Summary
Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.
Abstract
Negli ultimi anni, il campo della macropinocitosi è cresciuto rapidamente. La macropinocitosi è emersa come un meccanismo centrale attraverso il quale le cellule immunitarie innate mantengono l'omeostasi e l'immunità dell'organismo. Allo stesso tempo, e in contrasto con il suo ruolo omeostatico, può anche guidare varie patologie, tra cui il cancro e le infezioni virali. A differenza di altre modalità di endocitosi, gli strumenti sviluppati per studiare la maturazione dei macropinosomi rimangono sottosviluppati. Qui il protocollo descrive gli strumenti di nuova concezione per studiare l'ambiente redox all'interno del lume dei macropinosomi precoci e in maturazione. Vengono descritte le metodologie per l'utilizzo della microscopia a fluorescenza ratiometrica nella valutazione del pH, della produzione di specie reattive dell'ossigeno e della capacità degradativa all'interno del lume dei singoli macropinosomi nelle cellule vive. Le misurazioni di singoli organelli offrono il vantaggio di rivelare l'eterogeneità spaziotemporale, che spesso viene persa con approcci basati sulla popolazione. L'accento è posto sui principi di base della microscopia a doppio fluoroforo, tra cui la selezione della sonda, la strumentazione, la calibrazione e i metodi a singola cellula rispetto a quelli basati sulla popolazione.
Introduction
La macropinocitosi si riferisce all'assorbimento di grandi quantità di fluido extracellulare in organelli citoplasmatici legati alla membrana chiamati macropinosomi1,2. È un processo altamente conservato eseguito da organismi unicellulari viventi liberi, come l'ameba Dictyostelium spp. 3, così come antozoi4 e metazoi2. Nella maggior parte delle cellule, la macropinocitosi è un evento indotto. La legatura dei recettori della superficie cellulare induce la protrusione delle estensioni della membrana plasmatica guidate dall'actina denominate volant. Una frazione di questi volant, da qualche meccanismo poco compreso, sigillano le loro punte distali per formare macropinosomi (anche se al di là dello scopo di questo documento di metodi, per revisioni dettagliate sulla meccanica della macropinocitosi, si prega di fare riferimento ai riferimenti1,2,5,6,7). Lo stimolo extracellulare che induce la macropinocitosi è più spesso un fattore di crescita solubile5,8. Di conseguenza, l'evento macropinocitico consente l'ingestione di un bolo di materiale extracellulare da cui la cellula può ricavare metaboliti utili per facilitare la crescita. Sfortunatamente, questo percorso per la consegna dei nutrienti può anche guidare la patologia. Alcune cellule tumorali ospitano mutazioni che provocano macropinocitosi continua o costitutiva. L'erogazione continua di nutrienti facilita la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali ed è stata collegata a tumori particolarmente aggressivi9,10,11,12,13. Allo stesso modo, i virus possono indurre macropinocitosi per ottenere l'accesso alle cellule ospiti, guidando così la patologia virale14.
La macropinocitosi funziona anche nel mantenimento dell'immunità agli agenti patogeni. Alcune cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche si impegnano nel campionamento costitutivo e aggressivo del fluido extracellulare tramite macropinocitosi6,15,16. Questa modalità di macropinocitosi è incredibilmente attiva e una singola cellula dendritica può inglobarsi con un volume di liquido extracellulare equivalente al proprio peso ogni ora17. Nonostante questo campionamento costitutivo, i macrofagi e le cellule dendritiche non si replicano in modo incontrollabile come fanno le cellule tumorali, ma sembrano elaborare il materiale extracellulare in modo tale che le informazioni possano essere estratte per informare sulla presenza, o addirittura sull'assenza, di potenziali minacce. Le informazioni vengono estratte come i) modelli molecolari associati ai patogeni che possono essere letti dai recettori di riconoscimento dei patogeni intracellulari e ii) brevi tratti di amminoacidi che possono essere caricati sulle principali molecole di istocompatibilità per lo screening da parte delle cellule del sistema immunitario adattativo16,18,19. Se i patogeni sovvertono questo percorso per l'elaborazione delle informazioni da parte delle cellule immunitarie non è al momento chiaro.
Nonostante questi ruoli ben definiti e critici per la macropinocitosi sia nel mantenimento dell'immunità che nell'omeostasi e in contrasto con altre modalità di endocitosi più comunemente studiate, si sa poco del funzionamento interno (luminale) dei macropinosomi. Lo sviluppo di protocolli e strumenti standardizzati per studiare la biochimica luminale dei macropinosomi non solo ci aiuterà a comprendere meglio la loro biologia unica, ma fornirà informazioni che possono essere sfruttate per nuove strategie terapeutiche, tra cui la somministrazione di farmaci20. Questo metodo manoscritto si concentrerà su strumenti recentemente sviluppati per sezionare, a livello di singolo organello, vari aspetti della biochimica luminale dei macropinosomi.
I fluorofori possono essere utilizzati per misurare specifiche biochimiche di organelli se i) si dividono preferenzialmente nel compartimento di interesse e/o ii) subiscono cambiamenti spettrali in risposta al parametro di interesse. Ad esempio, nel caso del pH, le basi deboli fluorescenti, come l'arancio acridina, il viola cresile e i coloranti LysoTracker si accumulano preferenzialmente negli organelli acidi. Pertanto, la loro intensità relativa è un'indicazione approssimativa che l'organello etichettato è acido. Altri fluorofori pH-responsive, come fluoresceina, pHrodo e cypHer5e, subiscono cambiamenti spettrali al momento del legame ai protoni (Figura 1A-C). Le modifiche all'emissione di fluorescenza dei fluorofori sensibili al pH possono quindi fornire un'utile approssimazione del pH. L'uso di singoli fluorofori, tuttavia, presenta una serie di svantaggi. Ad esempio, le modifiche al piano focale, il fotosciviazione e le modifiche al volume dei singoli organelli, un evento comune nei macropinosomi21, possono indurre cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei singoli fluorofori e questo non può essere facilmente corretto per22. Le valutazioni a singola lunghezza d'onda, sebbene utili per visualizzare compartimenti acidi, sono quindi puramente qualitative.
Un approccio più quantitativo consiste nell'indirizzare il fluoroforo sensibile ai parametri insieme a un fluoroforo di riferimento all'organello di interesse. Il fluoroforo di riferimento è idealmente insensibile ai cambiamenti biochimici all'interno dell'organello (Figura 1D-F) e può quindi essere utilizzato per correggere i cambiamenti nel piano focale, nel volume organellare e, in una certa misura, nel fotosableaching23. Utilizzando questo approccio, denominato fluorescenza del doppio fluoroforo, la correzione può essere ottenuta generando un rapporto tra l'emissione di fluorescenza del fluoroforo sensibile ai parametri e il fluoroforo di riferimento.
Qui, il protocollo utilizzerà il principio dell'imaging ratiometrico a doppio fluoroforo per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. In ogni caso, verrà selezionato un fluoroforo sensibile al parametro di interesse e un fluoroforo di riferimento. Al fine di indirizzare i fluorofori specificamente ai macropinosomi, saranno accoppiati covalentemente a 70 kDa destrano, che è preferibilmente incorporato nei macropinosomi24. Tutti i test saranno eseguiti in cellule Raw264.7 ma possono essere adattati ad altri tipi di cellule. Ove possibile, i rapporti di fluorescenza saranno calibrati rispetto a una curva di riferimento per ottenere valori assoluti. È importante sottolineare che tutte le misurazioni saranno eseguite in cellule vive per la valutazione dinamica e quantitativa dell'ambiente luminale dei macropinosomi.
Quando si selezionano fluorofori sensibili al pH, è necessario valutare una serie di considerazioni. Il primo è il pKa del fluoroforo, che indica l'intervallo di valori di pH a cui la sonda sarà più sensibile. Se si presume che poco dopo la formazione, il pH del macropinosoma sarà vicino a quello del mezzo extracellulare (~pH 7,2) e che si acidificherà progressivamente attraverso interazioni con endosomi e lisosomi tardivi (~pH 5,0), allora dovrebbe essere selezionata una sonda con un pKa sensibile all'interno di tale intervallo (Figura 2C). La fluoroforo fluoresceina, che ha un pKa di 6,4, è sensibile in modo ottimale all'interno di tale intervallo. È stato ampiamente utilizzato per misurare altri organelli simili, come i fagosomi, e sarà il fluoroforo di scelta in questo manoscritto22,25. Come fluoroforo di riferimento, verrà utilizzata la tetrametilrodamina, che è insensibile al pH (Figura 1E). Altri fluorofori, come pHrodo e cypHer5e possono essere sostituiti dalla fluoresceina in cui le proprietà spettrali della fluoresceina corrispondono ad altre variabili sperimentali. Alcuni fluorofori di riferimento suggeriti per pHrodo e cypHer5e sono mostrati nella Figura 1.
Una seconda considerazione è il metodo con cui i due fluorofori saranno mirati specificamente ai macropinosomi. Il destrano della dimensione 70 kDa, che ha un raggio idrodinamico di circa 7 nm, non si attacca in modo non specifico alle cellule ed è incorporato nei macropinosomi, ma non nelle fosse rivestite di clatrina o nelle caveole, e quindi segna i macropinosomi (Figura 2A e Figura 3A, B)16,24,26. In questo protocollo, il destro di destrano e la tetrametilrodamina (TMR) etichettati con fluoresceina da 70 kDa saranno utilizzati rispettivamente come sonde sensibili al pH e di riferimento.
Nelle cellule immunitarie innate, la macropinocitosi e la fagocitosi rappresentano le due principali vie per l'internalizzazione del materiale esogeno per l'elaborazione e la successiva presentazione alle cellule della risposta immunitaria adattativa27. Il controllo attento e coordinato della chimica redox del lume di fagosomi e macropinosomi è fondamentale per l'elaborazione specifica del contesto del materiale esogeno. Forse il regolatore più studiato degli eventi ossidativi nei fagosomi è la NADPH ossidasi, un grande complesso multi-subunità che produce grandi quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume dei fagosomi28. Infatti, la sua attività è fondamentale per l'appropriata elaborazione dell'antigene all'interno dei fagosomi29,30. Tuttavia, l'attività della NADPH ossidasi sulle membrane macropinosomiali non è stata esplorata.
In questo protocollo, l'estere succinimidilico H2DCFDA viene utilizzato per misurare gli eventi ossidativi all'interno del macropinosoma. Questa è una forma modificata di fluoresceina (2',7'-dicloroidoidrofluoresceina diacetato), che è minimamente fluorescente nella sua forma ridotta. Dopo l'ossidazione, la sua emissione di fluorescenza aumenta in modo significativo. Vale tuttavia la pena notare un avvertimento significativo di H2DCFDA - poiché si basa sulla fluorofora fluoresceina, la sua fluorescenza è anche spenta in compartimenti acidi e bisogna fare attenzione a controllare questa variabile quando si progettano esperimenti28. Simile all'approccio per la misurazione del pH, l'estere succinimidilico H2DCFDA sarà fissato covalentemente a 70 kDa destrano e il destrano da 70 kDa con etichetta TMR sarà usato come fluoroforo di riferimento (Figura 3A).
L'ovalbumina fluorescente sarà utilizzata per misurare la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. L'ovalbumina utilizzata qui è densamente etichettata con un colorante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL auto-spento. Dopo la digestione, i peptidi fortemente fluorescenti etichettati con coloranti vengono liberati. Poiché l'ovoalbumina non può essere facilmente coniugata a 70 kDa destrano, le cellule con destrano da 70 kDa e ovalbumina in fase fluida etichettati con TMR saranno co-incubate. Il segnale TMR verrà utilizzato per generare una maschera macropinosomica durante l'analisi post-imaging e il segnale liberato dall'ovoalbumina digerita sarà misurato all'interno della maschera (Figura 3B).
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Coltiva cellule Raw264.7 a 37 °C e dal 5% di CO2 al 70% di confluenza in RPMI integrato con il 10% di siero inattivato dal calore.
- Un giorno prima del test, seminare raw264,7 cellule ad una densità di 5 x 104 cellule per pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzo contenga 100 μL di terreno di coltura. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti abbia lati neri e un fondo di vetro per l'imaging.
NOTA: Qui, le piastre a 96 pozzi sono state utilizzate per l'imaging. Le piastre a 96 pozzetti consentono l'uso di piccole quantità di cellule e reagenti rispetto alle camere di imaging più grandi. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi camera progettata per l'imaging di cellule vive e i reagenti possono essere scalati di conseguenza. - Il giorno del test, verificare se i pozzi sono confluenti almeno al 70%.
2. Misurazione del pH dei macropinosomi
- Preparare le cellule come nella sezione 1.
- Lavare tutti i pozzi con 100 μL di HBSS a 37 °C.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta con fluoresceina.
- Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
- Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
- Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati.
- Regolare i parametri di eccitazione/emissione per ciascun fluoroforo in base alle esigenze.
NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. La fluoresceina è stata eccitata con una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x ed è stato acquisito un volume Z di 10 μm a intervalli di 0,5 μm. - Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
- Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi sono rimasti a fuoco su tutta la piastra.
- Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.
3. Calibrazione in situ del pH del macropinosoma
- Durante l'acquisizione dell'immagine, preparare 1 L di soluzione ricca di potassio (K+-rich) contenente 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2e 5 mM di glucosio. Integrare un volume di 400 mL della soluzione ricca di K+con 25 mM HEPES (da una soluzione stock da 1 M, pH 7,2) e un volume separato di 400 mL con 25 mM MES (da una soluzione stock 0,5 M, pH 6,0).
- Regolare un'aliquota di 50 mL della soluzione ricca di K+tamponata con HEPES da 25 mM a pH 7,5 utilizzando 10 M HCl o 10 M KOH secondo necessità.
- Regolare tre aliquote separate da 50 mL della soluzione ricca di K+tamponata con MES da 25 mM a pH 6,5, pH 5,5 e pH 5,0 utilizzando 10 M HCl o 10 M KOH secondo necessità.
NOTA: Un tampone di acido acetato-acetico può essere preferibile per soluzioni a pH più basso. - Dopo il completamento dell'acquisizione dell'immagine, rimuovere l'HBSS dalla piastra a 96 pozzi contenente le celle e sostituirlo con la soluzione ricca di K+che si trova a pH 7,5.
- Aggiungere nigericina ad una concentrazione finale di 10 μg/ml.
NOTA: La nigericina è uno ionoforo che scambia K+ per H+. Impostando la concentrazione K+ della soluzione ricca di K+su un valore che si avvicina alla concentrazione K+ del citosol, si può garantire che la nigericina blocca il pH del macropinosoma a quello del citosol, che a sua volta riflette il pH del tampone di calibrazione. - Posizionare la piastra sul microscopio e acquisire le immagini di ciascun pozzo utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione di cui sopra.
- Ripetere i passaggi 3.5 e 3.6 per ogni buffer di calibrazione.
4. Analisi dei dati per il pH del macropinosoma
- Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo sia dal TMR che dal canale della fluoresceina.
- Generare una maschera sul canale TMR. Per generare una maschera, convertire l'immagine in un'immagine binaria selezionando Regola soglia > > Applica. Quindi, evidenziare l'immagine binaria e selezionare Modifica > selezione > Crea maschera.
- Applicalo sia alle immagini TMR che a quella fluoresceina. A tale scopo, evidenziare la maschera e selezionare Modifica > selezione > Crea selezione. Fare clic sull'immagine TMR e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale TMR. Allo stesso modo, fare clic sull'immagine della fluoresceina e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale OB.
- Registrare l'intensità di TMR e fluoresceina per ogni macropinosoma all'interno delle maschere.
- Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.3 per le immagini acquisite nella calibrazione in situ.
- Dividere l'intensità della fluoresceina per l'intensità TMR per generare il rapporto fluoresceina:TMR.
- Traccia il pH rispetto ai rapporti fluoresceina:TMR per le immagini di calibrazione.
- Adatta una curva ai dati di calibrazione.
- Interpolare i dati per ogni punto temporale del corso temporale per ottenere valori assoluti di pH.
5. Misurazione degli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi
- Preparare le cellule come nella sezione 1.
- Un giorno prima del test, preparare l'estere succinimidilico H2DCFDA etichettato 70 kDa destrano riconsoscendo 10 mg di 70 kDa destrano-ammino in 1 mL di soluzione di bicarbonato di sodio 0,1 M (pH 8,3). Aggiungere 1 mg dell'estere succinimidyl H2DCFDA alla soluzione di destrano-ammino e incubare per 1 ora. Dialyze il destrano da 70 kDa con etichetta H2DCFDA contro PBS. Non conservare per più di 1 giorno poiché il destrano da 70 kDa etichettato H2DCFDA si ossida al momento della conservazione.
- Il giorno del test, lavare tutti i pozzi con 100 μL di HBSS a 37 °C.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con marchio H2DCFDA.
- Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
- Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
- Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati e regolare i parametri di eccitazione / emissione per ciascun fluoroforo secondo necessità.
NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. H2DCFDA è stato entusiasta di una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x e un volume Z di 10 μm è stato acquisito a intervalli di 0,5 μm. - Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
- Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi rimangono a fuoco su tutta la piastra.
- Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.
6. Analisi dei dati per eventi ossidativi all'interno di macropinosomi
- Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo da entrambi i canali TMR e H2DCFDA.
- Generare una maschera sul canale TMR. Per generare una maschera, convertire l'immagine in un'immagine binaria selezionando Regola soglia > > Applica. Quindi, evidenziare l'immagine binaria e selezionare Modifica > selezione > Crea maschera.
- Applicare la maschera alle immagini TMR e H2DCFDA. A tale scopo, evidenziare la maschera e selezionare Modifica > selezione > Crea selezione. Fare clic sull'immagine TMR e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale TMR. Allo stesso modo, fare clic sull'immagine H2DCFDA e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale H2DCFDA.
- Registrare l'intensità TMR e H2DCFDA per ogni macropinosoma all'interno delle maschere.
- Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
- Dividere l'intensità H2DCFDA per l'intensità TMR per generare un rapporto H2DCFDA:TMR.
- Traccia il rapporto H2DCFDA: TMR contro il tempo.
7. Misurare la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi
- Preparare le cellule come nella sezione 1.
- Il giorno del test, lavare tutti i pozzi con 100 μL HBSS a 37 °C.
- Sciogliere l'ovoalbumina con etichetta BODIPY ad una concentrazione di 4 mg/mL in HBSS.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,2 mg/mL di ovoalbumina con etichetta BODIPY.
- Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
- Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
- Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
- Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati e regolare i parametri di eccitazione / emissione per ciascun fluoroforo secondo necessità.
NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. BODIPY è stato eccitato con una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x ed è stato acquisito un volume Z di 10 μm a intervalli di 0,5 μm. - Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
- Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi rimangono a fuoco su tutta la piastra.
- Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.
8. Analisi dei dati per la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi
- Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo da entrambi i canali TMR e BODIPY.
- Generare una maschera sul canale TMR e applicarla sia alle immagini TMR che BODIPY come nei passaggi 6.2 e 6.3 precedenti (Figura 3B).
- Registrare l'intensità TMR e BODIPY per ciascun macropinosoma all'interno delle maschere.
- Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
- Dividere l'intensità BODIPY per l'intensità TMR per generare il rapporto BODIPY:TMR.
- Traccia il rapporto BODIPY:TMR rispetto al tempo.
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Representative Results
Quando si misura il pH dei macropinosomi, c'è un periodo di tempo per il quale la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata. Questo periodo corrisponde alla fase di carico destro (riquadro grigio in Figura 2C e Figura 3C,D)e varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. La durata della fase di carico varierà con (i) l'attività macropinocitica delle cellule e (ii) la sensibilità dello strumento utilizzato. Si raccomanda di regolare questo periodo all'inizio di ogni esperimento in modo tale da ottenere un rapporto segnale/rumore superiore a 4:1 sia per i canali fluoresceina che per quelli TMR. Nelle cellule non trattate, l'emissione di fluoresceina dovrebbe diventare progressivamente più debole man mano che i macropinosomi si acidificano e il segnale TMR dovrebbe rimanere costante o diventare più luminoso. Il segnale TMR può diventare più luminoso se i macropinosomi si restringono in dimensioni16,21. Ciò non influirà sul rapporto in quanto il segnale della fluoresceina è soggetto alle stesse variazioni della dimensione organellare22. Il rapporto fluoresceina:TMR diventerà progressivamente più piccolo e si stabilizzerà entro i primi 15 minuti dall'acquisizione (Figura 2C). Questo plateau corrisponde a un pH di ~ 5, che corrisponde approssimativamente al pH dei lisosomi25. Al termine di ogni acquisizione, viene eseguita una calibrazione in situ. Il rapporto fluoresceina:TMR dovrebbe essere maggiore con il tampone di calibrazione a pH 7,5 e diventare progressivamente più piccolo man mano che i tamponi di taratura diventano più acidi. Ciò consente la generazione di una curva di calibrazione (Figura 2B). I rapporti fluoresceina:TMR possono quindi essere interpolati per pH macropinosomiale (Figura 2C).
È anche probabile che gli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi varino con il tipo di cellula utilizzato. Si raccomanda di caricare le cellule con H2DCFDA-destrano e di stimolare la NADPH ossidasi utilizzando phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) come controllo positivo (Figura 3C). Ciò darà un'idea migliore della gamma dinamica del test e consentirà di regolare le impostazioni del microscopio. Man mano che si verificano eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi, il segnale H2DCFDA diventerà progressivamente più luminoso. Il segnale TMR può rimanere costante o può variare con le dimensioni del macropinosoma, come discusso sopra. Il rapporto H2DCFDA:TMR diventerà progressivamente più grande e probabilmente si stabilizzerà entro i primi 20-30 minuti nelle cellule Raw264.7 inattivate (Figura 3A,C).
Quando si misura la digestione delle proteine macropinosomiali, un segnale fluorescente progressivamente forte verrà liberato mentre l'ovalbumina viene digerita. Nelle cellule Raw264.7, l'aumento della fluorescenza liberata dall'ovalbumina digerita con etichetta BODIPY si stabilizzerà entro i primi 30 minuti (Figura 3B,D). Come prima, il segnale TMR può rimanere costante o può variare con le dimensioni del macropinosoma. Poiché la degradazione dell'ovoalbumina inizia immediatamente dopo la chiusura del macropinosoma, un controllo negativo può essere utile per determinare la gamma dinamica del test. A tal fine, le idrolasi acide all'interno del macropinosoma possono essere inibite utilizzando un inibitore della V-ATPasi, come la Concanamicina A (CcA) (Figura 3D) o la Bafilomicina A.
Figura 1: Principi di imaging a doppio fluoroforo. (A-C). Scansioni spettrali (fissate per eccitazione, varie per emissione) di fluorofori sensibili al pH sospesi in tamponi del pH indicato. Fluoresceina, pHrodo e cypHer5e sono comunemente usati come sensori di pH nei saggi cellulari. (D-F). Scansioni spettrali (fissate per eccitazione, varie per emissione) di fluorofori insensibili al pH sospesi in tamponi del pH indicato. I coloranti che non variano con il pH rendono utili fluorofori di riferimento. Le fluoresceina, non sono sensibili in modo ottimale ai valori di pH più acidi sperimentati negli endosomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misure dinamiche del pH macropinosomiale. (A) Raw264.7 cellule sono state caricate con destro 70 kDa etichettato con fluoresceina e destrano da 70 kDa con etichetta TMR a 37 °C in presenza o assenza di 500 ng/mL di lipopolisaccaride (LPS) per 15 min. Sono stati anche incubati con destrano da 70 kDa con etichetta con fluoresceina e destrano da 70 kDa con etichetta TMR a 4 °C come controllo per il legame non specifico del destro. Gli inserti mostrano singole celle (barre di scala = 20 μm). (B) Taratura in situ di celle Raw264.7 caricate con destrano da 70 kDa etichettato con fluoresceina e destrano da 70 kDa con etichetta TMR utilizzando tamponi ricchi di K+al pH indicato e nigericina. (C) pH del macropinosoma nelle cellule Raw264.7. Gli inserti rappresentano il rapporto fluoresceina/TMR nei singoli macropinosomi. Le caselle grigie indicano i momenti in cui le cellule venivano caricate con destrano. I dati di due esperimenti indipendenti contengono ciascuno ≥ 80 cellule. Dati rappresentati come ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazioni dinamiche degli eventi ossidativi e della digestione delle proteine all'interno del lume dei macropinosomi. (A) Le cellule Raw264.7 sono state caricate con destrano da 70 kDa con etichetta H2DCFDA e destrano da 70 kDa con marchio TMR a 37 °C per 15 minuti, seguiti da un inseguimento di 45 minuti a 37 °C. Gli inserti mostrano immagini ratioed (H2DCFDA/TMR) di singoli macropinosomi. Barre di scala = 20 μm. (B) Le celle Raw264.7 sono state caricate con ovalbumina etichetta BODIPY e destrano 70 kDa etichettato TMR a 37 °C per 15 minuti, seguito da un inseguimento di 45 minuti a 37 °C. Il canale TMR è stato utilizzato per generare una maschera, che è stata applicata al canale BODIPY. Gli inserti mostrano le singole cellule. Barre di scala = 20 μm. (C) Ossidazione di H2DCFDA all'interno del lume dei macropinosomi. Le cellule sono state anche stimolate con PMA come controllo positivo. Le caselle grigie indicano i momenti in cui le cellule venivano caricate con destrano. I dati di due esperimenti indipendenti, ciascuno contenente ≥ 80 cellule. Dati rappresentati come ± SEM. Ogni punto temporale è stato confrontato con il controllo PMA. Il t-testdi uno studente è stato utilizzato per l'analisi statistica. (D) Degradazione dell'ovalbumina etichetta bodipy all'interno dei macropinosomi. La concanamicina A (CcA) è stata utilizzata come controllo negativo in quanto impedisce l'attivazione delle idrolasi dell'acido luminale. I dati di due esperimenti indipendenti, ciascuno contenente ≥ 80 cellule. Dati rappresentati come ± SEM. Ogni punto temporale è stato confrontato con il controllo CcA. Il t-testdi uno studente è stato utilizzato per l'analisi statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene esistano numerosi protocolli per misurazioni sia a basso che ad alto rendimento dell'assorbimento macropinocitico in macrofagi, fibroblasti e persino Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,pochissimi tentativi sono stati fatti per misurare la biochimica luminale di questi compartimenti dinamici. Ciò è probabilmente dovuto a una scarsità di sonde che possono essere efficacemente indirizzate al compartimento macropinosomiale evitando altri compartimenti endocitici. Qui sono descritte le tecniche per indirizzare le sonde fluorescenti per la misurazione dinamica del pH, degli eventi ossidativi e della digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi.
La microscopia a fluorescenza metrica è stata la tecnica principale con cui il pH endosomiale è stato misurato per decenni. La fluoresceina è stata ampiamente utilizzata per misurare il pH endosomiale e continua ad essere il fluoroforo di scelta in quanto il suo pKa consente misurazioni accurate con la gamma tipica di valori di pH endosomiale (~ pH 7,2-4,5). Qui, lo studio ha impiegato fluoresceina coniugata a 70 kDa destrano per misurazioni del pH specifiche dei macropinosomi. Una limitazione di questo approccio è il periodo di carico destrosso di 15 minuti durante il quale il pH macropinosomiale non può essere registrato. Questo periodo è necessario per caricare un numero sufficiente di destrano etichettato con fluoroforo nel compartimento macropinosomiale, ma preclude efficacemente le misurazioni precoci del pH dei macropinosomi. Ciò non preclude, tuttavia, la determinazione di vari parametri luminali come la capacità tampone, la perdita relativa di protoni e la potenza di pompaggio della V-ATPasi, tutti derivati da misurazioni del pH macropinosomiale. Come mostrato nella Figura 1, un certo numero di altri fluorofori sensibili al pH possono anche essere utilizzati per misurare il pH, tra cui pHrodo (pKa = 6,8) e CypHer5e (pKa = 7,3). Tuttavia, poiché hanno un pKa significativamente più alto della fluoresceina, non sono ottimali per misurare il pH endosomiale a valori di pH più acidi.
Poiché i macropinosomi sono organelli altamente dinamici e subiscono un restringimento significativo poco dopo la formazionedi 16,21, è necessaria una fluorescenza ratiometrica a doppio fluoroforo. I cambiamenti nella fluorescenza dovuti a cambiamenti nel volume dei macropinosomi sono corretti per l'uso di un fluoroforo di riferimento in tutti i saggi presentati.
Gli eventi ossidativi nelle cellule sono stati misurati utilizzando una varietà di sonde redox-sensibili, tra cui nitroblue tetrazolium (NBT), luminolo e H2DCFDA. Gli approcci basati sul luminolo sono particolarmente utili per misurare la produzione di ROS in una popolazione di cellule, ma sono difficili da adattare alle misurazioni specifiche degli organelli. NBT forma un deposito insolubile facilmente visualizzabile chiamato formazan all'ossidazione, ma oscura i segnali fluorescenti ed è sia non lineare che difficile da localizzare. H2DCFDA libera un segnale fluorescente lineare dopo l'ossidazione e può essere facilmente coniugato a traccianti come il destroran per misurazioni specifiche degli organelli. Collegando H2DCFDA a 70 kDa destrano, è possibile visualizzare gli eventi ossidativi all'interno dei singoli macropinosomi (Figura 3B). C'è, tuttavia, un avvertimento a questo approccio. Poiché h2DCFDA è una forma modificata di fluoresceina, il segnale liberato è sensibile al pH. Sebbene il guadagno in fluorescenza dopo l'ossidazione sia abbastanza grande da essere rilevato, è senza dubbio mascherato dal lume acido del macropinosoma. Una variante insensibile al pH di H2DCFDA è stata precedentemente disponibile in commercio ed è preferibile; tuttavia, al momento della preparazione di questo manoscritto, questo prodotto non era più disponibile in commercio. Ros sta emergendo come un'importante molecola di segnalazione ed è stata implicata nel rimodellamento della membrana, nel traffico organellare e, più recentemente, nell'elaborazione del materiale da parte delle cellule presentanti l'antigene per la presentazione alle cellule T28,30. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per studiare il contributo della produzione di ROS macropinosomiali a questi vari processi fisiologici.
La digestione delle proteine nei macropinosomi è di interesse nello studio della presentazione dell'antigene da parte delle cellule immunitarie e nello studio dell'acquisizione di nutrienti da parte delle cellule tumorali. Ad esempio, si ritiene che la digestione delle proteine endosomiali da parte delle cellule dendritiche limiti il pool di peptidi disponibili per la presentazione alle cellule T sulle principali molecole di istocompatibilità. Poiché i macropinosomi sono una delle principali vie di acquisizione dell'antigene, le misurazioni della digestione delle proteine macropinosomiali possono essere utilizzate per sondare il meccanismo molecolare responsabile della messa a punto della presentazione dell'antigene. Un certo numero di strumenti disponibili in commercio sono utilizzati per misurare la digestione delle proteine nei compartimenti endosomiali. Le sonde BSA e ovalbuminiche etichettate BODIPY, che diventano fortemente fluorescenti dopo la digestione, si sono dimostrate particolarmente popolari. Sono facilmente accoppiati a traccianti endocitici e possono essere mirati a specifici compartimenti endosomiali, come i fagosomi. Le sonde, tuttavia, non sono facilmente accoppiate al destrano e quindi richiedono un approccio di co-localizzazione. Questo approccio si traduce nel caricamento di tutti i compartimenti endosomiali, compresi i macropinosomi, con ovoalbumina etichettata bodipy e viene utilizzata una maschera per misurare la degradazione specifica del macropinosoma. Questo approccio richiede una risoluzione migliore e non è facilmente scalabile per analisi più grandi e con throughput più elevato. Le tecniche per accoppiare covalentemente gli strumenti di degradazione delle proteine a 70 kDa destrano si riveleranno probabilmente utili e sono attualmente in fase di sviluppo nel nostro laboratorio.
Mentre il campo della macropinocitosi continua a crescere34, gli strumenti per misurare dinamicamente la biochimica luminale dei macropinosomi, tra cui pH, chimica redox, digestione delle proteine, concentrazioni di ioni e sostanze chimiche lipidiche forniranno informazioni sulla biologia unica di questi organelli in rapida evoluzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Università di Calgary per il suo sostegno. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Robin Yates per l'accesso a reagenti, attrezzature e discussioni utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
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