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Immunology and Infection

मानवीकृत मध्यस्थ रिलीज परख के रूप में एक पढ़ें एलर्जी शक्ति के लिए बाहर

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62702
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biosciences, University of Salzburg

Summary

यहां हम मध्यस्थ रिलीज परख पेश करते हैं, मानव आईजीई रिसेप्टर से संक्रमित चूहे बेसोफिलिक ल्यूकेमिया सेल लाइन का उपयोग करके, आमतौर पर टाइप 1 एलर्जी प्रतिक्रियाओं में देखे जाने वाले प्रभावक कोशिकाओं के डीग्रानुलेशन का अनुकरण करने के लिए। यह विधि एलर्जी की जैविक गतिविधि को अत्यधिक संवेदनशील, प्रजनन योग्य और सिलाई तरीके से जांचती है।

Abstract

मध्यस्थ रिलीज परखें विट्रो इम्यूनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) में विश्लेषण करती हैं- मध्यस्थता डेग्रेशन और इम्सेक्टर कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थों के स्राव, जैसे मस्तूल कोशिकाएं और बासोफिल, ख्यात एलर्जी के धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ उत्तेजना पर। इसलिए, ये परख एक आवश्यक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं जो वीवो डिग्रेशन प्रक्रिया की नकल करता है, जो संवेदनशील रोगियों में या त्वचा चुभन परीक्षणों में एलर्जी के संपर्क पर होता है। इसके अतिरिक्त, इन परखों को आमतौर पर प्रोटीन की एलर्जी क्षमता और रोगियों की सेरा की प्रतिक्रियाशीलता की जांच करने के लिए नियोजित किया जाता है । इसके साथ- इसके साथ, हम एक अमर चूहे बेसोफिल ल्यूकेमिया सेल लाइन का उपयोग करके एक साधारण 2-दिवसीय प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो मानव उच्च-आत्मीयता आईजीई प्लाज्मा-झिल्ली रिसेप्टर (एफसीεआरआई) के साथ संक्रमित और मानवीकृत है। मध्यस्थ रिलीज परख का यह संस्करण ठोस मैट्रिस के लिए एंटीजन को स्थिर करने की आवश्यकता के बिना एक मजबूत, संवेदनशील और प्रजनन योग्य इन विट्रो सेल-आधारित प्रणाली है। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) मानव सेरा की निष्क्रियता, (2) कोशिकाओं की कटाई, सीडिंग और निष्क्रिय संवेदीकरण, (3) एंटीजन के साथ उत्तेजना मध्यस्थ रिहाई का कारण बनती है, और (4) जारी भड़काऊ मध्यस्थों के लिए किराए के रूप में β-हेक्सामिनिरेसे गतिविधि को मापने, जैसे कि हिस्टामाइन। परख सेल डिग्रेशन को ट्रिगर करने के लिए एलर्जी-आईजीई क्रॉस-लिंकिंग की क्षमता का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है और एलर्जी अर्क को मानकीकृत करने के लिए लागू किया जा सकता है, मरीजों की प्रतिक्रियाशीलता की तुलना मामूली या प्रमुख एलर्जी और एलर्जिक अर्क (पराग, बिल्ली डैंडर, आदि) से करने के लिए, एलर्जी के मुताबिकलोगों, आइसोफॉर्म, और गुना-वेरिएंट (जैसे, हाइपोएलर्जिनिटी) की शक्ति की जांच करने के साथ-साथ एलर्जिक गतिविधि पर लिगांड के प्रभावों की तुलना करना। एक और हाल ही में आवेदन एलर्जी इम्यूनोथेरेपी के पाठ्यक्रम में उपचार प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए परख का उपयोग भी शामिल है।

Introduction

टाइप I अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएं, जो एक संबंधित एंटीजन के लिए विशिष्ट इम्यूनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) उत्पादन की विशेषता है, दुनिया की लगभग एक तिहाई आबादी को प्रभावित करती है। ये प्रतिक्रियाएं अस्थमा और राइनोकॉनजंक्टिवाइटिस जैसे कई एलर्जी अभिव्यक्तियों से जुड़ी हुई हैं और यहां तक कि प्रणालीगत जीवन-धमकी वाली प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकती हैं1। वीवो परीक्षणों के विपरीत, एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरेंट परख (एलिसा) जैसे इम्यूनोकेमिकल दृष्टिकोण एंटीबॉडी के लक्ष्य बाध्यकारी की जांच के लिए पूरी तरह से उपयुक्त हैं, लेकिन प्रोटीन के कार्यात्मक पहलू को संबोधित नहीं करते हैं जो तत्काल अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है। ठोस समर्थन (जैसे, एलिसा प्लेट्स) पर एलर्जी का स्थिरीकरण उनकी संरचनात्मक अखंडता में परिवर्तन और एलर्जी प्रासंगिकएपिटोप्स 2के विनाश का कारण बन सकता है। यहां तक कि त्वचा चुभन परीक्षण (एसपीटी), कुछ एलर्जी के खिलाफ संवेदीकरण की पुष्टि करने के लिए सबसे आम उपकरण, रोगसूचक आईजीई-मध्यस्थता खाद्य एलर्जी या एलर्जी उपलब्धता3,4का पता लगाने से संबंधित उनकी सीमाएं हैं। एलर्जी की जैविक शक्ति का परीक्षण करने के लिए एक नैतिक, अत्यधिक विशिष्ट, संवेदनशील और लागत प्रभावी विधि खोजने के लिए एक प्रकार मैं अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए, तथाकथित मध्यस्थ रिलीज परख स्थापित की गई है।

इन परखों का सिद्धांत संवेदीकरण चरण और आईजीई की साथ-साथ क्षमता के बाद की घटनाओं पर निर्भर करता है कि वे प्रभावकार कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किए गए उच्च-आत्मीयता रिसेप्टर्स की α-श्रृंखला से बांधें, जैसे मस्तूल कोशिकाएं और बासोफिल। आईजीई मुख्य रूप से म्यूकोसल से जुड़े लिम्फोइड ऊतक में प्लाज्मा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होता है। यद्यपि यह रक्त में सबसे कम प्रचुर मात्रा में इम्यूनोग्लोबुलिन (गैर-अटॉपिक व्यक्तियों में लगभग 0.05%) है, लेकिन इसके पास एलर्जी के लक्षणों का मुख्य कारण असाधारण रूप से उच्च जैविक गतिविधि है। आईजीई का आधा जीवन 2-3 दिनों से कई हफ्तों और यहां तक कि महीनों तक बढ़ सकता है जब प्रभावक कोशिकाओं पर इसके रिसेप्टर्स से बंधे होते हैं। दो रिसेप्टर-बाउंड आईजीई अणुओं के चर क्षेत्र में एंटीजन के बाद बाध्यकारी होने के बाद उनके क्रॉस-लिंकिंग हो जाते हैं जिसके बाद प्रभावक कोशिका में डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को शामिल किया जाता है जिससे डिग्रेंशन होता है और कई भड़काऊ मध्यस्थों की रिहाई होती है, जिससे वेसोडिलेशन होता है, जैसे हिस्टामाइन, सेरीन प्रोटीज (जैसे, ट्राइप्टास), और प्रोस्टैगलैंडिन5,67,और प्रोस्टैगलैंडिन्स। इंटरल्यूकिन 4 (आईएल-4) और आईएल-13 जैसे साइटोकिन्स का स्राव भड़काऊ टी हेल्पर 2 (टीएच 2) प्रतिक्रिया के रखरखाव और बी कोशिकाओं के कक्षा-स्विचन को आईजीई-उत्पादक प्लाज्मा कोशिकाओं5,8,9के रखरखाव के लिए जिम्मेदार है। दूसरी ओर, जारी थ्रोमबॉक्सेन ब्रोंकोकोकंस्ट्रक्शन का कारण बनता है, और ल्यूकोट्रिन चिकनी मांसपेशियों के संकुचन के साथ-साथ संवहनी रिसाव को उत्तेजित करते हैं, और वायुमार्ग सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जिससे अस्थमा या एलर्जी राइनाइटिस10,11होता है।

उपरोक्त मध्यस्थों के अधिकांश विश्लेषण के लिए अनुसंधान उपकरण स्थापित किया गया है, हालांकि कुछ प्रमुख नुकसान के साथ । ट्राइप्टाज़ परख मास्ट सेल एक्टिवेशन के माध्यम से प्रणालीगत एनाफिलैक्सिस के माप के लिए उपयुक्त नैदानिक दृष्टिकोण हैं लेकिन एलर्जी निदान में उनकी संवेदनशीलता और विशिष्टता एसपीटी जैसे सोने के मानक तरीकों की तुलना में बहुत गलत है। दूसरी ओर, सिस्टीनाइल ल्यूकोट्रिन का कहना है कि β-लैक्टम या गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाओं के लिए एलर्जी का निदान करने में सक्षम नहीं हैं12। एलर्जी प्रतिक्रियाओं में जारी एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में हिस्टामाइन के माप के लिए प्रोटोकॉल पहले से ही 1960 के दशक में स्थापित किए गए थे । एक बार परिधीय रक्त में जारी होने के बाद, हिस्टामाइन को तुरंत हिस्टामाइन मिथाइलट्रांसफेरेस द्वारा अपमानित किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप केवल कुछ मिनटों का प्लाज्मा आधा जीवन होता है, जिससे इसका विश्लेषण काफी चुनौतीपूर्ण13हो जाता है। इसकी अस्थिरता के अलावा, हिस्टामाइन की निगरानी में दवा एलर्जी के साथ-साथ वाणिज्यिक खाद्य प्रोटीन और ततैया विष12के लिए कम विशिष्टता और संवेदनशीलता दिखाई गई थी।

प्रभावक सेल लाइनों के साथ इन विट्रो मॉडल को रिलीज परख करने के लिए एलर्जी रोगियों से अलगाव और बेसोफिल की खेती की श्रम-गहन प्रक्रियाओं के विकल्प के रूप में पेश किया गया है। इसलिए, आरबीएल-2H3 सेल लाइन का उपयोग करके चूहा बेसोफिलिक ल्यूकेमिया-(आरबीएल-) आधारित परख3 स्थापितकी गई है। चूंकि यह सेल लाइन मानव आईजीई को बाध्यकारी करने में सक्षम नहीं है, इसलिए यह पहली बार मानव आईजीई प्लाज्मा-झिल्ली रिसेप्टर (एफसीεआरआई) की α-, β-और γ-श्रृंखला से संक्रमित थी। मानव α-श्रृंखला के अभिव्यक्ति के स्तर और एकरूपता के लिए कई क्लोन उत्पन्न और परीक्षण किए गए हैं, जिनमें से क्लोन आरबीएल-30/25 इन विट्रो परीक्षण के लिए सबसे होनहार उम्मीदवार के रूप में उभरा । ट्रांस संक्रमित क्लोन के रिसेप्टर सक्रियण पर प्रेरित सिग्नलिंग झरना कैल्शियम जुटाने परख के माध्यम से परीक्षण किया गया था। हिस्टामाइन रिलीज के लिए डिग्रेशन और सरोगेट के लिए एक संकेतक के रूप में, ग्लिसोसोमल एंजाइम β-हेक्सोमिनिडास मापा गया था, जिसमें उच्च स्थिरता का महत्वपूर्ण लाभहै 14। RBL-30/25 कोशिकाओं का उपयोग कर मध्यस्थ रिलीज १००% तक पहुंचता है और इसलिए, एलर्जी रोगियों से प्राप्त सेरा का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । परख वाणिज्यिक एलर्जी अर्क के साथ संवेदनशील कोशिकाओं को चुनौती देने के बाद मध्यस्थ रिहाई के लिए परीक्षण किया गया था । इससे यह निष्कर्ष आया कि विभिन्न निर्माताओं से प्राप्त एलर्जी अर्क की संरचना (कुल प्रोटीन सामग्री के बारे में 60 गुना तक) में जबरदस्त भिन्नता है और इसका उपयोग नैदानिक (जैसे, एसपीटी) या चिकित्सीयदृष्टिकोण3,15, 16के लिए कियाजाताहै।

इसके साथ ही, हम एलर्जी दाताओं से सीरम का उपयोग करके मध्यस्थ रिलीज परख करने के लिए आरबीएल प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। निष्क्रिय संवेदीकरण के दौरान, सीरम में आईजीई को बासोफिलिक कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त उच्च आत्मीयता FcεR1 रिसेप्टर द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। एंटीजन-उत्तेजना पर, एंटीजन के लिए विशिष्ट बाध्य आईजीई क्रॉस-लिंक्ड हैं, सेल डिग्रेंशन को ट्रिगर करते हैं और मध्यस्थ β-हेक्सोसामिनिडास की रिहाई होती है। β-हेक्सामिनिडास की गतिविधि को बाद में उपयुक्त सब्सट्रेट का उपयोग करके मापा जाता है। परख के लिए, huRBL-2H3 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, और निम्नलिखित प्रोटोकॉल में huRBL करार दिया। प्रोटोकॉल 1 μg/mL से 0.1 pg/ml एलर्जी से लेकर 8 कदम पतला 1:10 के साथ एक मानक एंटीजन कमजोर ताव श्रृंखला का वर्णन करता है ।

Protocol

बर्च पराग एलर्जी रोगियों से प्राप्त सेरा का उपयोग करने के लिए नैतिक अनुमोदन डच नैतिक समिति (अनुमोदन संख्या: NL65758.018.18) से प्राप्त किया गया था।

1. सुरक्षा प्रक्रियाएं

  1. प्रयोग के पहले दिन (बायोसेफ्टी लेवल 2) के दौरान जैविक सुरक्षा वर्ग 2 कार्यक्षेत्र का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में काम करें। मानव सीरम के उपयोग के लिए संस्था के सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।

2. मानव सीरा के पूरक निष्क्रियता

  1. कोशिका संस्कृति फ्लास्क से P3X63Ag8.653 कोशिकाओं (अब से Ag8 कोशिकाओं कहा जाता है) की एक घने संस्कृति फसल और उन्हें एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित।
    1. इन कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित संस्कृति माध्यम का उपयोग करें: कम सीरम एकाग्रता के साथ संशोधित ईगल्स के न्यूनतम आवश्यक माध्यम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० इकाइयों कलम,०.१ मिलीग्राम/mL Strep.), 5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा/गोजातीय सीरम (FCSi) ।
  2. कमरे के तापमान पर 250 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज Ag8 कोशिकाओं।
  3. एचआरबीएल माध्यम में लगभग 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल (अल्फा संशोधन के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल, 4 एम एल-ग्लूटामाइन, 5% एफसीएसआई, 1% G418 (100% स्टॉक: 10 ग्राम/125 एमएल डीएच2ओ) की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: भविष्य के उपयोग के लिए भी पासिंग करके Ag8 कोशिकाओं को बनाए रखें।
  4. Ag8 सेल निलंबन में तनु मानव सेरा 1:10। परख में अंतिम सीरम कमजोर पड़ने 1:20 होगा ।
    नोट: कम विशिष्ट IgE के साथ सेरा के लिए एक 1:5 (1:10 अंतिम कमजोर पड़ने) का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट और 5%-7% सीओ2।

3. एचयूआरबीएल कोशिकाओं की कटाई और सीडिंग

  1. एक टी-७५ सेल संस्कृति कुप्पी से माध्यम को ध्यान से हुर्बल कोशिकाओं को छूने के बिना (huRBL कोशिकाओं अनुयायी हैं) । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के आसपास 50%-90% ढुलमुल हैं ।
    नोट: सेल संगम के आधार पर, एक घने टी-७५ सेल संस्कृति फ्लास्क की सेल सामग्री आमतौर पर एक से दो ९६-अच्छी प्लेटों के लिए पर्याप्त है ।
  2. दुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 10 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को दो बार धोएं। फ्लास्क के विपरीत दिशा में डीपीबीएस जोड़ें और सीधे कोशिकाओं पर नहीं।
  3. डीपीबीएस को एस्पिरेट करें और सेल टुकड़ी के लिए प्री-वार्म्ड 1x ट्राइपसिन-ईडीटीए (0.05%/0.02% EDTA पतला डीपीबीएस में) के 5 एमएल जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फ्लास्क इनक्यूबेट।
  5. फ्लास्क को ध्यान से टैप करके अलग कोशिकाएं।
  6. सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्राइप्सिन-ईडीटीए को पतला करने के लिए एचआरबीएल माध्यम या डीपीबीएस से भरें।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  8. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सेल काउंटिंग के लिए एचयूआरबीएल माध्यम के 5 एमएल में गोली को फिर से रीसस्ट करें।
  9. कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एचआरबीएल माध्यम में पतला करें ।
  10. एक बाँझ 96-अच्छी तरह से प्लेट का प्रयोग करें और अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से huRBL सेल निलंबन के 50μL जोड़ें, जो 1 x 105 कोशिकाओं के बराबर है/

4. एचयूआरबीएल कोशिकाओं का निष्क्रिय संवेदीकरण

  1. 250 x gपर 5 मिनट के लिए पूर्व-इनक्यूबेटेड Ag8/सीरम निलंबन अपकेंद्रित्र करें।
  2. Ag8 सेल गोली को परेशान किए बिना प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त huRBL कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र Ag8/सीरम निलंबन के ५० μL स्थानांतरण ।
    1. कोई एंटीजन नियंत्रण शामिल है, जो संवेदनशील हैं, लेकिन अउत्सुरेटेड कोशिकाओं (एंटीजन जोड़ नहीं है), नीचे संकेत पठार के लिए एक संकेत के रूप में सेवारत/ पृष्ठभूमि और अधिकतम लाइसिस नियंत्रण कुओं को सीरम के साथ संवेदनशील बनाने की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय कुओं को नियंत्रित करने के लिए एचआरबीएल माध्यम का 50 माइक्रोन जोड़ें।
  3. ढक्कन के साथ प्लेट को कवर करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5%-7% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।

5. एंटीजन-उत्तेजित डेग्रेशन और मध्यस्थ रिलीज

  1. 1x टायरोड के बफर (9.5 ग्राम/एल टायरोड के साल्ट, 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.5 ग्राम/एल सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (नाएचको3)में एंटीजन कमजोर पड़ने की तैयारी पहले से डीएच2ओ में करें। 100 माइक्रोन प्रति कुएं की अंतिम राशि की आवश्यकता है।
    नोट: हर एलर्जी, या तो प्राकृतिक स्रोतों से शुद्ध या पुनर्संयोजन, 1x टायरोड के बफर में स्थिर हो सकता है। इसलिए, परख प्रक्रिया से पहले 1x टायरोड के बफर में स्थिरता परीक्षण करें। वैकल्पिक रूप से, परख के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) में 1x टायरोड का बफर पतला करें।
  2. प्रोटीन के या तो 10 या 1 μg/ml के साथ शुरू प्रतिक्रिया ट्यूबों में एक 1:10 कमजोर पड़ने श्रृंखला के ब्याज के एंटीजन के 8 कमजोर पड़ने बनाओ ।
    नोट: हमेशा पहले से कमजोर पड़ने श्रृंखला का परीक्षण करें। वैकल्पिक रूप से, पूर्ण रिलीज वक्र को कवर करने के लिए 1:10 कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला (जैसे, 1:5, 1:20, या 1:30) को अनुकूलित करें। इसके अलावा, प्रायोगिक सेटअप के आधार पर शुरुआती एकाग्रता भिन्न हो सकती है।
  3. 96-अच्छी प्लेट पर चढ़ाया huRBL कोशिकाओं को धोने के लिए, ध्यान से एस्पिरेशन, उलटा, और शोषक कागज पर थाली दोहन द्वारा पहले सेरा युक्त सेल माध्यम को हटा दें।
  4. 1x टायरोड्स के बफर के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोएं। सभी कुओं का इलाज इसी तरह करें।
    नोट: उन्हें परेशान न करने के लिए कोशिकाओं में धीरे-धीरे धोने का समाधान जोड़ें।
  5. इसे लगभग 30 एस के लिए छोड़ दें और कुल तीन बार वाशिंग चरण दोहराएं।
  6. अंतिम समय के लिए धोने के समाधान को जोड़ने के बाद, एंटीजन कमजोर पड़ने को जोड़ने के साथ जारी रखने के लिए तैयार होने तक कुओं में समाधान छोड़ दें।
    नोट: बहुत लंबे समय के लिए हवा के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से बचें ।
  7. पूर्व-संवेदनशील हुर्बल कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक कुएं में एंटीजन समाधान के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि कई अलग-अलग मापदंडों का विश्लेषण करते हैं, तो कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के व्यक्तिगत नमूनों को एक अतिरिक्त गैर-बाध्यकारी 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें (हुर्बल प्लेट पर समान लेआउट का उपयोग करें) और उन्हें बाद में सीधे एचआरबीएल सेल प्लेट पर एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ स्थानांतरित करें। इस तरह, बहुत लंबे समय के लिए हवा के लिए कोशिकाओं को उजागर से बचा जा सकता है, जो गरीब परख प्रदर्शन में परिणाम हो सकता है (कम/
  8. 1x टायरोड के बफर के 100 माइक्रोन के साथ नियंत्रण कुओं (अधिकतम लाइसिस और गैर-संवेदनशील पृष्ठभूमि कोशिकाओं) को कवर करें। एंटीजन के साथ इन नियंत्रण कुओं को उत्तेजित न करें।
    1. इसके अतिरिक्त, कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के संवेदनशील नो-एंटीजन कुओं में 1x टायरोड के बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें, जो डेटा विश्लेषण के दौरान संवेदनशील कोशिकाओं की एंटीजन-स्वतंत्र सहज रिहाई को ध्यान में रखने के लिए आवश्यक है।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस और 5%-7% सीओ2पर 1 घंटे के लिए एचआरबीएल कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

6. β-हेक्सामिनिडास गतिविधि का फ्लोरेसेंस माप

  1. कोशिकाओं को पूरी तरह से लाइसे करने और β-हेक्सोसेमिनिडास की 100% रिलीज प्राप्त करने के लिए अधिकतम लाइसिस नियंत्रण के कुओं को 10% ट्राइटन एक्स-100 प्रति अच्छी तरह से मिलाएं और ठीक से मिलाएं।
  2. एक नई गैर-बाध्यकारी 96-अच्छी प्लेट में सब्सट्रेट समाधान के 50 μL जोड़ें। एक 96-अच्छी प्लेट के लिए सब्सट्रेट समाधान: 0.1 एम साइट्रिक परख बफर, पीएच 4.5 का 5 एमएल; और 10 m m 4-मेथिलुबेलिफेरिल एन-एसिटिल-β-डी-ग्लूकोसिनाइड के ८० μL ।
  3. सब्सट्रेट समाधान युक्त नई प्लेट में सभी कुओं के सेल सुपरनेट के 50 माइक्रोन को स्थानांतरित करें।
    नोट: हुर्बल कोशिकाओं को बाधित न करने के लिए हुर्बल प्लेट से सुपरनेट सावधानी से पिपेट करें।
  4. फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के रूपांतरण की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सब्सट्रेट समाधान और सेल सुपरनेट के साथ प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता परख के लिए हुर्बल प्लेट रखें।
  5. रोकने के समाधान के १०० μL जोड़ें (15 ग्राम/एल ग्लाइसिन, ११.७ g/L NaCl dH2O, पीएच १०.७ में भंग) प्रति अच्छी तरह ।
  6. एक प्लेट रीडर का उपयोग करके 360 एनएम उत्तेजन और 465 एनएम उत्सर्जन पर फ्लोरेसेंस को मापें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. प्रतिशत रिलीज की बुनियादी गणना के लिए, किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  2. पृष्ठभूमि घटाव/बेसलाइन हटाने के लिए, अन्य सभी कुओं से पृष्ठभूमि कुओं के औसत घटाना ।
  3. अधिकतम लाइसिस कुओं के मतलब की गणना करें और प्रतिशत में कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के डेटा को व्यक्त करें। इस तरह कोई भी सेल लाइसिस के कारण अधिकतम एंजाइम रिलीज के लिए सामान्यीकृत सेल रिलीज के प्रतिशत के रूप में डेटा व्यक्त कर सकता है।
  4. पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया मध्यस्थ रिलीज घटता एक्स-एक्सिस पर लॉग ऑन और वाई-एक्सिस पर मध्यस्थ रिलीज के प्रतिशत पर एंटीजन एकाग्रता के साथ XY रेखांकन के रूप में सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।
  5. पृष्ठभूमि या नीचे के पठार को इंगित करने के लिए एक धराशायी रेखा के रूप में नो-एंटीजन नियंत्रण के मूल्यों को जोड़ें।
    नोट: इसी तरह इलाज सेरा कई इस सामान्यीकरण रणनीति का उपयोग कर तुलना की जा सकती है। सीधी तुलना के लिए, आधे अधिकतम रिलीज की गणना करने की सिफारिश की जाती है, जो एंटीजन एकाग्रता (एनजी/एमएल में) है जो अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों के औसत के रूप में परिभाषित आधे अधिकतम रिलीज के लिए आवश्यक है। आधा अधिकतम रिलीज को प्रोत्साहित करने के लिए एंटीजन एकाग्रता की गणना आधे अधिकतम रिलीज मूल्य के इंटरपोलेशन द्वारा एक लॉगरिथम प्रतिगमन रेखा में की जाती है।

Representative Results

मध्यस्थ रिलीज परख, huRBL कोशिकाओं(चित्रा 1A और बी)के आधार पर, एक घंटी के आकार की खुराक प्रतिक्रिया वक्र(चित्रा 1C)में परिणाम है । सरलीकृत डेटा प्रतिनिधित्व के लिए, आधे अधिकतम मध्यस्थ रिलीज के लिए आवश्यक एंटीजन एकाग्रता की गणना रैखिक प्रतिगमन(चित्रा 1डी)का उपयोग करके की जा सकती है। एक कोशिका व्यवहार्यता परख या तो संवेदीकरण सीरम या उत्तेजना के लिए इस्तेमाल एंटीजन(चित्रा 1E)से प्राप्त साइटोटॉक्सिक प्रभाव को बाहर करने के लिए किया जाता है । परख का उपयोग एक निश्चित एंटीजन के लिए विभिन्न सेरा की प्रतिक्रियाशीलता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हमारे मामले में, 5 में से 4 सीरा, बर्च पराग एलर्जी रोगियों से व्युत्पन्न, शर्त वी 1 उत्तेजना का जवाब दिया। सीरम #1 ने सबसे ज्यादा मीडिएटर रिलीज(चित्रा 2) दिखाया। सीरम #5 ने बेट वी 1 उत्तेजना का जवाब नहीं दिया और इस प्रकार, अन्य बर्च पराग एलर्जी (जैसे, बेट वी 2, प्रोफिलिन) पर प्रतिक्रिया हो सकती है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि बेट वी 1 आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी लक्षणों के लिए जिम्मेदार एक शक्तिशाली एलर्जी है। एचयूआरबीएल परख का उपयोग करके, आईजीई की समरूप एलर्जी के पार-प्रतिक्रियाशीलता का आकलन किया जासकता है (चित्र 3)। यहां, दोनों बर्च पराग एलर्जी रोगियों बेट वी 1 को अच्छी तरह से जवाब दिया, जबकि केवल रोगी #2 भी कोर एक 1, शर्त वी 1-अक्षजुआ खाद्य एलर्जी हेज़लनट्स में पाया जवाब दिया । इन आंकड़ों के आधार पर, रोगी #2 सबसे अधिक संभावना है Cor रोगी #1 की तुलना में एक 1-पार प्रतिक्रियाशील IgE स्तर, अखरोट की खपत पर मौखिक एलर्जी के लक्षण में जिसके परिणामस्वरूप । यहां तक कि एलर्जी (कम शक्ति) के उत्परिवर्ती वेरिएंट की हाइपोएलर्जेनिक प्रकृति के आकलन का विश्लेषण किया जा सकता है और उनके जंगली प्रकार के समकक्ष(चित्रा 4) कीतुलना में। प्रदान किए गए उदाहरण में, फोल्ड संस्करण का रिलीज वक्र जंगली प्रकार के एलर्जी की तुलना में उच्च एंटीजन एकाग्रता की ओर स्थानांतरित हो गया, जिसके परिणामस्वरूप आधा अधिकतम रिलीज(चित्रा 4B)को भड़काने के लिए आवश्यक एंटीजन की काफी अधिक एकाग्रता हुई। इन आंकड़ों का मतलब है कि उत्पन्न उत्परिवर्ती/गुना संस्करण जंगली प्रकार के प्रोटीन की तुलना में कम एलर्जिक है । आईजीई-मध्यस्थता डेग्रेशन को ट्रिगर करने के लिए यह कम शक्ति गुना संस्करण के हाइपोएलर्जेनिक चरित्र पर प्रकाश डालती है। इस परख के आधार पर, गुना संस्करण एलर्जी-विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी के लिए एक दिलचस्प उम्मीदवार है क्योंकि यह उपचार के दौरान आईजीई से जुड़े दुष्प्रभावों को कम कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:मानवीय आरबीएल कोशिकाएं और आईजीई-एलर्जेन क्रॉस-लिंकिंग-प्रेरित β-हेक्सोसेनिडास रिलीज के प्रतिनिधि घंटी के आकार का वक्र। आरबीएल कोशिकाएं संस्कृति फ्लास्क के अनुयायी हैं, जो उन्हें रॉड जैसी आकृति प्रदान करती हैं क्योंकि वे खुद को संलग्न करने की कोशिश कर रहे हैं(ए)। कोशिकाओं को काटा जाने के लिए संगम का एक आदर्श स्तर 90%(बी)से अधिक नहीं है। कोशिकाओं को क्रमशः 40x और 10x के आवर्धन के तहत दिखाया जाता है। कोशिकाओं है कि एक बर्च पराग एलर्जी व्यक्ति के मानव सीरम के साथ संवेदनशील थे recombinant शर्त v 1 (rBet v 1), प्रमुख बर्च पराग एलर्जी(सी)के साथ चुनौती पर प्रतिक्रिया । मध्यस्थ रिलीज के लिए किराए के रूप में, β-हेक्सामिनिडास गतिविधि सेल सुपरनेटेंट में मापा जाता है। बेल के आकार का वक्र एलर्जी की अधिकता के कारण आईजीई पर एंटीजन एपिटोप्स के मोनोवेलेंट व्यवसाय से परिणाम देता है, जो प्रतिस्पर्धी रूप से उच्च एंटीजन सांद्रता पर एलर्जी-आईजीई क्रॉस-लिंकिंग को रोकता है। उच्च एलर्जी सांद्रता पर कम रिलीज के लिए एक और स्पष्टीकरण अतिरिक्त एंटीजन की उपस्थिति में इंट्रासेलुलर रास्तों का अवरोध है। आधा अधिकतम रिलीज प्राप्त करने के लिए आवश्यक एलर्जी एकाग्रता के निर्धारण के लिए, मध्यस्थ रिलीज वक्र की ढलान के रैखिक भाग का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रयोगात्मक मूल्यों के आधार पर एक लॉगरिथम प्रतिगमन रेखा का उपयोग किया गया था(डी)। लाल बिंदीदार रेखा गणना के लिए उपयोग की जाने वाली लॉगरिथम प्रतिगमन रेखा का प्रतिनिधित्व करती है। प्रतिगमन रेखा का सूत्र लाल रंग में दिखाया गया है। आधा अधिकतम रिलीज के रूप में परिभाषित किया गया है: आधा अधिकतम रिलीज = (ंयूनतम रिलीज मूल्य + अधिकतम रिलीज मूल्य)/2 । उदाहरण में, गणना की गई आधी अधिकतम रिलीज 20.6% थी। इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि मानव सीरम को हुर्बल कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन के लिए 1:20 पतला किया गया था, और उत्तेजना के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीजन एकाग्रता 100 माइक्रोग्राम/एमएल से लेकर बेट वी 1 के 0.004 pg/ml तक थी। एक कोशिका व्यवहार्यता परख, इस मामले में एक एमटीटी परख, एंटीजन उत्तेजना के बाद शेष कोशिकाओं के साथ किया गया था ताकि संवेदीकरण सीरम के प्रभाव का आकलन किया जा सके और साथ ही सेल व्यवहार्यता और सेल काउंट(ई)पर एंटीजन कमजोर पड़ने का आकलन किया जा सके। अनुपचारित पृष्ठभूमि कोशिकाओं और लाइसेड कोशिकाओं (अधिकतम लाइसिस) को बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:पांच अलग-अलग मानव सीरा के β-हेक्सोसेमिनिडास प्रतिशत रिलीज के प्रतिनिधि घटता। आरबेट वी 1 की एक ही एंटीजन एकाग्रता रेंज को एचआरबीएल कोशिकाओं के साथ किया गया था जिन्हें विभिन्न बर्च पराग के सेरा के साथ संवेदनशील किया गया था। उनके लक्षणों की गंभीरता के अनुरूप विभिन्न रोगियों के बीच प्रतिशत रिहाई का एक स्पष्ट अंतर है। ध्यान दें कि रोगी #5 प्रमुख बर्च पराग एलर्जेन बेट वी 1 के लिए अट्रैक्टिव है। इन मध्यस्थ रिलीज घटता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सभी पांच मानव सेरा को हुर्बल कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन के लिए समान रूप से 1:20 पतला किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:बर्च पराग के सेरा से प्राप्त आईजीई की क्रॉस-रिएक्टिविटी बेट वी 1 समरूप हेज़लनट एलर्जेन कोर ए 1 के साथ रोगियों को संवेदनशील बनाता है। बर्च पराग के प्रति संवेदनशील रोगियों के दो प्रतिनिधि सीरा बेट वी 1 के साथ-साथ समरूप एलर्जी कोर ए 1 के लिए कम डिग्री तक दृढ़ता से प्रतिक्रिया करते हैं। रोगी 2 कोर ए 1 के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया दिखाता है, और इस प्रकार रोगी 1 की तुलना में हेज़लनट खपत पर मौखिक एलर्जी के लक्षणों का प्रदर्शन करेगा जहां मध्यस्थ रिलीज लगभग नगण्य है। बिंदीदार रेखा नो-एंटीजन नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करती है, जो मानव सेरा के साथ संवेदनशील कोशिकाएं हैं, लेकिन एलर्जी के साथ उत्तेजित नहीं होती हैं, और इस प्रकार, नीचे संकेत पठार/पृष्ठभूमि के लिए संकेत के रूप में कार्य करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:rBet v 1 जंगली प्रकार और एक हाइपोएलर्जेनिक गुना-संस्करण के बीच प्रतिशत रिलीज की तुलना। एक बर्च पराग-संवेदीकरण व्यक्ति के एक ही सीरम को आरबेट वी 1 जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और प्रमुख बर्च पराग एलर्जी(ए)के हाइपोएलर्जेनिक गुना-संस्करण के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। हालांकि मध्यस्थ रिलीज दोनों एंटीजन में देखा जाता है, वहां उच्च एंटीजन सांद्रता की ओर एक स्पष्ट बदलाव है जब एक ही प्रतिशत रिलीज के लिए जंगली प्रकार rBet v 1 के लिए गुना संस्करण की तुलना । विभिन्न एंटीजन के प्रतिशत रिलीज में अंतर की तुलना करने का एक मानक तरीका आधा अधिकतम रिलीज(बी)प्राप्त करने के लिए आवश्यक एंटीजन की एकाग्रता की गणना कर रहा है। यह आमतौर पर जैविक प्रतिकृति (विभिन्न मानव सेरा में प्रत्येक एलर्जी के लिए एक ही एंटीजन रेंज का परीक्षण) में किया जाता है। आमतौर पर, किसी भी महत्वपूर्ण निष्कर्ष को आकर्षित करने के लिए, मध्यस्थ रिलीज कम से कम 8 से 10 विभिन्न रोगियों से सीरा के साथ किया जाता है। यहां चार अलग-अलग सीरा के परिणाम एक उदाहरण के तौर पर प्लॉट किए जाते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक युग्मित टी-परीक्षणका उपयोग किया गया था। * पी ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; पी ≤ 0.001; पी ≤ 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

संभावित प्रश्न और समस्या निवारण घोल
परख से परख परिवर्तनशीलता परिवर्तनशीलता के कारण बदल सेल जवाबदेही सुनिश्चित करें कि सेल पैसेज साइकिल संख्या 20 से 30 मार्ग से अधिक नहीं है। भविष्य के प्रयोगों के लिए प्रारंभिक मार्ग पर जमे हुए स्टॉक बनाओ ।
बल्कि तकनीकी लोगों की तुलना में जैविक प्रतिकृति (विभिन्न सेरा का उपयोग) पर भरोसा करें।
सेरा विशिष्ट आईजीई के निम्न स्तर होते हैं 1:20 के बजाय एक कम अंतिम सीरम कमजोर पड़ने (यानी 1:10) का उपयोग किया जा सकता है। इसके विपरीत, विशिष्ट आईजीई के उच्च स्तर वाले सेरा को और पतला किया जा सकता है (1:30 या 1:40)।
परख करने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं नहीं सुनिश्चित करें कि एक टी-७५ फ्लास्क में उदारता 50-90% के आसपास है । अधिक फ्लास्क मार्ग।
सेरा के साइटोटॉक्सिक प्रभाव, यानी अधूरे पूरक-निष्क्रियता के कारण मध्यस्थ रिलीज परख के अलावा एक सेल व्यवहार्यता परख प्रदर्शन करते हैं। अपूर्ण पूरक- निष्क्रियता से बचने के लिए AG8 एकाग्रता बढ़ाएं।
कम सिग्नल डीएच2ओ के बजाय ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) में 1x टायरोड के बफर को कमजोर करके या ब्याज की एलर्जी के लिए विशिष्ट आईजीई के उच्च स्तर के साथ एक सेरा का उपयोग करके परख के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करें।
एलर्जेन टायरोड के बफर (जैसे वर्षा) में स्थिर नहीं है परख प्रक्रिया से पहले 1x टाइरोड के बफर में स्थिरता परीक्षण करें। टायरोड के बफर के प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं की जाती है।
संबंधित एलर्जी के लिए सही शुरुआत एकाग्रता खोजने में समस्याएं पूर्ण रिलीज वक्र (अधिक कमजोर पड़ने चरण, 1:20 1:10 के बजाय कमजोर पड़ने) को कवर करने के लिए कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का अनुकूलन।
खराब परख प्रदर्शन कम/कोई संकेत द्वारा संकेत दिया या तो सीरा या एंटीजन उत्तेजना (जैसे एंजाइमेटिक एलर्जी) से साइटोटॉक्सिक प्रभावों से बचें। कोशिकाओं को ध्यान से धोकर भिगो दें। बहुत लंबे समय तक हवा के संपर्क में आने से बचें और कोशिकाओं को सूखने से रोकें।
मुझे कैसे पता चलेगा कि नीचे सिग्नल पठार पहुंच गया है? अपनी थाली में "कोई एंटीजन" नियंत्रण जोड़ें। ये संवेदनशील सेल हैं, जिन्हें केवल 1x टायरोड के बफर के साथ उत्तेजित किया गया था लेकिन एलर्जी के बिना।
क्या मुझे अधिकतम लाइसिस कुओं के अलावा सकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता है? अतिरिक्त सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक सीरम और एंटीजन संयोजन जिसे डीग्रेंगुलेशन का कारण बनने के लिए जाना जाता है, इसका उपयोग किया जा सकता है या एक एंटी-एफसीεआर1 एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।
मुझे कितने कुओं की आवश्यकता है? यह आपकी टिटरेशन श्रृंखला, एंटीजन और सीरा की संख्या पर निर्भर करता है जिसका आप विश्लेषण करना चाहते हैं।  96-वेल प्लेट्स के लिए लेआउट की योजना बनाएं कि आप कितने सेरा/एंटीजन टेस्ट करने जा रहे हैं । "नो एंटीजन कंट्रोल्स", पृष्ठभूमि कोशिकाओं (गैर-संवेदनशील, गैर-उत्तेजित) के साथ-साथ अधिकतम लाइसिस कुओं को जोड़ना न भूलें।
मुझे कितने सीरा का परीक्षण करना चाहिए? और क्या मुझे प्रतिकृति की आवश्यकता है? हालांकि परख काफी मजबूत है, वहां कुछ परख से परख परिवर्तनशीलता बदल सेल जवाबदेही के कारण है । इसलिए, तकनीकी प्रतिकृति की तुलना में जैविक प्रतिकृति (विभिन्न सेरा का उपयोग करके) पर भरोसा करने की सिफारिश की जाती है। एलर्जी का विश्लेषण करने के लिए न्यूनतम आठ अलग-अलग सेरा पर्याप्त है। हालांकि, जैसा कि अंजीर 4B में दिखाया गया है, कम सेरा का उपयोग करके महत्वपूर्ण परिणाम पहले से ही प्राप्त किए जा सकते हैं।

तालिका 1: समस्या निवारण।

Discussion

इसके साथ वर्णित huRBL सेल आधारित मध्यस्थ रिलीज परख एक मजबूत तरीका है कि आसानी से प्रदर्शन किया जा सकता है और किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है । एकमात्र आवश्यकता यह है कि कोशिकाओं को बाँझ परिस्थितियों में खेती करने की आवश्यकता है । परख का उपयोग मरीजों के आईजीई-क्रॉसलिंकिंग और बेसोफिल डिग्रेशन17को पैदा करने के लिए एलर्जी या एलर्जिक स्रोत की संभावना का आकलन करने के लिए किया जाता है। परख आसानी से किसी भी एलर्जी या एलर्जी स्रोत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जब तक कि रोगी के सीरम विशिष्ट आईजीई के उच्च स्तर के साथ, ब्याज की एलर्जी को पहचानने के लिए उपलब्ध है। किसी भी संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों के लिए खाते में मध्यस्थ रिलीज परख के अलावा सेल व्यवहार्यता परख करने की सिफारिश की जाती है जिसके परिणामस्वरूप खराब परख प्रदर्शन हो सकता है। यह सीरा या अन्य सीरम-व्युत्पन्न साइटोटॉक्सिक प्रभावों के अधूरे पूरक-निष्क्रियता के कारण हो सकता है। यहां तक कि एंटीजन ही, उदाहरण के लिए, प्रोटियोलिटिक/एंजाइमेटिक गतिविधि के कारण, हुर्बल कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । हम आमतौर पर संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एमटीटी (3-(4,5-डिमेथिल्थियाजोल-2-आईएल)-2,5-डिफेनिल्टेट्राजोलम ब्रोमाइड के साथ सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग कर रहे हैं। परख आसानी से सेल सुपरनैंट एकत्र और स्थानांतरित किया गया था के बाद छोड़ दिया huRBL कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है (प्रोटोकॉल के चरण 6.3. देखें) । एलर्जेन-आईजीई बाइब्लूजन के आधार पर व्यक्तिगत एलर्जी या जटिल अर्क की एलर्जी क्षमता का निर्धारण करने के लिए, एलिसा और पश्चिमी ब्लॉटिंग जैसे अन्य इम्यूनोकेमिकल तरीकों की तुलना में, यह परख न केवल आईजीई की बाध्यकारी एलर्जी का पता लगा सकती है बल्कि आईजीई-मध्यस्थता बेसोफिल डिग्रेशन 18 को भड़काने के लिए आईजीई-मध्यस्थता बेसोफिल डिग्रेंगुलेशन 18 को भड़काने के लिए आईजीई-मध्यस्थता बेसोफिल डिग्रेशन18को भड़काने के लिए न केवल आईजीई की कार्यक्षमता को माप सकती है। इस प्रकार, यह मरीजों के सेरा का उपयोग कर पूर्व वीवो एलर्जी लक्षणों की गंभीरता का अध्ययन करने में सहायता कर सकता है । परख को शास्त्रीय निष्क्रिय क्यूटनेस एनाफिलैक्सिस परीक्षणों की तुलना में अधिक सुसंगत और कुशल बताया गया है क्योंकि परख आरबीएल-2H3 कोशिकाओं का उपयोग करती है, जो प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में परिणामों में कम परिवर्तनशीलता को संभालने और उत्पादन करने में अपेक्षाकृत आसान हैं, जैसे मस्तूल कोशिकाएं या मानव बासोफिल19,20। इसके अलावा, परख एलर्जी की जैविक गतिविधि का एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और किसी दिए गए जटिल नमूने3में कुल एलर्जी सामग्री का सटीक अनुमान लगा सकता है। प्रोटोकॉल में कुछ कदमों की समस्या निवारण के लिए कृपया तालिका 1का उल्लेख करें ।

मध्यस्थ रिलीज परख के इस संस्करण की प्रयोज्यता के बारे में, यह ज्यादातर अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी उनकी जैविक गतिविधि के आधार पर एलर्जी अर्क के मानकीकरण के लिए । इसमें एसपीटी समाधानों के विभिन्न बैचों, उकसावे परीक्षण समाधान के विश्लेषण के साथ-साथ एलर्जी-विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी के लिए उपयोग किए जाने वाले अर्क शामिल हैं; जैसा कि पराग, बिल्ली डैंडर, हाउस डस्ट माइट, और मूंगफली के अर्क के साथ - साथ मधुमक्खी के जहर3,17,21के लिए दिखाया गया है। इस तकनीक को विशेष रूप से खाद्य एलर्जी के निदान में लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह मूंगफली, दूध, गेहूं और अंडे22जैसे जटिल खाद्य उत्पादों में एलर्जी घटकों की न्यूनतम मात्रा का भी पता लगा सकता है। इस संबंध में, पशु खाद्य एलर्जी की एलर्जी के आकलन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में भी सूचित किया गया है, जैसे कि ट्रोपोमायोसिन, और गैर-एलर्जी23से शक्तिशाली एलर्जी को अलग करने में सहायता कर सकते हैं। एक शोध उपकरण के रूप में, परख का उपयोग खाद्य प्रसंस्करण के प्रभाव का अध्ययन करने के साथ-साथ एलर्जी के लिए बाध्यकारी लिगांड के प्रभाव और एलर्जी24, 25पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए कियाजाताहै। उदाहरण के लिए, बेट वी 1 के बंधन को एलर्जेन-आईजीई क्रॉस-लिंकिंग को प्रभावित नहीं करने के लिए दिखाया गया था, हालांकि इसकी थर्मल और प्रोटियोलिटिकस्थिरता 25में वृद्धि हुई। परख का उपयोग मामूली और प्रमुख एलर्जी के लिए रोगी की प्रतिक्रियाशीलता की तुलना करने के साथ-साथ एलर्जेन समरूपों और आइसोफॉर्म की क्रॉस-रिएक्टिविटी की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि बेट वी 1 और अक्षजमान खाद्य एलर्जी कोर ए 1(चित्रा 3)का उपयोग करके हमारे उदाहरण में दिखाया गया है। एलर्जेन आइसोफॉर्म के बारे में, मध्यस्थ रिलीज परख का उपयोग प्रमुख एलर्जेन अम्ब को रैगवीड पराग(एम्ब्रोसिया आर्टेमिसिफोलिया)में सबसे शक्तिशाली आईजीई-रिएक्टिव आइसोफॉर्म के रूप में 1.01 की पहचान करने के लिए किया गया था। इसकी तुलना में, रैगवीड पराग अर्क, अम्ब ए १.०२ और अम्ब ए १.०३ में पहचाने गए अन्य दो पहचाने गए आइसोफॉर्म ने मरीजों के आईजीई26के प्रति कम प्रतिक्रिया दिखाई ।

हाल के वर्षों में, परख संभावित एंटी-एलर्जिक यौगिकों और एलर्जी के उपन्यास हाइपोएलर्जेनिक वेरिएंट का अध्ययन करने के लिए लागू की गई है, जो एलर्जी-विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी27, 28के लिए उपयुक्त उम्मीदवारों की पहचान में सहायता कर रही है। एक और उपन्यास दृष्टिकोण एलर्जी-विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी के दौरान उपचार प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए परख का उपयोग करना है। इस संबंध में, हमारे अनुसंधान समूह ने एक एचआरबीएल परख अवरोध प्रणाली विकसित की, जो एलर्जी-विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी29के दौरान रोगी के लक्षण स्कोर की कमी के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है। परख भी एलर्जी प्रेरित IgE-मध्यस्थता degranulation30पर TGFο1 के इम्यूनोसप्रेसिव प्रभावों का अध्ययन करने का प्रस्ताव किया गया है ।

परख की सीमाएं यह हैं कि भले ही हुर्बल कोशिकाओं में मस्तूल कोशिकाओं या बेसोफिल की कुछ विशेषताएं होती हैं, लेकिन वे इन प्रभावक कोशिकाओं के प्राकृतिक कार्य की पूरी तरह से नकल नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, मस्त कोशिकाएं व्यापक रूप से पैटर्न मान्यता रिसेप्टर टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) को व्यक्त करती हैं, जो रोगजनक मान्यता के लिए आवश्यक है, जबकि आरबीएल-2H3 कोशिकाओं31में इसकी पूरी तरह से कमी है। कार्यक्षमता में इस अंतर के कारण, परख पूरी तरह से वास्तविक जीवन की स्थिति की नकल नहीं करता है, जिसे डेटा की व्याख्या करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, चूंकि हुर्बल कोशिकाएं कैंसर बेसोफिलिक कोशिकाएं हैं, इसलिए संस्कृति की स्थितियों में परिवर्तन और लंबे समय तक खेती करने से फेनोटाइपिक मतभेद हो सकते हैं जिससे विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच परिणाम बदल सकते हैं20। एक अन्य पहलू एलर्जी एकाग्रता का विकल्प है जिसे इस विधि को अनुकूल करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए क्योंकि उच्च एलर्जी सांद्रता के परिणामस्वरूप प्रोटीज या एंडोटॉक्सिन18की उच्च मात्रा की उपस्थिति के कारण गैर-आईजीई मध्यस्थता डेग्रेशन हो सकता है। अन्य सीमाएं अपेक्षाकृत उच्च विशिष्ट आईजीई स्तर (आरएएसटी वर्ग 5-6) के साथ मानव सेरा पर निर्भरता हैं, और सेल संस्कृति प्रणालियों की आवश्यकता है, जो एक बाधा बनी हुई है जिसे दैनिक नैदानिक दिनचर्या में तकनीक को लागू करने के लिए दूर करने की आवश्यकता है।

इन सीमाओं के अलावा, एचयूआरबी परख एलर्जी रोगों के निदान और उपचार के लिए एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है और इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक मानवीकृत/एफसीडब्ल्यूआरआई-संक्रमित आरबीएल कोशिकाओं को उपलब्ध कराने और इस शोध पद्धति पत्र को लिखने के लिए अपनी सहमति देने के लिए आणविक एलर्जी विज्ञान विभाग के प्रो डॉ स्टीफन विथ्स, पॉल-एहरलिच-इंस्टीटयूट, लैंगन, जर्मनी को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम उत्कृष्ट प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए प्रो डॉ फातिमा फरेरा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम आगे प्रो डॉ रोनाल्ड वान री और प्रायोगिक इम्यूनोलॉजी विभाग के डॉ जाप Akkerdaas, एम्स्टर्डम विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र, स्थान एएमसी, शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, एम्स्टर्डम, नीदरलैंड, इस तरीके कागज में प्रदान की प्रतिनिधि डेटा प्रकाशित करने के लिए अपनी सहमति देने के लिए, जो परियोजना BM4SIT के पाठ्यक्रम में उत्पन्न किए गए थे-एलर्जी के लिए नवाचार (www.BM4SIT.eu) । लेखकों के काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (परियोजना P32189) द्वारा समर्थित किया गया है, साल्ज़बर्ग प्राथमिकता कार्यक्रम एलर्जी-कैंसर-BioNano अनुसंधान केंद्र के विश्वविद्यालय द्वारा, कैंसर और एलर्जी में डॉक्टरेट कार्यक्रम प्रतिरक्षा द्वारा-आईसीए ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF W01213) द्वारा वित्त पोषित है, और BM4SIT परियोजना (अनुदान संख्या 601763) द्वारा यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम 7 से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma M2133
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) ThermoFisher Scientific 167008
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) Fisher Scientific 655101
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 10735078001
Citric acid Applichem 131018
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) Sigma D8537
G418 Sigma A1720
Glycine Applichem A3707
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) Sigma F0804
L-Glutamine (200 mM) Sigma G7513
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma M8042
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement Gibco/ThermoFisher Scientific 51985034
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen.  10 mg/mL Strep.) Sigma P4333
Sodium chloride (NaCl) Applichem A2942
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Applichem 131638
Triton X-100 Sigma X100
Trypsin-EDTA Sigma 59418C
Tyrode’s salt Sigma T2145

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References

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Wenger, M., Bethanis, A., Johnson, L., Aglas, L. Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency. J. Vis. Exp. (172), e62702, doi:10.3791/62702 (2021).

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