Summary
Her præsenterer vi mægler frigivelse assay, ved hjælp af en rotte basophilic leukæmi celle linje transfected med den menneskelige IgE receptor, at simulere degranulation af effector celler typisk observeret i type 1 allergiske reaktioner. Denne metode undersøger den biologiske aktivitet af allergener på en meget følsom, reproducerbar og skræddersyet måde.
Abstract
Mediator release assays analysere in vitro immunoglobulin E (IgE)-medieret degranulation og sekretion af mæglere af effektor celler, såsom mastceller og basophils, ved stimulering med serielle fortyndinger af putative allergener. Derfor repræsenterer disse analyser et vigtigt værktøj, der efterligner in vivo degranulationsprocessen, som opstår ved allergeneksponering hos overfølsomme patienter eller i hud priktest. Derudover anvendes disse analyser normalt til at undersøge proteiners allergifremkaldende potentiale og reaktiviteten af patienternes seras reaktivitet. Heri beskriver vi en simpel 2-dages protokol ved hjælp af en udødeliggjort rotte basophil leukæmi cellelinje transfected og humaniseret med den menneskelige høj-affinitet IgE plasma-membran receptor (FcεRI). Denne variant af mægler frigivelse assay er en robust, følsom, og reproducerbar in vitro celle-baseret system uden behov for at immobilisere antigen til faste matricer. Protokollen består af følgende trin: (1) komplement inaktivering af human sera, (2) høst, såning og passiv sensibilisering af cellerne, (3) stimulering med antigen for at forårsage mæglerfrigivelse og (4) måling af β-hexosaminidase aktivitet som surrogat for de frigivne inflammatoriske mæglere, såsom histamin. Analysen repræsenterer et nyttigt redskab til at vurdere kapaciteten af allergen-IgE cross-linker til at udløse celle degranulation og kan gennemføres for at standardisere allergen ekstrakter, at sammenligne patienternes reaktivitet med mindre eller større allergener og til allergifremkaldende ekstrakter (pollen, kat skæl, etc.), at undersøge styrken af allergen homologs, isoforme, og fold-varianter (f.eks allergivenlighed), samt virkningerne af ligands på allergifremkaldende aktivitet. En nyere anvendelse omfatter brugen af analysen til at overvåge behandlingseffektiviteten i løbet af allergen immunterapi.
Introduction
Type I overfølsomhedsreaktioner, karakteriseret ved Immunoglobulin E (IgE) produktion, der er specifik for et respektive antigen, påvirker næsten en tredjedel af verdens befolkning. Disse reaktioner er forbundet med flere allergiske manifestationer såsom astma og rhinoconjunctivitis og kan endda føre til systemiske livstruende reaktioner1. I modsætning til in vivo-tests er immunkemiske tilgange, såsom den enzymrelaterede immunosorbentanalyse (ELISA), udelukkende egnede til at undersøge målbindingen af antistoffer, men adresserer ikke det funktionelle aspekt af proteiner, der kan forårsage øjeblikkelige overfølsomhedsreaktioner. Immobilisering af allergenerne på faste understøtninger (f.eks. ELISA-plader) kan medføre ændringer i deres strukturelle integritet og ødelæggelse af allergi relevante epitoper2. Selv hud prik tests (SPT), det mest almindelige værktøj til at bekræfte sensibilisering mod visse allergener, har deres grænser for påvisning af symptomatisk IgE-medieret fødevareallergi eller allergen tilgængelighed3,4. For at finde en etisk, meget specifik, følsom og omkostningseffektiv metode til test af allergenernes biologiske styrke for at forårsage en type I-overfølsomhedsreaktion er de såkaldte mediator release assays blevet etableret.
Princippet i disse analyser bygger på hændelser efter sensibiliseringsfasen og IgE's ledsagende evne til at binde sig til α kæde af høj-affinitet receptorer udtrykt på overfladen af effektor celler, såsom mastceller og basophils. IgE produceres hovedsageligt af plasmaceller i det slimhinderelaterede lymfoidvæv. Selv om det er den mindst rigelige immunoglobulin (ca. 0,05% hos ikke-atopiske individer) i blodet, har den en usædvanlig høj biologisk aktivitet, der er hovedårsagen til allergiske symptomer. Halveringstiden af IgE kan stige fra 2-3 dage til flere uger og endda måneder, når bundet til sine receptorer på effektor celler. Efterfølgende binding af et antigen til det variable område af to receptorbundne IgE-molekyler fører til deres krydskædning efterfulgt af induktion af en downstream-signalkaskade i effektorcellen, der fører til degranulation og frigivelse af flere proinflammatoriske mæglere, der forårsager vasodilation, såsom histamin, serineprotesaser (f.eks. tryptase) og prostaglandiner5,6,7. Udskillelsen af cytokiner som interleukin 4 (IL-4) og IL-13 er ansvarlige for vedligeholdelsen af den inflammatoriske T-hjælper 2 (Th2) respons og klasseskift af B-celler til IgE-producerende plasmaceller5,8,9. På den anden side forårsager frigivet tromboxane bronkostriktion, og leukotriener stimulerer glat muskelsammentrækning samt vaskulær lækage og spiller en afgørende rolle i luftvejsbetændelse, der fører til astma eller allergisk rhinitis10,11.
Forskningsværktøjer til analyse af de fleste af de ovennævnte mæglere er blevet etableret, men med nogle store ulemper. Tryptase assays er egnede kliniske tilgange til måling af systemisk anafylaksi gennem mast celle aktivering, men deres følsomhed og specificitet i allergi diagnoser er for unøjagtige i forhold til guld standard metoder såsom SPT. På den anden side er cysteinyl leukotrien assays ikke i stand til at diagnosticere allergi over for β-lactams eller nonsteroidal antiinflammatoriske lægemidler12. Protokoller til måling af histamin som en stor mægler frigivet i allergiske reaktioner blev allerede etableret i 1960'erne. Når det er frigivet i det perifere blod, nedbrydes histamin straks af histamin methyltransferaser, hvilket resulterer i en plasma halveringstid på kun få minutter, hvilket gør sin analyse ret udfordrende13. Bortset fra sin ustabilitet viste overvågningen af histamin sig at have en lav specificitet og følsomhed for lægemiddelallergi samt kommercielle fødevareproteiner og hvepsgifte12.
In vitro-modeller med effector cellelinjer er blevet indført som et alternativ til de arbejdskrævende procedurer for isolation og dyrkning af basofile fra allergiske patienter til at udføre frigivelse assays. Derfor er den rottebasofile leukæmi- (RBL-) baseret analyse ved hjælp af RBL-2H3 cellelinjen blevet etableret3. Da denne cellelinje ikke er i stand til at binde human IgE, blev den først overført med α- β- og γ-kæden af den menneskelige IgE plasmamembranreceptor (FcεRI). Flere kloner er blevet genereret og testet for udtryksniveauer og homogenitet af den menneskelige α-kæde, hvoraf klonen RBL-30/25 viste sig som den mest lovende kandidat til in vitro-test. Signalkaskaden induceret ved receptoraktivering af den transfected klon blev testet via calciummobiliseringsanalyser. Som indikator for degranulation og surrogat for histamin frigivelse, det lysosomale enzym β-hexosaminidase blev målt, hvilket har den betydelige fordel af højere stabilitet14. Mæglerfrigivelsen ved hjælp af RBL-30/25-celler når op til 100% og bruges derfor til at teste sera afledt af allergiske patienter. Analysen blev testet for mægler frigivelse efter udfordrende sensibiliserede celler med kommercielle allergen ekstrakter. Dette førte til konstateringen af, at der er en enorm variation i sammensætningen (på op til 60 gange med hensyn til det samlede proteinindhold) af allergenekstrakter afledt af forskellige producenter og anvendes til diagnostiske (f.eks. SPT) eller terapeutiske tilgange3,15,16.
Heri giver vi en detaljeret beskrivelse af RBL-protokollen til at udføre mægler frigivelse assay ved hjælp af serum fra allergiske donorer. Under passiv sensibilisering fanges IgE i serumet af den høje affinitet FcεR1-receptor udtrykt på overfladen af de basofile celler. Ved antigenstimulering er bundne IgEs, der er specifikke for antigen, krydsbundet, hvilket udløser celledegranation og frigivelsen af mægleren β-hexosaminidase. Aktiviteten af β-hexosaminidase måles efterfølgende ved hjælp af et passende substrat. Til analysen blev huRBL-2H3-celler anvendt og kaldt huRBL i følgende protokol. Protokollen beskriver en standard antigenfortyndingsserie med 8 trin fortyndet 1:10 fra 1 μg/mL til 0,1 pg/mL allergen.
Protocol
Etisk godkendelse af at anvende sera fra birk pollen allergiske patienter blev opnået fra den hollandske etiske komité (godkendelsesnummer: NL65758.018.18).
1. Sikkerhedsprocedurer
- Arbejde under sterile forhold ved hjælp af en biologisk sikkerhedsklasse 2 arbejdsbænk i løbet af eksperimentets første dag (Biosikkerhedsniveau 2). Følg institutionens sikkerhedsretningslinjer for brug af humant serum.
2. Komplement inaktivering af human sera
- Høst en tæt kultur af P3X63Ag8.653 celler (kaldes Ag8 celler fremover), fra cellekultur kolben og overføre dem til en centrifugering rør.
- Brug følgende kulturmedium til disse celler: Modified Eagles's Minimum Essential Medium med reduceret serumkoncentration, 1% Penicillin-Streptomycin (100 enheder Pen., 0,1 mg/mL Strep.), 5% varmeinaktiveret fosterkalv/kvægserum (FCSi).
- Centrifuge Ag8-celler i 5 min ved 250 x g ved stuetemperatur.
- Ophæng cellepillen til en endelig koncentration på ca. 1 x 106 celler/mL i huRBL-medium (Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, 4 mM L-Glutamin, 5% FCSi, 1% G418 (100% lager: 10 g/125 mL dH2O).
BEMÆRK: Vedligehold Ag8-celler ved også at passere til fremtidig brug. - Fortynd human sera 1:10 i Ag8 celle suspension. Endelig serum fortynding i analysen vil være 1:20.
BEMÆRK: For sera med lav specifik IgE kan der anvendes en 1:5 (1:10 endelig fortynding). - Inkuberes i 1 time ved 37 °C og 5%-7% CO2.
3. Høst og såning af huRBL-celler
- Aspirere mediet fra en T-75 celle kultur kolbe omhyggeligt uden at røre huRBL celler (huRBL celler er klæbende). Sørg for, at cellerne er omkring 50%-90% sammenløb.
BEMÆRK: Afhængigt af cellesammenløbet er celleindholdet i en tæt T-75 cellekulturkolbe normalt nok til en til to 96-brønds plader. - Vask cellerne to gange ved at tilsætte 10 mL af Dulbeccos fosfatbuffer saltvand (DPBS). Tilsættes DPBS til den modsatte side af kolben og ikke direkte på cellerne.
- Aspirere DPBS og tilsæt 5 mL forvarmet 1x trypsin-EDTA (0,05%/0,02% EDTA fortyndet i DPBS) til celle løsrivelse.
- Kolben inkuberes i 5 min ved 37 °C.
- Tag cellerne af ved forsigtigt at trykke på kolben.
- Celleaffjedringen overføres til et 15 mL centrifugeringsrør, og fyld op med huRBL-medium eller DPBS for at fortynde trypsin-EDTA.
- Centrifugere cellerne ved 250 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatant og genbruge pellet i 5 mL huRBL medium til celletælling.
- Tæl cellerne og fortynd dem i huRBL medium for at opnå en endelig koncentration på 2 x 106 celler/mL.
- Brug en steril 96-brønds plade og tilsæt 50 μL huRBL celleaffjedring pr. brønd, hvilket svarer til 1 x 105 celler /brønd.
4. Passiv sensibilisering af huRBL-celler
- Centrifuge den præinkuberede Ag8/serum suspension i 5 min ved 250 x g.
- Overfør 50 μL af den centrifugerede Ag8/serum suspension til hver brønd indeholdende huRBL celler uden at forstyrre Ag8 celle pellet.
- Medtag ingen antigen kontrol, som er sensibiliseret, men ikke-stimulerede celler (ikke tilføje antigen), der tjener som en indikation for bunden signal plateau / baggrund. Baggrund og maksimal lysis kontrol brønde behøver ikke at være overfølsomme med serum. Tilsæt 50 μL huRBL medium til at styre brønde i stedet.
- Dæk pladen med låget og inkuber natten over ved 37 °C og 5%-7% CO2.
5. Antigen-stimuleret degranulation og mægler frigivelse
- Optjen antigenfortyndingen i 1x Tyroders buffer (9,5 g/L Tyroderes salte, 0,1% kvægserumalbumin (BSA), 0,5 g/L Natrium hydrogencarbonat (NaHCO3) i dH2O) på forhånd. Der er behov for en endelig mængde på 100 μL pr. brønd.
BEMÆRK: Ikke alle allergener, der enten er renset fra naturlige kilder eller rekombinant produceret, kan være stabile i 1x Tyroders buffer. Udfør derfor stabilitetstest i 1x Tyroders buffer forud for analyseproceduren. Alternativt fortyndes 1x Tyroders buffer i deuteriumoxid (D2O) for at øge signal-til-støj-forholdet mellem analysen. - Der fremstilles 8 fortyndinger af antigen af interesse for en 1:10 fortyndingsserie i reaktionsrør, der starter med enten 10 eller 1 μg/mL protein.
BEMÆRK: Test altid fortyndingsserien på forhånd. Alternativt kan du tilpasse fortyndingsserien 1:10 (f.eks. 1:5, 1:20 eller 1:30) for at dække hele frigivelseskurven. Derudover kan startkoncentrationen variere afhængigt af den eksperimentelle opsætning. - For at vaske huRBL-celler, der er belagt på 96-brøndpladen, skal du først fjerne det seraholdige cellemedium ved omhyggeligt at aspirere, invertere og trykke på pladen på absorberende papir.
- Vask celler med 200 μL af 1x Tyroders buffer pr. Brønd. Behandl alle brønde på samme måde.
BEMÆRK: Tilsæt vaskeopløsningen langsomt til cellerne for ikke at forstyrre dem. - Lad det stå i ca. 30 s og gentag vasketrinnet tre gange i alt.
- Efter tilsætning af vaskeopløsningen til sidste gang skal opløsningen efterlades i brøndene, indtil den er klar til at fortsætte med at tilsætte antigenfortyndingen.
BEMÆRK: Undgå at udsætte cellerne for luft for længe. - Overfør 100 μL antigenopløsning til hver brønd, der indeholder de præfølsomme huRBL-celler.
BEMÆRK: Hvis du analyserer flere forskellige parametre, skal du overføre de enkelte prøver af fortyndingsserien til en ekstra uforpligtende 96-brøndsplade (brug det samme layout som på huRBL-pladen) og overfør dem bagefter med en multikanalpipette direkte på huRBL-cellepladen. På denne måde, udsætter cellerne for luft for længe kan undgås, hvilket kan resultere i dårlig assay ydeevne (lavere / ingen signal). - Dæk kontrolbrønde (maksimale lysis og ikke-sensibiliserede baggrundsceller) med 100 μL af 1x Tyroders buffer. Stimulere ikke disse kontrol brønde med antigen.
- Derudover tilsættes 100 μL af 1x Tyroders buffer til de sensibiliserede no-antigen brønde i fortyndingsserien, som er nødvendig for at tage antigenuafhængig spontan frigivelse af sensibiliserede celler i betragtning under dataanalyse.
- Inkuberes huRBL-celler i 1 time ved 37 °C og 5%-7% CO2.
6. Fluorescensmåling af β-hexosaminidase aktivitet
- Forkæl brøndene i den maksimale lysis kontrol med 10 μL af 10% Triton X-100 per brønd og bland ordentligt for at lyse cellerne helt og opnå 100% frigivelse af β-hexosaminidase.
- Tilsættes 50 μL substratopløsning til en ny uforpligtende 96-brønds plade. Substratopløsning til en 96-brøndsplade: 5 mL 0,1 M citronanalysebuffer, pH 4.5; og 80 μL på 10 mM 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminid.
- Overfør 50 μL celle supernatant af alle brønde til den nye plade, der indeholder substratopløsningen.
BEMÆRK: Pipette supernatanten forsigtigt off huRBL pladen for ikke at forstyrre huRBL celler. - Inkuberes pladen med substratopløsning og celle supernatant i 1 time ved 37 °C for at muliggøre konvertering af det fluorogene substrat.
BEMÆRK: Hold huRBL-pladen til celle levedygtighedsanalyse. - Der tilsættes 100 μL stopopløsning (15 g/L glycin, 11,7 g/L NaCl opløst i dH2O, pH 10,7) pr. brønd.
- Mål fluorescensen ved 360 nm excitation og 465 nm emission ved hjælp af en pladelæser.
7. Dataanalyse
- Til grundlæggende beregninger af procentfrigivelse skal du bruge regnearkssoftware.
- For baggrund subtraktion / baseline fjernelse, trække gennemsnittet af baggrunden brønde fra alle andre brønde.
- Middelværdien af maksimale lysisblyndere og ekspresdata for fortyndingsserien i procent. På denne måde kan man udtrykke data som en procentdel af cellefrigivelse normaliseret til den maksimale enzymfrigivelse forårsaget af celle lysis.
- Komplette dosis-respons mægler frigivelse kurver er repræsenteret bedst som XY grafer med antigen koncentration på en log på X-aksen og procentdel af mægler frigivelse på Y-aksen.
- Tilføj værdierne for no-antigen-kontrolelementet som en stiplet linje for at angive baggrunden eller det nederste plateau.
BEMÆRK: Flere lignende behandlede sera kan sammenlignes ved hjælp af denne normaliseringsstrategi. Til direkte sammenligning anbefales det endvidere at beregne den halve maksimale frigivelse, som er den antigenkoncentration (i ng/mL), der er nødvendig for halv maksimal frigivelse defineret som gennemsnittet af de maksimale og minimale værdier pr. kurve. Antigenkoncentrationen for at stimulere halvmaksimal frigivelse beregnes ved interpolation af den halve maksimale frigivelsesværdi i en logaritmisk regressionslinje.
Representative Results
Mediatorfrigivelsesanalysen, der er baseret på huRBL-celler (figur 1A og B),resulterer i en klokkeformet dosisresponskurve ( Figur1C). For forenklet datarepræsentation kan den antigenkoncentration, der er nødvendig for den halve maksimale mæglerfrigivelse, beregnes ved hjælp af lineær regression (Figur 1D). Der udføres en celleafskalelighedsanalyse for at udelukke cytotoksiske virkninger, der er afledt af enten det sensibiliserende serum eller det antigen, der anvendes til stimulering (figur 1E). Analysen kan bruges til at teste reaktiviteten af forskellige sera til et bestemt antigen. I vores tilfælde reagerede 4 ud af 5 sera, afledt af birkepollenallergiske patienter, på Bet v 1 stimulation. Serum #1 viste den højeste mediatorfrigivelse (Figur 2). Serum #5 reagerede ikke på Bet v 1 stimulation og kunne derfor reagere på andre birkepollenallergener (f.eks. Bet v 2, profilin). Disse data indikerer, at Bet v 1 er et potent allergen, der er ansvarlig for IgE-medierede allergiske symptomer. Ved at bruge huRBL-analysen kan IgE's krydsreaktivitet for homologe allergener vurderes (Figur 3). Her reagerede begge birkepollenallergiske patienter godt på Bet v 1, mens kun patient #2 også reagerede på Cor a 1, Bet v 1-homologt madallergener, der findes i hasselnødder. Baseret på disse data, patient # 2 sandsynligvis har højere Cor en 1-cross-reaktivE IgE niveauer end patient # 1, hvilket resulterer i oral allergi symptomer på hasselnød forbrug. Selv vurderingen af den allergivenlige karakter af mutante varianter af allergener (nedsat styrke) kan analyseres og sammenlignes med deres vilde modstykke (Figur 4). I det medfølgende eksempel skiftede foldevariantens frigivelseskurve mod en højere antigenkoncentration sammenlignet med det vilde allergen, hvilket resulterede i en betydeligt højere koncentration af antigen, der var nødvendig for at fremkalde halv maksimal frigivelse (Figur 4B). Disse data indebærer, at den genererede mutant/fold-variant er mindre allergifremkaldende sammenlignet med det vilde protein. Denne reducerede styrke til at udløse IgE-medieret degranulation fremhæver den allergivenlige karakter af folden variant. Baseret på denne analyse, folden variant er en interessant kandidat til allergen-specifikke immunterapi, da det kan forårsage reduceret IgE-associerede bivirkninger under behandlingen.
Figur 1: Humaniserede RBL-celler og en repræsentativ klokkeformet kurve af krydskædningsfremkaldt β-hexosaminidase. RBL-celler er klæbende til kulturkolber, hvilket giver dem en stanglignende form, da de forsøger at fastgøre sig selv (A). Et ideelt sammenløbsniveau for celler, der skal høstes, er ikke mere end 90 % (B). Celler vises under forstørrelse på henholdsvis 40x og 10x. Celler, der blev overfølsomme med humane serum af en birk pollen allergisk person reagerer på udfordring med rekombinant Bet v 1 (rBet v 1), den store birk pollen allergen (C). Som surrogat for mægler frigivelse, den β-hexosaminidase aktivitet måles i celle supernatants. Den klokkeformede kurve skyldes en monovalent besættelse af antigen epitoper på IgE på grund af overskydende allergen, som konkurrencemæssigt hæmmer allergen-IgE cross-linking ved høje antigenkoncentrationer. En anden forklaring på den lave frigivelse ved høje allergenkoncentrationer er hæmningen af intracellulære veje i nærværelse af overskydende antigen. Til bestemmelse af allergenkoncentrationen, der er nødvendig for at opnå halv maksimal frigivelse, blev der anvendt en logaritmisk regressionslinje baseret på de eksperimentelle værdier, der repræsenterer den lineære del af hældningen af mæglerens frigivelseskurve (D). Den røde stiplede linje repræsenterer den logaritmiske regressionslinje, der bruges til beregning. Formlen for regressionslinjen vises med rødt. Den halve maksimale frigivelse defineres som: halv maksimal frigivelse = (minimum frigivelsesværdi + maksimal frigivelsesværdi)/2. I eksemplet var den beregnede halvmaksimefrigivelse 20,6%. Det repræsentative humane serum, der blev anvendt i dette forsøg, blev fortyndet 1:20 til inkubation med huRBL-celler, og den antigenkoncentration, der blev anvendt til stimulering, varierede fra 100 μg/mL til 0,004 pg/mL bet v 1. En celle levedygtighed assay, i dette tilfælde en MTT assay, blev udført med de resterende celler efter antigen stimulation til at vurdere indflydelsen af sensibiliserende serum samt af antigen fortynding på celle levedygtighed og celletal (E). Ubehandlede baggrundsceller og lyserede celler (maksimal lysis) vises som stiplede linje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative kurver af β-hexosaminidase procent frigivelse af fem forskellige menneskelige sera. Det samme antigenkoncentrationsområde på rBet v 1 blev inkuberet med huRBL-celler, der blev overfølsomme med sera af forskellige birkepollensensibiliserede individer. Der er en klar forskel i procent frigivelse mellem de forskellige patienter svarende til sværhedsgraden af deres symptomer. Bemærk, at patient # 5 er ikke-reaktive til de store birk pollen allergen Bet v 1. Alle fem menneskelige sera bruges til at opnå disse mægler frigivelse kurver blev fortyndet lige så 1:20 for inkubation med huRBL celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Krydsreaktivitet af IgE udvundet af sera af birk pollen overfølsomme patienter med Bet v 1 homolog hasselnød allergen Cor a 1. To repræsentative sera af patienter overfølsom over for birk pollen reagerer stærkt på Bet v 1 samt i mindre grad til homologe allergen Cor a 1. Patient 2 er viser en betydelig reaktion på Cor a 1, og dermed vil sandsynligvis udvise oral allergi symptomer på hasselnød forbrug, sammenlignet med patient 1, hvor mægler frigivelse er næsten ubetydelig. Den stiplede linje repræsenterer no-antigen kontrol, som er celler overfølsom med den menneskelige sera, men ikke stimuleret med et allergen, og dermed tjener som indikation for bundsignal plateau / baggrund. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af procentfrigivelse mellem rBet v 1 wild type og en allergivenlig foldvariant. Det samme serum af en birk pollen-sensibiliseret person blev inkuberet med rBet v 1 vilde type (wt) og en allergivenlig fold-variant af de store birk pollen allergen (A). Selvom mediator frigivelse ses i begge antigener, der er et klart skift i retning af højere antigen koncentrationer, når man sammenligner fold-variant til vilde type rBet v 1 for den samme procent frigivelse. En standard måde at sammenligne forskellen i procent frigivelse af forskellige antigener er beregning af koncentrationen af antigen er nødvendig for at opnå halv maksimal frigivelse (B). Dette udføres normalt i biologiske replikater (test af samme antigenområde for hvert allergen i forskellige menneskelige sera). Normalt, for at drage nogen væsentlige konklusioner, mægler frigivelse udføres med sera fra mindst 8 til 10 forskellige patienter. Her er resultaterne af fire forskellige sera afbildet som et eksempel. En parret t-testblev brugt til statistisk analyse. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Potentielle spørgsmål og fejlfinding | Opløsning |
| Variabilitet fra analyse til analyse på grund af ændret cellerespons | Sørg for, at cellepassagenstallet ikke overstiger 20 til 30 passager. Lav frosne lagre ved tidlige passager til fremtidige eksperimenter. |
| Snarere stole på biologiske replikter (brug af forskellige sera) end tekniske dem. | |
| Sera indeholder lave niveauer af specifikke IgE | En lavere slutserumfortynding kan anvendes (dvs. 1:10) i stedet for 1:20. Omvendt kan sera, der indeholder høje niveauer af specifik IgE, fortyndes yderligere (1:30 eller 1:40). |
| Ikke nok celler til at udføre analysen | Sørg for, at sammenløbet i en T-75 kolbe er omkring 50-90%. Passage flere kolber. |
| Cytotoksiske virkninger af sera, dvs. | Udfør en celle levedygtighed assay ud over mægler frigivelse assay. Øge Ag8-koncentrationen for at undgå ufuldstændig komplementinaktivering. |
| Lavt signal | Forbedre signal-til-støj-forholdet mellem analysen ved at fortynde 1x Tyroders buffer i deuteriumoxid (D2O) i stedet for dH2O eller ved at bruge en sera med højere niveauer af specifik IgE til allergenet af interesse. |
| Allergenet er ikke stabilt i Tyroders buffer (f.eks. nedbør) | Lav stabilitetstest i 1x Tyroders buffer forud for analyseproceduren. Det anbefales ikke at erstatte Tyroders buffer. |
| Problemer med at finde den rette startkoncentration for det respektive allergen | Tilpasning af fortyndingsserier til at dække den fulde frigivelseskurve (flere fortyndingstrin, 1:20 fortynding i stedet for 1:10). |
| Dårlig analyseydelse indikeret med lav/intet signal | Undgå cytotoksiske virkninger fra enten sera- eller antigenstimulering (f.eks. enzymatiske allergener). Vask og blød cellerne omhyggeligt. Undgå at blive udsat for luft for længe, og undgå, at cellerne tørrer ud. |
| Hvordan ved jeg, om bundsignalplateauet er nået? | Tilføj "ingen antigen" kontrol til din plade. Disse er sensibiliseret celle, som kun blev stimuleret med 1x Tyrode's buffer, men uden et allergen. |
| Har jeg brug for en positiv kontrol ud over de maksimale lysis brønde? | Som yderligere positiv kontrol en serum og antigen kombination vides at forårsage degranulation kan anvendes eller en anti-FcεR1 antistof. |
| Hvor mange brønde skal jeg bruge? | Det afhænger af din titreringsserie, antallet af antigener og sera, du vil analysere. Planlæg layoutet for 96-brønd plader i henhold til hvor mange sera / antigener du kommer til at teste. Glem ikke at tilføje "ingen antigen kontrol", baggrundscellerne (ikke-sensibiliseret, ikke-stimuleret) samt den maksimale lysis brønde. |
| Hvor mange sera skal jeg teste? Og har jeg brug for replikeringer? | Selv om analysen er ganske robust, der er nogle assay-til-assay variabilitet på grund af ændret celle lydhørhed. Derfor anbefales det snarere at stole på biologiske replikater (ved hjælp af forskellige sera) end på tekniske replikter. Mindst otte forskellige sera er tilstrækkelige til at analysere allergener. Som vist i fig. 4B kan der dog allerede opnås betydelige resultater ved hjælp af mindre sera. |
Tabel 1: Fejlfinding.
Discussion
Den heri beskrevne huRBL celle-baserede mægler frigivelse assay er en robust metode, der nemt kan udføres og gennemføres i ethvert laboratorium. Det eneste krav er, at celler skal dyrkes under sterile forhold. Analysen bruges til at vurdere sandsynligheden for et allergen eller allergifremkaldende kilde til at fremkalde patienternes IgE-crosslinking og basophil degranulation17. Analysen kan nemt tilpasses enhver allergen eller allergifremkaldende kilde, så længe patientens serum med et højt niveau af specifikke IgE, der anerkender allergen af interesse, er til rådighed. Det anbefales at udføre en celle levedygtighed assay ud over mægler frigivelse assay for at tage højde for eventuelle cytotoksiske virkninger, der kan resultere i dårlig assay ydeevne. Dette kan skyldes ufuldstændig komplementinaktivering af sera eller andre serumbaserede cytotoksiske virkninger. Selv selve antigenet, for eksempel på grund af proteolytisk / enzymatisk aktivitet, kan skade huRBL-cellerne. Vi bruger normalt en celle levedygtighed assay med MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) til at evaluere potentielle cytotoksiske virkninger. Analysen kan nemt udføres med huRBL-cellerne tilbage, efter at celle supernatanten blev indsamlet og overført (se trin 6.3. i protokollen). Sammenlignet med andre immunkemiske metoder, såsom ELISA'er og vestlige blotting, til bestemmelse af det allergifremkaldende potentiale af enten individuelle allergener eller komplekse ekstrakter baseret på allergen-IgE binding, kan denne analyse opdage ikke kun bindingen af IgE til et allergen, men kan også måle funktionaliteten af både, menneskelig IgE og allergenet, for at provokere IgE-medieret basophil degranulation18. Således kan det hjælpe med at studere sværhedsgraden af allergiske symptomer ex vivo ved hjælp af patienternes sera. Analysen er rapporteret at være mere konsekvent og effektiv end den klassiske passive kutan anafylaksi tests, da analysen udnytter RBL-2H3 celler, som er relativt let at håndtere og producere mindre variation i resultater i forhold til primære celler, såsom mast celler eller menneskelige basophils19,20. Derudover giver analysen en god repræsentation af allergenernes biologiske aktivitet og kan nøjagtigt estimere det samlede allergenindhold i en given kompleks prøve3. Hvis du vil foretage fejlfinding af visse trin i protokollen, skal du se tabel 1.
Med hensyn til anvendeligheden af denne version af mægler frigivelse assay, det har for det meste været anvendt til forskningsformål, men også til standardisering af allergifremkaldende ekstrakter baseret på deres biologiske aktivitet. Dette omfatter analyse af forskellige partier af SPT-løsninger, provokationstestopløsning samt ekstrakter, der anvendes til allergenspecifik immunterapi; som vist for pollen, katteskæl, husstøvmide og jordnøddeekstrakter samt bigift3,17,21. Teknikken kan anvendes især til diagnosticering af fødevareallergier, da den kan opdage selv minimale mængder allergifremkaldende bestanddele i komplekse fødevarer som jordnødder, mælk, hvede og æg22. I denne henseende er det også blevet rapporteret som et værdifuldt værktøj til vurdering af allergifremkaldende egenskaber ved animalske fødevareallergener, såsom tropomyosiner, og kan hjælpe med at skelne potente allergener fra ikke-allergener23. Som et forskningsværktøj bruges analysen til at undersøge virkningen af fødevareforarbejdning samt til at evaluere indflydelsen af ligandbinding til allergener og dens virkning på allergenicitet24,25. For eksempel viste bindingen af Bet v 1 til ligands sig ikke at påvirke allergen-IgE-krydsbindingen, selv om det forårsagede en stigning i dets termiske og proteolytiske stabilitet25. Analysen kan bruges til at sammenligne patientens reaktivitet med mindre og større allergener, samt til at undersøge krydsreaktiviteten af allergen homologer og isoforme, som vist i vores eksempel ved hjælp af Bet v 1 og homologe fødevarer allergen Cor a 1 (Figur 3). Med hensyn til allergen isoformer, mægler frigivelse assay blev brugt til at identificere de store allergen AMB en 1,01 som den mest potente IgE-reaktiv isoform i ragweed pollen (Ambrosia artemisiifolia). Til sammenligning viste de to andre identificerede isoformer i ragweed pollenekstrakter, Amb a 1,02 og Amb a 1,03, reduceret reaktivitet over for patienternes IgE26.
I de senere år er analysen blevet anvendt til at studere potentielle antiallergiske forbindelser og nye allergivenlige varianter af allergener, medvirken til identifikation af egnede kandidater til allergen-specifikke immunterapi27,28. En anden ny tilgang er at bruge analysen til at overvåge behandlingseffekten i løbet af allergenspecifik immunterapi. I denne henseende udviklede vores forskningsgruppe et huRBL assay hæmningssystem, som korrelerede godt med reduktionen af patientens symptomscore under allergenspecifik immunterapi29. Analysen er også blevet foreslået at studere de immundæmpende virkninger af TGFβ1 på allergen-induceret IgE-medieret degranulation30.
Begrænsningerne i analysen er, at selv om huRBL celler besidder nogle funktioner i mast celler eller basophils, de ikke helt efterligne den naturlige funktion af disse effector celler. For eksempel udtrykker mastceller i vid udstrækning mønstergenkendelsesreceptoren Toll-like receptor 4 (TLR4), der er nødvendig for patogengenkendelse, mens den er helt mangelfuld i RBL-2H3-cellerne31. På grund af denne forskel i funktionalitet efterligner analysen ikke fuldt ud den virkelige situation, som skal holdes for øje, når man fortolker dataene. Da huRBL-cellerne er kræft-basofile celler, kan ændringer i kulturforhold og langvarig dyrkning føre til fænotypiske forskelle, der fører til ændrede resultater mellem forskellige laboratorier20. Et andet aspekt er valget af allergenkoncentration, der skal tages i betragtning ved tilpasning af denne metode, da høje allergenkoncentrationer kan resultere i ikke-IgE-medieret degranation på grund af tilstedeværelsen af store mængder proteaser eller endotoksiner18. Andre begrænsninger er afhængigheden af human sera med relativt høje specifikke IgE-niveauer (RAST-klasse 5-6) og behovet for cellekultursystemer, som fortsat er en hindring, der skal overvindes for at implementere teknikken i den daglige kliniske rutine.
Bortset fra disse begrænsninger repræsenterer huRBL-analysen et værdifuldt forskningsværktøj til diagnosticering og behandling af allergiske sygdomme og kan bruges i en lang række applikationer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Dr. Stefan Vieths fra Department of Molecular Allergology, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Tyskland, for at give de humaniserede / FcεRI-transfected RBL celler og for at give sit samtykke til at skrive denne forskning metode papir. Vi vil gerne takke Prof. Dr. Fatima Ferreira for at give fremragende feedback. Vi vil endvidere gerne takke Prof. Dr. Ronald van Ree og Dr. Jaap Akkerdaas fra Institut for Eksperimentel Immunologi, Amsterdam University Medical Centers, placering AMC, Amsterdam, Nederlandene, for at give deres samtykke til at offentliggøre repræsentative data, der leveres i dette metodepapir, som blev genereret i løbet af projektet BM4SIT - innovationer for allergi (www.BM4SIT.eu). Forfatternes arbejde er blevet støttet af den østrigske videnskabsfond (Projekt P32189), af University of Salzburgs prioriterede program Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, af ph.d.-programmet Immunitet mod kræft og allergi-ICA finansieret af Den Østrigske Videnskabsfond (FWF W01213) og af BM4SIT-projektet (tilskudsnummer 601763) fra DEN Europæiske Unions syvende rammeprogram FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
