Summary
여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.
Abstract
중재자 방출 분석은 체외 면역글로불린 E(IgE)-매개 된 탈과및 마스트 세포 및 바소필과 같은 이펙터 세포에 의한 중재자의 분비분석, 푸티알레겐의 연쇄 희석으로 자극시. 따라서, 이러한 소심은 감각화된 환자 또는 피부 찌르기 시험에서 알레르겐 노출에 따라 발생하는 생체 내 탈과화 과정을 모방하는 필수적인 도구를 나타냅니다. 추가적으로, 이 사실약은 일반적으로 단백질의 알레르기성 잠재력 및 환자의 sera의 반응성을 조사하기 위하여 이용됩니다. 본명, 우리는 인간 고친화 IgE 플라즈마 막 수용체(FcθRI)와 함께 감염되고 인간화된 불멸의 쥐 바소필 백혈병 세포주체를 사용하여 간단한 2일 프로토콜을 설명한다. 이러한 중재자 방출 분석의 이 변종은 항원들을 고체 행렬에 고정시킬 필요 없이 체외 세포 기반 시스템에서 견고하고 민감하며 재현가능한 시스템이다. 프로토콜은 다음과 같은 단계로 구성됩니다: (1) 인간 세라의 비활성화를 보완하고, (2) 세포의 수확, 파종 및 수동 감광, (3) 항원과의 자극은 항원 방출을 유발하고, (4) β-헥소사미니다제 활성을 측정하여 방출된 염증 성 중재자에 대한 대리로서, 그의 tamine과 같은 방출된 염증 성 중재자에 대한 대리로서 측정한다. 상기 분석은 알레르겐-IgE 교차 연결의 용량을 평가하여 세포 탈과화를 유발하는 유용한 도구를 나타내며, 알레르겐 추출물을 표준화하기 위해 구현될 수 있고, 환자의 반응성 반응을 경미한 또는 주요 알레르겐 추출물(꽃가루, 고양이 단상 등)과 비교하여 알레르겐 균질, 동소형태 및 접이식(예: 저자극성)의 효능과 모든 알레르기 유발 활동에 대한 리간드의 효과를 조사합니다. 최근에 적용된 적용은 알레르겐 면역요법 과정에서 치료 효능을 모니터링하기 위한 분석의 사용을 포함한다.
Introduction
타입 I 과민반응, 면역글로불린 E (IgE) 각 항원에 특정한 생산을 특징으로 하는, 세계 인구의 거의 3분의 1에 영향을 미칩니다. 이러한 반응은 천식과 코뿔소 결막염과 같은 여러 알레르기 증상과 관련이 있으며 전신 생명을 위협하는 반응1로이어질 수도 있습니다. 생체 내 시험과 달리, 효소-연결된 면역소벤터벤트 분석(ELISA)과 같은 면역화학적 접근법은 항체의 표적 결합을 조사하기에만 전적으로 적합하지만 즉각적인 과민반응반응을 유발할 수 있는 단백질의 기능적 측면을 다루지는 않는다. 고체 지지대(예를 들어, ELISA 플레이트)에 대한 알레르겐의 고정은 구조적 무결성및 알레르기 관련 에피토프2의파괴에 변화를 일으킬 수 있다. 특정 알레르겐에 대한 민감성을 확인하는 가장 일반적인 도구인 피부 찌르기 검사(SPT)조차도 증상 IgE 매개 식품 알레르기 또는 알레르겐 가용성3,4의검출에 관한 한계가 있다. 알레르겐의 생물학적 효능을 시험하여 I형 과민반응을 유발하는 윤리적이고, 매우 구체적이고, 민감하며, 비용 효율적인 방법을 찾기 위해, 소위 중재자 방출 소법이 확립되었다.
이러한 아세의 원리는 유방 세포 및 바소필과 같은 이펙터 세포의 표면에 발현된 친화성 수용체의 α 사슬에 결합하는 민감화 단계및 IgE의 동반 능력에 따른 이벤트에 의존한다. IgE는 주로 점막 관련 림프조직에서 혈장 세포에 의해 생성된다. 혈액에서 면역글로불린(비아토피 개인의 약 0.05%)이 가장 적게 풍부하지만 알레르기 증상의 주요 원인이 되는 매우 높은 생물학적 활성을 가지고 있습니다. IgE의 반감기에서 증가 할 수 있습니다 2-3 일 몇 주 및 심지어 개월 이펙터 세포에 그것의 수용 체에 바인딩 될 때. 두 수용체 바인딩 된 IgE 분자의 가변 영역에 항원을 후속 결합은 히스타민, 세린 프로테게이제 (예를 들어, 5) 및 시험대와 같은 혈관 확장을 일으키는 여러 프로 염증 중재자의 탈과화 및 방출로 이어지는 이펙터 세포에서 하류 신호 캐스케이드의 유도에 이어 그들의 교차 연결로이어집니다. 인터류킨 4(IL-4) 및 IL-13과 같은 사이토카인의 분비성은 염증성 T 도우미 2(Th2) 반응및 B 세포의 클래스 스위칭을 이그에 생성 플라즈마세포5,8,9로의 한부 로 전환시키는 데 책임이 있다. 한편, 방출된 혈소판은 기관지 수축을 유발하고, 백호리엔스는 혈관 누설뿐만 아니라 원활한 근육 수축을 자극하고, 천식 또는 알레르기성비염(10,11)으로이어지는 기도 염증에 중요한 역할을 한다.
앞서 언급한 대부분의 중재자를 분석하기 위한 연구 도구가 설립되었지만 몇 가지 주요 단점이 있습니다. 트립타제 분석법은 마스트 세포 활성화를 통해 전신 아나필락시스의 측정을 위한 적절한 임상 접근법이지만, 알레르기 진단의 민감도 와 특이성은 SPT와 같은 금 표준 방법에 비해 너무 부정확하다. 한편, 시스테닐 백혈구트리엔 어약은 β-락탐 또는 비스테로이드성항염증제(12)에대한 알레르기를 진단할 수 없다. 알레르기 반응에서 방출된 주요 중재자로서 히스타민의 측정을 위한 프로토콜은 이미 1960년대에 확립되었습니다. 일단 말초 혈액에서 풀어 놓이면, 히스타민은 히스타민 메틸 전달체에 의해 즉시 저하되어 단 몇 분의 플라즈마 반감기가 발생하여 분석이 매우 도전적입니다13. 그 불안정을 제외하고, 히스타민의 모니터링은 약물 알레르기뿐만 아니라 상업용 식품 단백질 및 말반독(12)에대한 낮은 특이성과 민감성을 갖는 것으로 나타났다.
이펙터 세포주를 가진 체외 모형은 방출 적인 소의를 능력을 발휘하기 위하여 알레르기성 환자에게서 basophils의 격리 그리고 재배의 노동 집약적인 절차에 대한 대안으로 소개되었습니다. 따라서, RBL-2H3 세포주 사용하래의 쥐 배혈백혈병-(RBL-) 기반 분석이3확립되었다. 이 세포주인간 IgE를 결합할 수 없기 때문에, 인간 IgE 플라즈마 막 수용체(FcθRI)의 α, β 및 γ 사슬에 처음으로 감염되었다. 몇몇 클론은 인간 α 사슬의 발현 수준 및 균질성에 대해 생성되고 시험되었으며, 그 중 클론 RBL-30/25는 체외 검사를 위한 가장 유망한 후보로 나타났습니다. 트랜스 감염 된 클론의 수용 체 활성화에 유도 하는 신호 폭포 칼슘 동원 분석을 통해 테스트 했다. 히스타민 방출을 위한 탈과화 및 대리를 나타내는 지표로서, 리소소말 효소 β-헥소사미니다제는 더 높은안정성(14)의유의한 장점을 갖는다. RBL-30/25 세포를 사용하여 중재자 방출은 최대 100%에 도달하고, 따라서, 알레르기 환자에서 파생된 세라를 시험하기 위하여 이용됩니다. 분석은 상업적인 알레르겐 추출물로 감세 세포에 도전한 후에 중재자 방출을 위해 시험되었습니다. 이는 상이한 제조자로부터 유래되고 진단(예를 들어, SPT) 또는 치료접근법3,15,16에사용되는 알레르겐 추출물의 조성물(총 단백질 함량에 관하여 최대 60배)의 엄청난 변이가 있다는 것을 발견하게 되었다.
본 원에서, 우리는 알레르기 기증자로부터 혈청을 사용하여 중재자 방출 분석기를 수행하기 위해 RBL 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수동 감질 동안, 혈청에서 IgE는 호포필 세포의 표면에 발현된 높은 친화성 FcθR1 수용체에 의해 포획된다. 항원 자극시, 항원특이적 EEs는 교차 연결되어 세포 탈과화및 β-헥소사미니다제의 방출을 유발한다. β-헥소사미니다제의 활성은 이후에 적합한 기판을 사용하여 측정된다. 분석의 경우, huRBL-2H3 세포가 사용되었고, 다음 프로토콜에서 huRBL이라고 불었다. 이 프로토콜은 1 μg/mL에서 0.1 pg/mL에 이르는 8단계의 희석된 표준 항원 희석 계열을 설명합니다.
Protocol
자작나무 꽃가루 알레르기 환자에서 파생 된 세라를 사용하는 윤리적 승인은 네덜란드 윤리위원회 (승인 번호: NL65758.018.18)에서 얻었다.
1. 안전 절차
- 실험 첫날(생물안전 수준 2)의 생물학적 안전 클래스 2 워크벤치를 사용하여 멸균 조건하에서 작업합니다. 인간의 혈청의 사용에 대한 기관의 안전 지침을 따르십시오.
2. 인간 세라의 비활성화를 보완
- 세포 배양플라스크에서 P3X63Ag8.653 세포(Ag8 세포라고 함)의 조밀한 배양을 수확하고 원심분리튜브로 이송한다.
- 이러한 세포에 대 한 다음 배양 배지사용: 수정 된 독수리의 최소 필수 매체 감소 혈 청 농도, 1% 페니실린-연쇄 절제술 신 (100 단위 펜., 0.1 mg/mL 스트렙.), 5% 열 비활성화 태아 송아지/소 혈청 (FCSi).
- 원심분리기 Ag8 셀은 실온에서 250 x g에서 5 분 동안.
- huRBL 배지에서 약 1 x 106 셀/mL의 최종 농도로 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다(알파 수정을 가진 최소 필수 중간 독수리, 4m L-글루타민, 5% FCSi, 1% G418 (100% 재고: 10g/125 mL dH2O).
참고: 향후 사용을 위해 패시징하여 Ag8 셀을 유지관리합니다. - Ag8 세포 현탁액에서 인간의 세라 1:10을 희석시. 분석에서 최종 혈청 희석은 1:20입니다.
참고: 특정 IgE가 낮은 세라의 경우 1:5(최종 희석 1:10)를 사용할 수 있습니다. - 37°C에서 1h 및 5%-7% CO2에대한 인큐베이션을 합니다.
3. huRBL 셀의 수확 및 파종
- T-75 세포 배양으로부터 배지를 허블세포를 만지지 않고 조심스럽게 흡인한다(huRBL 세포는 부착되어 있음). 세포가 약 50%-90% 컨할 수 있는지 확인합니다.
참고: 세포 합류에 따라, 조밀한 T-75 세포 배양 플라스크의 세포 함량은 일반적으로 1- 2 개의 96 웰 플레이트에 충분합니다. - 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)의 10mL를 추가하여 세포를 두 번 세척한다. 플라스크의 반대편에 DPBS를 추가하고 셀에 직접 사용하지 않습니다.
- DPBS를 흡기하고 세포 분리를 위해 사전 따뜻하게 된 1 x 트립신-EDTA (0.05 %/0.02 % EDTA 희석)의 5 mL을 추가합니다.
- 플라스크를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 플라스크를 조심스럽게 눌러 세포를 분리합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 huRBL 배지 또는 DPBS로 채워 트립신-EDTA를 희석시한다.
- 실온에서 5 분 동안 250 x g의 세포를 원심 분리합니다.
- 셀 카운팅을 위해 상류체를 흡인하고 5mL의 huRBL 배지에서 펠릿을 재중단한다.
- 세포를 계산하고 huRBL 배지에서 희석하여 2 x 106 세포/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- 멸균 96웰 플레이트를 사용하고 우물당 50 μL의 huRBL 셀 서스펜션을 추가하면 1 x 105 셀/웰에 해당합니다.
4. huRBL 세포의 수동 감쇠
- 250 x g에서5 분 동안 사전 배양 된 Ag8 / 혈청 서스펜션 원심 분리.
- Ag8 세포 펠릿을 방해하지 않고 huRBL 세포를 포함하는 각 웰에 원심 분리 된 Ag8/혈청 현탁액의 50 μL을 전송합니다.
- 민감화되는 항원 조절없음을 포함하지만 자극되지 않은 세포(항원을 첨가하지 않음)는 바닥 신호 고원/배경에 대한 표시역할을 한다. 배경 및 최대 리시스 컨트롤 웰은 혈청으로 민감하게 조절할 필요가 없습니다. 대신 우물을 제어하기 위해 huRBL 매체의 50 μL을 추가합니다.
- 뚜껑으로 접시를 덮고 하룻밤 사이에 37 °C 및 5 %-7 % CO2에서배양하십시오.
5. 항원 자극 탈과 및 중재자 방출
- 1x 티로데의 완충제(9.5g/L 티로데의 소금, 0.1% 소 세럼 알부민(BSA), 0.5 g/L 나트륨 탄산나트륨(NaHCO3)dH2O로항원 희석을 미리 준비한다. 우물당 100 μL의 최종 양이 필요합니다.
참고: 천연 공급원에서 정제되거나 재조합적으로 생산되는 모든 알레르겐이 1배 타이로드의 버퍼에서 안정될 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 분석 절차 전에 1x Tyrode의 버퍼에서 안정성 테스트를 수행합니다. 또는, 중수소 산화물(D 2O)에서 1x타이로드의 버퍼를 희석하여 분석의 신호 대 잡음 비율을 증가시합니다. - 단백질의 10 또는 1 μg/mL로 시작하는 반응 관에서 1:10 희석 시리즈의 관심있는 항원의 희석제 8희석제를 만듭니다.
참고: 항상 희석 계열을 미리 테스트합니다. 또는 전체 릴리즈 곡선을 커버하기 위해 1:10 희석 계열(예: 1:5, 1:20 또는 1:30)을 조정합니다. 또한, 시작 농도는 실험 설정에 따라 달라질 수 있다. - 96웰 플레이트에 도금된 huRBL 세포를 세척하려면, 흡수성 용지에 플레이트를 조심스럽게 흡수, 반전 및 눌러 먼저 세라 함유 세포 배지를 제거한다.
- 우물 당 1x 티로드의 버퍼의 200 μL로 셀을 세척합니다. 모든 우물을 비슷하게 취급하십시오.
참고: 세척 용액을 세포에 천천히 추가하여 방해하지 않도록 합니다. - 약 30s에 두고 세탁 단계를 총 3회 반복합니다.
- 마지막 시간 동안 세척 용액을 추가 한 후 항원 희석을 계속 할 준비가 될 때까지 용액을 우물에 둡니다.
참고: 너무 오랫동안 세포가 공기에 노출되지 않도록 하십시오. - 항원 용액의 100 μL을 각 웰에 전세 민감화 된 huRBL 세포를 포함하는 전송.
참고: 여러 가지 매개 변수를 분석하는 경우 희석 시리즈의 개별 샘플을 추가 비 결합 96-well 플레이트(huRBL 플레이트와 동일한 레이아웃 사용)로 전송하고 후후에 huRBL 전지 판에 직접 멀티채널 파이펫으로 전송합니다. 이렇게 하면 세포를 너무 오랫동안 공기에 노출시키는 것을 피할 수 있으며, 이로 인해 분석 성능이 저하될 수 있습니다(신호가 낮을 수 있음). - 커버 컨트롤 웰(최대 용해 및 민감하지 않은 배경 셀)은 1배 타이로드버퍼의 100 μL을 제공합니다. 항원으로 이러한 제어 우물을 자극하지 마십시오.
- 또한, 데이터 분석 중에 감감이 있는 세포의 항원 독립적 인 자발적 방출을 고려하는 데 필요한 희석 계열의 민감화 된 항원 유정에 1x Tyrode의 버퍼 100 μL을 추가합니다.
- 37°C에서 1h및 5%-7% CO2에대한 huRBL 세포를 배양한다.
6. β 헥소사미니다제 활동의 형광 측정
- 최대 용액 제어의 웰을 10 μL당 10% 트리톤 X-100으로 처리하고 세포를 완전히 lyse하고 β 헥소사미니다제의 100% 방출을 얻기 위해 제대로 혼합합니다.
- 50 μL의 기판 용액을 새로운 결합되지 않은 96웰 플레이트에 넣습니다. 한 96 웰 플레이트용 기판 용액: 0.1 M 구연선 분석 버퍼의 5mL, pH 4.5; 및 10mM 4-메틸럼벨리페릴 N-아세틸-β-D-글루코사미니드의 80 μL.
- 모든 우물의 셀 상수 50μL을 기판 용액을 포함하는 새로운 플레이트로 옮기다.
참고: huRBL 세포를 방해하지 않도록 주체를 huRBL 플레이트에서 조심스럽게 피펫합니다. - 37°C에서 1h의 기판 용액 및 세포 상주물로 플레이트를 배양하여 플루오로겐성 기판의 변환을 허용한다.
참고: huRBL 플레이트를 세포 생존 성 분석용으로 유지합니다. - 100 μL의 정지 용액(15g/L 글리신, 11.7g/L NaCl을 dH2O, pH 10.7로 용해)을 잘 넣습니다.
- 플레이트 판독기를 사용하여 360nm 발산 및 465 nm 방출에서 형광을 측정합니다.
7. 데이터 분석
- 백분율 릴리스의 기본 계산은 스프레드시트 소프트웨어를 사용합니다.
- 배경 빼기/기준 제거의 경우 다른 모든 우물에서 배경 우물의 평균을 뺍니다.
- 최대 용해 우물의 평균을 계산하고 희석 계열의 데이터를 백분율로 표현합니다. 이러한 방식으로 세포 리시스에 의한 최대 효소 방출로 정규화된 세포 방출의 백분율로 데이터를 표현할 수 있다.
- 완전한 투여량 응답 중재자 방출 곡선은 X축에 대한 로그온 농도가 있는 XY 그래프와 Y축에서 의 중재자 방출의 백분율로 가장 잘 표현된다.
- 노항원 제어값을 파선선으로 추가하여 배경 또는 하단 고원을 나타냅니다.
참고: 이 정규화 전략을 사용하여 유사하게 처리된 여러 세라를 비교할 수 있습니다. 직접 비교를 위해, 곡선당 최대값과 최소값의 평균으로 정의된 반최대 방출에 필요한 항원 농도(ng/mL)의 절반 최대 방출을 계산하는 것이 더 좋습니다. 반 최대 방출을 자극하는 항원 농도는 로자반스혈회귀 라인으로 반 최대 방출 값의 보간에 의해 계산됩니다.
Representative Results
중재자 방출 분석, huRBL 세포에 기초하여(도 1A 및 B),종 모양의 용량 반응 곡선(도 1C)을초래한다. 단순화된 데이터 표현의 경우, 반 최대 중재자 방출에 필요한 항원 농도는 선형 회귀(도1D)를사용하여 계산될 수 있다. 세포 생존성 분석은 자극에 사용되는 감광 혈청 또는 항원으로부터 유래된 세포독성 효과를 배제하기 위해 수행된다(도1E). 분석은 특정 항원에 대한 상이한 세라의 반응성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 우리의 경우, 자작 나무 꽃가루 알레르기 환자에서 파생 된 5 세라 중 4 명이 Bet v 1 자극에 응답했습니다. 세럼 #1은 가장 높은 중재자 릴리스를 보여 주었다(그림 2). 혈청 #5는 Bet v 1 자극에 반응하지 않았고, 따라서 다른 자작 나무 꽃가루 알레르기 항원 (예 : Bet v 2, profilin)에 반응 할 수 있습니다. 이러한 데이터는 Bet v 1이 IgE 매개 알레르기 증상을 담당하는 강력한 알레르겐임을 나타냅니다. huRBL 분석기를 이용하여, 동종 알레르겐에 대한 IgE의 상호 반응성을 평가할 수있다(도 3). 여기서, 자작나무 꽃가루 알레르기 환자 모두 Bet v 1에 잘 반응한 반면 환자 #2는 CA 1, 헤이즐넛에서 발견되는 Bet v 1 균질 식품 알레르겐에도 반응했습니다. 이러한 데이터에 따르면 환자 #2는 환자 #1보다 코르가 1-교차 반응성 IgE 수치가 높으며 헤이즐넛 소비시 구강 알레르기 증상을 유발할 가능성이 높습니다. 알레르겐의 돌연변이 변이체의 저자극성 성질의 평가조차도 분석및 그들의 야생형대응(도 4)에비교될 수 있다. 제공된 예에서, 접이식 변종의 방출 곡선은 야생형 알레르겐에 비해 더 높은 항원 농도로 이동하여 반최대 방출(도4B)을유발하는 데 필요한 항원 농도가 현저히 높은 결과로 하였다. 이러한 데이터는 생성된 돌연변이/접이식 변이체가 야생형 단백질에 비해 알레르기가 적다는 것을 암시한다. IgE 매개 탈과화를 트리거하는 이 감소된 힘은 접이식 의 저자극성 특성을 강조합니다. 이 분석체에 기초하여, 접이식 변종은 치료 중 IgE 관련 부작용을 감소시킬 수 있기 때문에 알레르겐 특이적 면역 요법을 위한 흥미로운 후보이다.
그림 1: 인간화 된 RBL 세포 및 IgE-알레르겐 교차 연결 유도 β-헥소사미니다제 방출의 대표적인 종 모양 곡선. RBL 세포는 배양 플라스크를 부착하여 자신을 부착하려고 할 때 막대모양(A)을부여합니다. 세포를 수확할 수 있는 이상적인 수준의 인플루엔지는 90%(B)를 넘지 않습니다. 세포는 각각 40배와 10배의 배율 하에 나타난다. 재조합 Bet v (rBet v 1), 주요 자작나무 꽃가루 알레르기 항원(C)와도전에 반응하는 자작 나무 꽃가루 알레르기 개인의 인간 혈청으로 민감해진 세포. 중재자 방출에 대한 대리로서, β 헥소사미니다제 활성은 세포 초나티체에서 측정된다. 종 모양의 곡선은 알러지 유발 물질의 과잉으로 인해 IgE에 항원 전형의 단일 적인 직업에서 발생하며, 이는 높은 항원 농도에서 알레르겐-IgE 교차 연결을 경쟁적으로 억제합니다. 높은 알레르겐 농도에서 낮은 방출에 대한 또 다른 설명은 과잉 항원존재내 세포 내 통로의 억제이다. 반최대 방출을 얻기 위해 필요한 알레르겐 농도의 판정을 위해, 중재자 방출 곡선의 경사의 선형 부분을 나타내는 실험값에 기초한 로그산성 회귀라인이사용되었다(D). 빨간색 점선은 계산에 사용되는 로개심 회귀 선을 나타냅니다. 회귀 선의 공식은 빨간색으로 표시됩니다. 절반 최대 릴리스는 절반 최대 릴리스 = (최소 릴리스 값 + 최대 릴리스 값)/2로 정의됩니다. 이 예에서 계산된 절반 최대 릴리스는 20.6%였습니다. 본 실험에 사용된 대표적인 인간 혈청은 huRBL 세포를 이용한 배양을 위해 1:20을 희석시켰으며, 자극에 사용되는 항원 농도는 Bet v 1의 100 μg/mL에서 0.004 pg/mL까지 다양하였다. 이 경우 MTT 분석이 남은 세포와 함께 수행되어 항원 자극 후 나머지 세포와 함께 수행되어 감광 혈청의 영향뿐만 아니라 세포 생존가능성 및 세포수(E)에대한 항원 희석의 영향을 평가하였다. 처리되지 않은 배경 세포 및 리스 셀(최대 lysis)은 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: β 헥소사미니다스의 대표 곡선은 다섯 가지 인간 세라의 출시. rBet v 1의 동일한 항원 농도 범위는 다른 자작 나무 꽃가루 감이 있는 개인의 세라로 민감화 된 huRBL 세포로 배양되었다. 그들의 현상의 엄격에 대응하는 다른 환자 사이 백분율 방출의 명확한 다름이 있습니다. 환자 #5는 주요 자작 나무 꽃가루 알러지 유발 물질 내기 v 1에 반응하지 않습니다. 이러한 중재자 방출 곡선을 얻기 위해 사용되는 5개의 인간 세라 모두 huRBL 세포를 이용한 배양을 위해 동등하게 1:20을 희석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배작자 꽃가루의 세라로부터 유래된 IgE의 교차 반응성은 Bet v 1 동종 헤이즐넛 알러지 유발 물질 코르 a 1을 가진 환자를 민감화하였다. 자작 나무 꽃가루에 민감 환자의 두 대표 세라 강하게 내기 v 1뿐만 아니라 동종 알레르겐 코르 에 덜 정도 반응 1. 환자 2는 코르에 대한 유의한 반응을 나타내며, 따라서 중제기 방출이 거의 무시할 수 있는 환자 1에 비해 헤이즐넛 소비시 구강 알레르기 증상을 나타낼 가능성이 있다. 점선은 인체 세라로 민감하지만 알레르겐으로 자극되지 않는 세포인 노항원 제어를 나타내며, 따라서, 바닥 신호 고원/배경에 대한 표시역할을 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: rBet v 1 야생 유형과 저자극성 접이식 사이의 백분율 방출 비교. 자작나무 꽃가루 감각이 있는 개인의 동일한 혈청은 rBet v 1 야생형(wt)과 주요 자작나무 꽃가루 알레르기항의 저자극성접이식 변종(A)으로 배양되었다. 중재자 방출은 두 항원모두에서 볼 수 있지만, 동일한 백분율 방출을 위해 접이식 변형을 야생 형 rBet v 1과 비교할 때 더 높은 항원 농도로 명확한 변화가 있습니다. 상이한 항원의 백분율 방출의 차이를 비교하는 표준 방법은 반 최대방출(B)을달성하는 데 필요한 항원 농도를 계산하는 것이다. 이것은 일반적으로 생물학적 복제에서 수행됩니다 (다른 인간 세라에서 각 알레르겐에 대한 동일한 항원 범위의 테스트). 일반적으로, 어떤 중요한 결론을 도출하기 위하여는, 중재자 방출은 적어도 8 에서 10개의 다른 환자에서 세라로 수행됩니다. 여기서 네 개의 서로 다른 세라의 결과가 예로 그려져 있습니다. 쌍t-테스트는 통계 분석에 사용되었습니다. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; p ≤ 0.001; p ≤ 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 잠재적인 질문 및 문제 해결 | 용액 |
| 변경된 세포 응답성으로 인한 분석 간 가변성 | 세포 통로 주기 수가 20~30개 통로를 초과하지 않는지 확인합니다. 향후 실험을 위해 초기 통로에서 냉동 주식을 만듭니다. |
| 오히려 기술적 인 복제 (다른 세라의 사용)에 의존한다. | |
| 세라는 특정 IgE의 낮은 수준을 포함 | 1:20 대신 최종 혈청 희석을 더 낮게 사용할 수 있습니다(즉, 1:10). 반대로, 특정 IgE의 높은 수준을 포함하는 세라는 더 희석 될 수있다 (1:30 또는 1:40). |
| 분석기를 수행하기에 충분한 셀 | T-75 플라스크의 합류가 약 50-90%인지 확인합니다. 통로 더 많은 플라스크. |
| 세라의 세포독성 효과, 즉 불완전한 보완 불활성화로 인한 | 중재자 방출 분석 외에도 세포 생존가능성 분석기를 수행한다. 불완전한 보완 활성화를 피하기 위해 Ag8 농도를 증가시면 됩니다. |
| 낮은 신호 | dH2O 대신 중수소 산화물(D 2O)에서 1x 티로데의버퍼를 희석하거나 관심 있는 알레르겐에 대해 특정 IgE의 높은 수준을 가진 세라를 사용하여 분석의 신호 대 잡음 비율을 개선합니다. |
| 알레르겐은 타이로드의 완충제에서 안정적이지 않습니다(예: 강수량) | 분석 절차 전에 1배 타이로드의 버퍼에서 안정성 테스트를 합니다. Tyrode의 버퍼를 대체하는 것은 권장되지 않습니다. |
| 각 알레르겐에 적합한 시작 농도를 찾는 문제 | 전체 릴리즈 곡선을 커버하기 위해 희석 계열의 적응(희석 단계 더 많은 단계, 1:20 희석 대신 1:10). |
| 저음/없음 신호로 표시되는 분석 성능 저하 | 세라 또는 항원 자극(예: 효소 알레르겐)에서 세포 독성 효과를 피하십시오. 조심스럽게 셀을 씻고 담그십시오. 공기에 너무 오래 노출되지 않도록 하고 세포가 건조되는 것을 방지하십시오. |
| 하단 신호 고원에 도달하면 어떻게 알 수 있습니까? | 접시에 "항원 없음" 컨트롤을 추가합니다. 이들은 단지 1x Tyrode의 버퍼로 자극되었지만 알레르겐없이 자극 된 감질 세포입니다. |
| 최대 리시스 웰 외에 긍정적인 컨트롤이 필요합니까? | 추가 양성 대조군으로서 탈과란을 유발하는 것으로 알려진 혈청 및 항원 조합이 사용될 수 있거나 항FcθR1 항체를 사용할 수 있다. |
| 얼마나 많은 우물이 필요합니까? | 즉, 당신의 적정 시리즈, 당신이 분석할 항원 및 세라의 수에 따라 달라집니다. 테스트할 세라/항원 수에 따라 96웰 플레이트의 레이아웃을 계획합니다. "항원 컨트롤 없음", 배경 세포 (민감하지 않은, 비 자극)뿐만 아니라 최대 용액 우물을 추가하는 것을 잊지 마십시오. |
| 얼마나 많은 세라를 테스트해야 합니까? 그리고 복제가 필요합니까? | 분석은 매우 강력하지만, 변경 된 세포 응답성으로 인해 몇 가지 분석 - 투 - 분석 가변성이 있다. 따라서, 오히려 생물학적 복제에 의존하는 것이 좋습니다 (다른 세라를 사용하여) 기술적 복제에 보다. 최소 8개의 서로 다른 세라가 알레르겐을 분석하기에 충분합니다. 그러나 도 4B에 도시된 바와 같이, 이미 더 적은 세라를 사용하여 상당한 결과를 얻을 수 있다. |
표 1: 문제 해결.
Discussion
본 명세서에서 설명된 huRBL 세포 계측기 방출 분석법은 임의의 실험실에서 쉽게 수행하고 구현할 수 있는 견고한 방법입니다. 유일한 요구 사항은 세포가 멸균 조건하에서 재배될 필요가 있다는 것입니다. 분석은 환자의 IgE 교차 연결 및 바소필 탈립17을연상시키기 위하여 알레르기 항원 또는 알레르기 성 근원의 가능성을 평가하기 위하여 이용됩니다. 분석은 관심있는 알레르겐을 인식하는 특정 IgE의 높은 수준의 환자의 혈청이 가능한 한 알레르기 항원 또는 알레르기 성 소스에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 분석 성능저하를 초래할 수 있는 잠재적인 세포독성 효과를 설명하기 위해 중재자 방출 분석 외에도 세포 생존 가능성 분석작업을 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 세라 또는 다른 혈청 유래 세포 독성 효과의 불완전한 보완 불활성화 때문일 지도 모릅니다. 항원 자체조차도 예를 들어, 프로테오리틱/효소 활성으로 인해 huRBL 세포에 해를 끼칠 수 있다. 우리는 일반적으로 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로미데를 사용하여 잠재적인 세포 독성 효과를 평가하고 있습니다. 분석체는 세포 상체가 수집되고 옮겨진 후에 남은 huRBL 세포로 쉽게 수행될 수 있다(프로토콜의 단계 6.3. 참조). ELISA 및 서부 블로팅과 같은 다른 면역 화학 적 방법과 비교하여, 알레르겐-IgE 결합에 기초한 개별 알레르겐 또는 복잡한 추출물의 알레르기 성 잠재력을 결정하기위한, 이 분석법은 알러지 유발 물질에 IgE의 결합뿐만 아니라 검출 할 수 있지만, 인간IgE와 알레르겐 의 기능을 측정 할 수 있습니다, 이그E -media.. 따라서, 환자의 세라를 이용한 알레르기 증상 전 생체 의 중증도를 연구하는 데 도움이 될 수 있다. 분석체는 분석이 RBL-2H3 세포를 활용하기 때문에 고전적인 수동 분리 성 아나필락시스 테스트보다 더 일관되고 효율적이라고 보고되며, 이는 상대적으로 취급하기 쉽고, 돛대 세포 또는 인간 적인 basophils19,20과같은 1 차세포에 비해 결과에 더 적은 가변성을 생성한다. 이 외에도, 분석법은 알레르겐의 생물학적 활성을 양호하게 나타내며 주어진 복잡한 샘플3에서총 알레르겐 함량을 정확하게 추정할 수 있다. 프로토콜의 특정 단계를 해결하려면 표 1을참조하십시오.
이 버전의 중재자 방출 분석법의 적용가능성에 관해서는, 주로 연구 목적뿐만 아니라 생물학적 활성에 기초한 알레르기 추출물의 표준화를 위해 사용되었습니다. 여기에는 SPT 솔루션의 상이한 배치, 도발 테스트 솔루션뿐만 아니라 알레르겐 특이적 면역 요법에 사용되는 추출물의 분석이 포함됩니다. 꽃가루, 고양이 dander, 집 먼지 진드기 및 땅콩 추출물뿐만 아니라 꿀벌 독3,17,21에도시된 바와 같이. 이 기술은 땅콩, 우유, 밀 및계란(22)과같은 복잡한 식품에서 최소한의 알레르기 성분을 감지할 수 있기 때문에 특히 식품 알레르기 진단에 적용될 수 있다. 이러한 점에서, 또한 tropomyosins와 같은 동물성 식품 알레르겐의 알레르기성 평가를 위한 귀중한 도구로 보고되고,비알레르겐(23)으로부터강력한 알레르겐을 구별하는 데 도움이 될 수 있다. 연구 도구로서, 분석법은 알러지 유발 물질에 대한 리간 결합의 영향과알레르기성(24,25)에미치는 영향을 평가하기 위해 식품 가공의 영향을 연구하는 데 사용된다. 예를 들어, Bet v 1에서 리간드에 대한 바인딩은 열 및 프로테올리컬안정성(25)의증가를 유발했음에도 불구하고 알레르겐-IgE 교차 연결에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 분석은 환자의 반응성을 경미한 및 주요 알레르겐과 비교하고, 배브 v 1 및 동형 식품 알러지 유발 물질 코르 a1(도 3)을사용하여 당사의 예에서 와 같이 알레르겐 균질 및 동소형태의 상호 반응성을 조사하는 데 사용될 수 있다. 알레르겐 이소폼에 대해, 중재자 방출 분석체는 래그위드꽃가루(Ambrosia artemisiifolia)에서가장 강력한 IgE 반응성 이소폼으로서 주요 알러지 유발 물질 암1을 식별하는 데 사용되었다. 비교하여, 다른 두 개의 확인된 등화꽃 추출물, Amb a 1.02 및 Amb a 1.03, 환자의 IgE26에대한 반응성이 감소된 것으로 나타났다.
최근 몇 년 동안, 알레르겐의 잠재적인 항알레르기 화합물및 새로운 저자극성 변이체를 연구하기 위해 분석이 적용되어 알레르겐 특이적 면역요법에 적합한 후보자의식별을돕는27,28. 또 다른 새로운 접근법은 알레르겐 특이적 면역 요법 과정에서 치료 효능을 모니터링하기 위해 분석법을 사용하는 것입니다. 이와 관련하여, 우리의 연구그룹은 huRBL 분석 억제 시스템을 개발하여 알레르겐 특이적면역요법(29)에서환자의 증상 점수 감소와 잘 상관관계가 있다. 분석은 또한 알레르겐 유도 된 IgE 매개탈란화 30에TGFβ1의 면역 억제 효과를 연구하기 위해 제안되었다.
분석의 한계는 huRBL 세포가 비만 세포 또는 basophils의 몇몇 특징을 가지고 있더라도, 그(것)들이 완전히 이펙터 세포의 자연적인 기능을 모방하지 않는다는 것입니다. 예를 들어, 마스트 세포는 RBL-2H3세포(31)에서완전히 결핍된 반면, 병원균 인식에 필요한 패턴 인식 수용체 톨-라이크 수용체 4(TLR4)를 널리 발현한다. 기능의 차이로 인해 분석은 데이터를 해석할 때 염두에 두어야 하는 실제 상황을 완전히 모방하지 않습니다. 또한, huRBL 세포는 암성 혈관세포이기 때문에, 배양 조건의 변화와 장기간 배양은 상이한 실험실 들 사이에서 변경된 결과로 이끌어 내는 현상형 차이로 이끌어 낼 수있다(20). 또 다른 양태는 높은 알레르겐 농도가 높은 프로테아제 또는내독신(18)의존재로 인해 비-IgE 매개 탈과화를 초래할 수 있기 때문에 이 방법을 적응할 때 고려해야 할 알레르겐 농도의 선택이다. 그밖 한계는 상대적으로 높은 특정 IgE 수준 (RAST 급 5-6)를 가진 인간 세라에 대한 의존성 및 매일 임상 루틴에서 기술을 구현하기 위하여 극복될 필요가 있는 장애물남아 있는 세포 배양 시스템에 대한 필요성입니다.
이러한 제한 외에도 huRBL 분석은 알레르기 질환의 진단 및 치료를 위한 귀중한 연구 도구를 나타내며 광범위한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 분자 알레르기학부의 스테판 비에스 교수, 폴-에를리히-인스티투트, 랑겐, 독일, 인간화/FcθRI-전염된 RBL 세포를 제공하고 이 연구 방법론 논문을 작성하는 데 동의한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 훌륭한 피드백을 제공 파티마 페레이라 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 실험 면역학의 학과의 박사 로널드 반 리와 박사 Jaap Akkerdaas, 암스테르담 대학 의료 센터, 위치 AMC, 암스테르담, 네덜란드, 프로젝트 BM4SIT의 과정에서 생성 된이 방법 논문에 제공 된 대표 데이터를 게시하는 데 동의를 부여에 감사드립니다 - 알레르기에 대한 혁신 (www.BM4SIT.eu). 저자의 작품은 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 P32189), 잘츠부르크 우선 프로그램 알레르기 - 암 - 바이오 나노 연구 센터, 오스트리아 과학 기금 (FWF W01213)에 의해 투자 암과 알레르기 - ICA박사 프로그램 면역에 의해, 그리고 유럽 연합 (EU)의 제 7 프레임 워크에서 BM4SIT 프로젝트 (보조금 번호 601763)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
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