egg22. I denne forbindelse er det også rapportert som et verdifullt verktøy for vurdering av allergifremkallende dyrefôrallergener, som tropomyosiner, og kan bidra til å skille potente allergener fra ikke-allergener23. Som et forskningsverktøy brukes analysen til å studere effekten av matbehandling samt å evaluere påvirkningen av ligandbinding til allergener og dens effekt på allergifremkallende24,25. For eksempel ble bindingen av Bet v 1 til ligander vist å ikke påvirke allergen-IgE krysskobling, selv om det forårsaket en økning i sin termiske og proteolytiske stabilitet25. Analysen kan brukes til å sammenligne pasientens reaktivitet med mindre og store allergener, samt å undersøke kryssreaktivitet av allergen homologer og isoformer, som vist i vårt eksempel ved hjelp av Bet v 1 og det homologe matallergenet Cor a 1 (figur 3). Når det gjelder allergenisoformer, ble meglerutgivelsesanalysen brukt til å identifisere det store allergenet Amb a 1,01 som den mest potente IgE-reaktive isoformen i ragweed pollen (Ambrosia artemisiifolia). Til sammenligning viste de to andre identifiserte isoformene i ragweed pollenekstrakter, Amb a 1,02 og Amb a 1,03, redusert reaktivitet til pasientenes IgE26.
I de senere år har analysen blitt brukt til å studere potensielle antiallergiske forbindelser og nye hypoallergene varianter av allergener, som bidrar til identifisering av egnede kandidater for allergenspesifikk immunterapi27,28. En annen ny tilnærming er å bruke analysen til å overvåke behandlingseffekten i løpet av allergenspesifikk immunterapi. I denne forbindelse utviklet vår forskningsgruppe et huRBL-analysehemmingssystem, som korrelerte godt med reduksjonen av pasientens symptomscore under allergenspesifikk immunterapi29. Analysen er også foreslått for å studere de immundempende effektene av TGFβ1 på allergenindusert IgE-mediert degranulering30.
Begrensningene i analysen er at selv om huRBL-cellene har noen egenskaper av mastceller eller basofiler, etterligner de ikke helt den naturlige funksjonen til disse effektorcellene. For eksempel uttrykker mastceller mye mønstergjenkjenningsreseptoren Toll-lignende reseptor 4 (TLR4), som er nødvendig for patogengjenkjenning, mens den er helt mangelfull i RBL-2H3-cellene31. På grunn av denne forskjellen i funksjonalitet etterligner ikke analysen fullt ut den virkelige situasjonen, som må huskes når du tolker dataene. I tillegg, siden huRBL-cellene er kreftbasofile celler, kan endringer i kulturforhold og langvarig dyrking føre til fenotypiske forskjeller som fører til endrede resultater blant forskjellige laboratorier20. Et annet aspekt er valget av allergenkonsentrasjon som må tas i betraktning når du tilpasser denne metoden, siden høye allergenkonsentrasjoner kan resultere i ikke-IgE mediert degranulering på grunn av tilstedeværelsen av høye mengder proteaser eller endotoksiner18. Andre begrensninger er avhengigheten av menneskelig sera med relativt høye spesifikke IgE-nivåer (RAST klasse 5-6), og behovet for cellekultursystemer, som fortsatt er et hinder som må overvinnes for å implementere teknikken i den daglige kliniske rutinen.
Bortsett fra disse begrensningene, representerer huRBL-analysen et verdifullt forskningsverktøy for diagnostisering og behandling av allergiske sykdommer og kan brukes i et bredt spekter av applikasjoner.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke professor Dr. Stefan Vieths ved Institutt for molekylær allergologi, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Tyskland, for å ha gitt de humaniserte/FcεRI-transfiserte RBL-cellene og for å ha gitt sitt samtykke til å skrive denne forskningsmetodikkartikkelen. Vi vil takke prof. Dr. Fatima Ferreira for å gi gode tilbakemeldinger. Vi vil videre takke prof. Dr. Ronald van Ree og Dr. Jaap Akkerdaas ved Institutt for eksperimentell immunologi, Amsterdam University Medical Centers, plassering AMC, Amsterdam, Nederland, for å gi sitt samtykke til å publisere representative data gitt i dette metodenotatet, som ble generert i løpet av prosjektet BM4SIT - innovasjoner for allergi (www.BM4SIT.eu). Forfatternes arbeid har blitt støttet av Det østerrikske vitenskapsfondet (Prosjekt P32189), av Universitetet i Salzburgs prioriterte program Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, av doktorgradsprogrammet Immunitet i kreft og allergi-ICA finansiert av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF W01213), og av BM4SIT-prosjektet (tilskuddsnummer 601763) fra EUs syvende rammeprogram FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
