Summary
إعداد الرئة أرنب معزولة هو أداة معيار الذهب في البحوث الرئوية. يهدف هذا المنشور إلى وصف هذه التقنية كما تم تطويرها لدراسة الآليات الفسيولوجية والمرضية المشاركة في التفاعل في مجرى الهواء ، والحفاظ على الرئة ، والبحوث قبل السريرية في زرع الرئة والوذمة الرئوية.
Abstract
وقد استخدم نظام تغلغل الرئة المعزول على نطاق واسع في البحوث الرئوية، مما ساهم في توضيح الأعمال الداخلية للرئتين، سواء على المستوى الجزئي أو الكلي. هذه التقنية مفيدة في توصيف فسيولوجيا الرئة وعلم الأمراض من خلال قياس الأنشطة الأيضية ووظائف الجهاز التنفسي ، بما في ذلك التفاعلات بين المواد الدورة الدموية وآثار المواد المستنشقة أو المتغلغلة ، كما هو الحال في اختبار المخدرات. بينما في طرق المختبر تنطوي على تشريح وزراعة الأنسجة، ونظام التشوه الرئة السابقين فيفو معزولة يسمح للعمل مع جهاز وظيفي كامل مما يجعل من الممكن دراسة وظيفة الفسيولوجية المستمرة في حين إعادة التهوية والتشويش. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن آثار عدم وجود ال الداخلي المركزي والصرف اللمفاوي لا يزال يتعين تقييمها بشكل كامل. يهدف هذا البروتوكول إلى وصف تجميع جهاز الرئة المعزول ، يليه الاستخراج الجراحي وزراعة الرئتين والقلب من المختبر التجريبية ، وكذلك عرض تقنية التخثر ومعالجة الإشارات للبيانات. متوسط صلاحية الرئة المعزولة يتراوح بين 5-8 ساعة؛ خلال هذه الفترة ، تزداد نفاذية الشعرية الرئوية ، مما يسبب وذمة وإصابات في الرئة. يتم قياس وظيفة النسيج الرئوي المحفوظ بمعامل الترشيح الشعري (Kfc) ، المستخدم لتحديد مدى الوذمة الرئوية عبر الزمن.
Introduction
وصف برودي وديسون لأول مرة نظام التشويش الرئوي السابق في عام 1903 1. ومنذ ذلك الحين، أصبح أداة معيار الذهب لدراسة علم وظائف الأعضاء، وعلم الصيدلة، وعلم السموم، والكيمياء الحيوية للرئتين2،3. تقدم هذه التقنية طريقة متسقة وقابلة للاستنساخ لتقييم صلاحية عمليات زرع الرئة ، وتحديد تأثير الوسطاء الالتهابيين مثل الهيستامين ، ونواتج الأيض حمض الأراكيدونيك ، والمادة P ، من بين أمور أخرى ، وكذلك تفاعلاتها خلال الظواهر الرئوية مثل القصبات الهوائية ، وانتفاخات الشعر ، والوذمة الرئوية. كان نظام الرئة المعزول تقنية رئيسية في الكشف عن الدور الهام للرئتين في القضاء على الأمينات الحيوية من الدورة الدموية العامة4،5. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام النظام لتقييم الكيمياء الحيوية لخافق الماء الرئوي6. على مدى العقود القليلة الماضية، أصبح نظام تغلغل الرئة في الجسم الحي السابق منصة مثالية لأبحاث زرع الرئة7. في عام 2001 وصف فريق بقيادة ستيغ ستين أول تطبيق سريري لنظام تغلغل الرئة السابق في الجسم الحي باستخدامه لإعادة تجديد رئتي متبرع يبلغ من العمر 19 عاما ، والذي رفضته مراكز الزرع في البداية بسبب إصاباته. تم حصاد الرئة اليسرى وثقبها لمدة 65 دقيقة. بعد ذلك ، تم زرعها بنجاح في رجل يبلغ من العمر 70 عاما مصابا بمرض COPD8. أدى إجراء مزيد من الأبحاث في تجديد الرئة باستخدام التشوه السابق في الجسم الحي إلى تطوير تقنية تورونتو لتشويش الرئة الممتد لتقييم وعلاج الرئتين المتبرعتين المصابتين9,10. سريريا، أظهر نظام تغلغل الرئة الحية السابقة أنه استراتيجية آمنة لزيادة تجمعات المانحين من خلال علاج وإعادة تجديد الرئتين المانحتين دون المستوى، مما لا يمثل فرقا كبيرا في المخاطر أو النتائج مقابل المعايير القياسية للمتبرعين10.
الميزة الرئيسية لنظام تغلغل الرئة المعزول هي أنه يمكن تقييم المعلمات التجريبية في جهاز وظيفي كامل يحافظ على وظيفته الفسيولوجية تحت إعداد مختبر اصطناعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لقياس والتلاعب التهوية الميكانيكية الرئوية لتحليل مكونات فسيولوجيا الرئة مثل مقاومة مجرى الهواء، ومقاومة الأوعية الدموية الكلية، وتبادل الغاز، وتشكيل وذمة، والتي حتى الآن لا يمكن قياسها بدقة في الجسم الحي على المختبر2. وتجدر الإشارة إلى أن تكوين المحلول الذي يتم به تغلغل الرئة يمكن التحكم فيه بالكامل ، مما يتيح إضافة مواد لتقييم آثارها في الوقت الحقيقي وجمع العينات من التشوه لمزيد من الدراسة11. يجب على الباحثين الذين يعملون مع نظام الرئة المعزول أن يضعوا في اعتبارهم أن التهوية الميكانيكية تسبب تسوس الأنسجة الرئوية تقصير وقتها المفيد. يمكن أن يتأخر هذا الانخفاض التدريجي في المعلمات الميكانيكية بشكل كبير عن طريق تضخم الرئتين في بعض الأحيان خلال وقت التجربة4. ومع ذلك، لا يمكن أن يستمر التحضير عادة أكثر من ثماني ساعات. وثمة اعتبار آخر لنظام التشوه الرئة السابق في الجسم الحي هو عدم وجود تنظيم العصبي المركزي والصرف اللمفاوي. ولم تفهم آثار غيابهم فهما كاملا بعد، ويمكن أن تكون مصدرا للتحيز في تجارب معينة.
يمكن إجراء تقنية نظام تغلغل الرئة المعزولة في نموذج الأرنب بدرجة عالية من الاتساق والتكرار. يصف هذا العمل الإجراءات التقنية والجراحية لتنفيذ تقنية التشويش الرئوي المعزولة السابقة كما تم تطويرها لنموذج الأرانب في المعهد الوطني للتنفس في مكسيكو سيتي ، بهدف مشاركة الأفكار وتقديم دليل واضح حول الخطوات الرئيسية في تطبيق هذا النموذج التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد استخدم نظام التشوه المعزول في نموذج الأرانب على نطاق واسع في مختبر فرط الاستجابة القصبية في المعهد الوطني للتنفس. ويشمل البروتوكول أرانب نيوزيلندية يبلغ وزنها التقريبي 2.5-3 كيلوغرامات. تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في ظروف vivarium القياسية وتغذية libitum الإعلانية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية الرسمية لحيوانات المختبر (NOM 062-ZOO-1999) وبموجب دليل رعاية واستخدام المختبر (الطبعة الثامنة ، 2011). وقد سبق أن وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للمعهد الوطني لأمراض الجهاز التنفسي على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وأساليب العناية بالحيوانات الواردة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: إعداد نظام تغلغل الرئة المعزول ينطوي على الموت المتعمد لحيوان تحت التخدير وعن طريق القتل الرحيم.
1. معدات وإعداد الجهاز.
- ترتيب المعدات:
- إعداد جدول العمليات مع حجم وفقا لوزن الأرنب.
- قم بتركيب غطاء الصدر الاصطناعي على عمود الصلب مع الغرفة الزجاجية تحته وجهاز التنفس الصناعي مع مضخة دوارة من الجانبين.
- تأكد من أن الغطاء يميل بسهولة إلى أن يكون قنية القصبة الهوائية تمشيا مع القصبة الهوائية للسماح باتصال أسرع.
- الصدر الاصطناعي:
ملاحظة: هو جزء أساسي من النظام. وتتكون من غرفة زجاجية ذات سترة مائية مختومة بغطاء خاص. الغطاء يعمل كحامل الجهاز مع اتصالات لcnulate القصبة الهوائية والأوعية جزءا لا يتجزأ منه.- إعداد طائرة venturi التي تديرها الهواء المضغوط لتوليد الضغط السلبي داخل الصدر الاصطناعي.
ملاحظة: وحدة التحكم في التهوية (VCM) يسمح تعديلات منفصلة من inspiratory ونهاية expiratory الضغوط وكذلك معدل التنفس ونسبة مدة inspiratory إلى إجمالي مدة الدورة.
- إعداد طائرة venturi التي تديرها الهواء المضغوط لتوليد الضغط السلبي داخل الصدر الاصطناعي.
- جهاز:
- تأكد من أن جهاز يعمل عادة يتكون من عمود الصلب الرئيسي التي شنت على لوحة قاعدة عقد الصدر الاصطناعي، مع مقياس التنفس ومحول الوزن تقع فوقه وخلف لفائف التسخين مع فخ فقاعة.
- ربط محول ضغط تفاضلي واحد إلى مقياس التنفس وآخر لضغط الغرفة. تعيين زوجين مختلفين من محولات الضغط وراء الصدر لقياس التغلغل والضغوط الوريدية.
- قم بتوصيل مخزون التغيير أسفل جهاز الأكسجين بقطب كهربائي مستوى ونظام التهوية بجانب الجهاز.
2. استخراج الجراحية للكتلة القلبية الرئوية.
- تخدير:
- استخدام مزيج من مهدئ (xylazine) وباربيتيورات (بنتوباربيتال).
ملاحظة: يمكن استخدام الكوكتيلات المخدرة المختلفة دون أي تأثير على النتائج التجريبية. - أولا، تخدير الأرانب نيوزيلندا صحية مع حقنة عضلية واحدة من هيدروكلوريد xylazine (3-5 ملغ / كغ). تأكد من أن الأرانب تبقى هادئة ومريحة للسماح بمزيد من التلاعب بعد بضع دقائق من الحقن.
- بعد التخدير، استخدم الأوردة الأذن الهامشية (الجانبية) كالوصول إلى تخدير الأرانب عن طريق الحقن الوريدي للصوديوم البنتوباربيتال (28 ملغم/كغ).
- استخدام مزيج من مهدئ (xylazine) وباربيتيورات (بنتوباربيتال).
- رصد:
- لتجنب التخدير غير الكافي أو الاكتئاب المفرط لوظائف القلب والجهاز التنفسي، قم بمراقبة المعلمات التالية. لتقييم عمق التخدير، قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
- تأكد من أن الغشاء المخاطي وردي اللون. تشير الظلال الزرقاء أو الرمادية إلى نقص الأكسيجة.
- تأكد من أن معدل ضربات القلب بين 120-135 نبضة / دقيقة ، وأن درجة حرارة الجسم لا تنخفض إلى أقل من 36.5 درجة مئوية.
- وضع الحيوان:
- حلق جذع الأرنب ووضع الحيوان على طاولة العمليات في موقف supine. ضع نظام التهوية بالقرب من الطاولة ، خلف رأس الأرنب ، للسماح بربط القنية بسرعة بعد استئصال القصبة الهوائية لتجنب الضرر العيسى.
- شق و القصبة الهوائية:
- تشريح الجلد مع شق خط وسطي بطني من 3-5 سم من الحجاب الحاجز حتى الرقبة.
- مع مقص التشغيل، وقطع الأمامي 2/3 من القصبة الهوائية بين اثنين من حلقات الغضاريف لإدراج قنية القصبة الهوائية من خلال الغشاء الليفي القصبي.
- إدراج 5 مم (القطر الخارجي؛ OD) قنية القصبة الهوائية من خلال الغشاء الليفي القصبي واستخدام خياطة الحرير 4-0 لإصلاحه بعناية.
- ضع ملقط أو ملاقط تحت القصبة الهوائية لضمان عدم انحناء القنية ضد القصبة الهوائية.
- تهوية الضغط الإيجابي:
- طالما بقيت الرئتين خارج الصدر الاصطناعي، استخدم مضخة تنفس الأنواع الصغيرة لتهوية الضغط الإيجابي من أجل تجنب انهيار الرئة أثناء الجراحة.
- بدء التهوية من خلال قنية القصبة الهوائية متصلة مضخة التنفس بسرعة بعد القصبة الهوائية وقبل فتح الصدر.
- ضبط حجم المد والجزر في 10 مل / كغ.
ملاحظة: اعتمادا على إعداد التجربة ونموذج الصدر الاصطناعي، وتوفير التهوية الضغط الإيجابي من قبل إما نفس مضخة التهوية المستخدمة لتوفير الضغط السلبي أو واحدة مختلفة، مما يمنح إعادة تعريب سريعة.
- استئصال الصدر والإغراب:
- للوصول إلى تجويف الصدر، استخدم مشرط أو مقص لفتح جدار الصدر وإجراء استئصال القص الوسيط حتى الثلث العلوي من الصدر.
- عقد نصفي الصدر مفتوحة من قبل اثنين من التراجع. عادة ما تحيط العديد من رفرفات الرئة بالقلب.
- توطين الخضار متفوقة وأدنى كافا وإحالتها مع المواضيع.
- قبل إستئصال الحيوان، حدد البطين الأيمن وحقن 1000 واجهة مستخدم/كجم من الهيبارين.
- مباشرة بعد الحقن، ligate فينا كافا متفوقة وأدنى مع الخيط قبل حلقت وأداء exsanguination.
- حصاد القلب والرئة:
- حصاد كتلة القلب والاحتقان بلطف وبسرعة. استخدام تشريح الرقمية المباشرة أو مقص الربيع لفصل النسيج الضام وذلك لإزالة الرئتين من الصدر.
- تشريح الأوعية الدموية في المنطقة، فضلا عن المريء.
- قطع من خلال ستيرني manubrium لتمديد القص المتوسط نحو قنية القصبة الهوائية، والإفراج عن القصبة الهوائية على كلا الجانبين من ربط الأنسجة.
- الآن، استئصال القصبة الهوائية فوق قنية القصبة الهوائية. سحب بلطف حتى القنية في محور craniocaudal كما يتم استئصال التثبيت الظهري للرغامى والرئتين.
- العلبة:
- ارفع الرئتين المعزولتين من الصدر وضعيهما بعناية فوق شاش معقم على طبق بتري.
- لمنع التهابات الزهن، تهوية الرئتين باستخدام التهوية الضغط الإيجابي مع ضغط نهاية منتهية الصلاحية إيجابية (PEEP) تعيين في 2 cmH2O.
- إزالة البطينين عن طريق قطع لهم قبالة القلب على مستوى الأخدود البطين.
- بعد فتح البطينين، أدخل قنية الشريان الرئوي OD 4.6 مم للأرنب مع سلة من خلال الشريان الرئوي وإدخال قنية الأذين الأيسر OD 5.9 ملم للأرنب مع السلة من خلال الصمام التاجي في الأذين الأيسر.
- استخدم خياطة حريرية 4-0 في الشريان الرئوي والأذين الأيسر لإصلاح القنية. قم بتضمين الأنسجة المحيطة في أربطة الشريان الرئوي والأذين الأيسر لتجنب تثبيط هذه الهياكل.
- حقن 250 مل من محلول متساوي التوتر المالح من خلال القنية الشريانية لطرد الدم المتبقي من سرير الأوعية الدموية.
3. تقنية التخبط.
- اعداد:
- ضع الرئتين المعزولتين بعناية في غرفة الرئة.
- إرفاق القصبة الهوائية إلى محول على غلاف الغرفة.
- ربط الأوعية المعلبة إلى نظام التخثر.
- أغلق الغرفة و أمنها بالقفل الدوار
ملاحظة: تتكون دائرة التشويش المعاد تدويرها من خزان وريدي مفتوح ومضخة معمومة ومبادل حراري وفخ فقاعة. - عند هذه النقطة، نعلق غطاء الغرفة والتبديل على stopcock للتبديل من التهوية الضغط الإيجابي إلى السلبي. للتحقق من التهوية الضغط السلبي للرئتين وإغلاق محكم للغرفة، تفقد رحلة الجهاز التنفسي للرئة وضغط الغرفة على مقياس الضغط.
- Perfuse الرئتين مع 200 مل من perfusate الاصطناعي خالية من الدم (عازلة بيكربونات كريبس رينغر التي تحتوي على 2.5٪ من الألبومين البقري).
- بدء تدفق perfusate في 3 مل / دقيقة / كغ ، ثم بطء تصعيد تدفق على مدى فترة 5 دقائق إلى 5 مل / دقيقة / كغ. الوصول إلى تدفق 8 مل / دقيقة / كجم على مدى 5 دقائق القادمة وبعد فترة أخرى 5 دقائق تصل إلى تدفق الحد الأقصى من 10 مل / دقيقة / كجم. رعاية تجنب الهواء من الدخول في الدائرة.
ملاحظة: حافظ على درجة الحموضة ودرجة حرارة التشوه داخل النطاقات الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4-7.5؛ درجة الحرارة، 37 درجة مئوية-38 درجة مئوية). لضبط درجة الحموضة، أضف NaHCO3 (1N) أو زيادة تدفق ثاني أكسيد الكربون. بدلا من ذلك، استخدم HCl (0.1N) لتحمض.
- البارامترات:
- تحقق مما إذا تم تعيين معلمات التشويش والتهوية المحددة مسبقا على النحو المطلوب.
- تهوية الرئتين مع الهواء المرطب على تردد 30 bpm، وحجم المد والجزر من 10 مل / كجم، وضغط نهاية الانتهاء (Pe) من 2 سمH2O.
ملاحظة: يتوافق ضغط الشريان الرئوي (0-20 مم زئبق) مع ارتفاع مستوى السائل في الأكسجين أو الخزان بالسنتيمتر فوق الجذع الرئوي، في حين يتوافق الضغط الوريدي الرئوي مع ارتفاع غرفة توازن الضغط فوق الأذين الأيسر. يمكن تعديل القيمتين. لاحظ أن ضغط الأذين الأيسر هو أيضا 0-20 ملم زئبق.
- تحقيق شروط المنطقة 3:
- استخدم القسطرتين المتصلتين بمنافذ جانبية من القنية في الشريان الرئوي والأذين الأيسر ومحولات الضغط لقياس الضغط الشرياني (Pa) وال وريدي (Pv).
- تعيين الضغوط خط الأساس على مستوى هيلوم الرئة (صفر المرجعية).
- إجراء التجارب تحت ظروف التهوية المنطقة 3. لتحقيق ذلك، انتظر لمدة 10-15 دقيقة للحصول على توازن يتميز بحالة متساوية التماثل.
- تأكد من أن الضغط الوريدي أعلى من ضغط السنف (Palv) وأن الضغط الشرياني لا يزال أعلى من كليهما (Pa > Pv > Palv) لظروف المنطقة 3.
- تأكد من أن وزن الرئتين لا يزال ثابتا وأن الضغوط الشريانية والأذية اليسرى مستقرة لتحقيق ظروف المنطقة 3 لفتح أكبر عدد ممكن من الأوعية الرئوية والحفاظ على محتوى السرير الأوعية الدموية الدقيقة أثناء التجربة.
ملاحظة: قياس كنتاكي كمؤشر على الوذمة الرئوية ليس له اختلاف بين دليل ونظام التشوش التلقائي.
- التحكم الإلكتروني ومعالجة الإشارات: تأكد من تسجيل تدفق الجهاز التنفسي وتغيرات الوزن وضغط الأوعية الدموية الدقيقة وحجم المد والجزر ومقاومة الأوعية الدموية وغيرها على وحدة إلكترونيات مركزية متعددة تدمج الإشارات القادمة من المحولات وتعرضها على نظام التقييم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح نظام تغلغل الرئة المعزول بمعالجة الأعضاء للخزعة ، وجمع العينات من التشوه ، وجمع البيانات في الوقت الفعلي للمعلمات الفسيولوجية. يمكن استخدام النظام المعزول لاختبار العديد من الفرضيات التي تنطوي على وظائف مختلفة وظواهر الرئة ، من النشاط الأيضي والانزيمي إلى تكوين الوذمة وفترات الحفظ لعمليات زرع الرئة.
يعرض الشكل 1 رسما تخطيطيا لنظام تغلغل الرئة المعزول المجمع بالكامل إلى جانب نظام التهوية واكتساب البيانات المحسوبة. يضمن مكون التشوه في النظام أن التشوه يتدفق باستمرار عبر الرئتين المعزولتين. يتم زراعة الشريان الرئوي لتوفير تدفق التشوه ، في حين يتم توفير تدفق التشوه عن طريق زراعة الأذين الأيسر للقلب. يتم تمرير perfusate باستخدام مضخة الأسطوانة بحيث perfusate يمر عبر المبادل الحراري، ثم من خلال فخ فقاعة في الشريان الرئوي، وأخيرا في سرير الأوعية الدموية الرئة. يسمح عنصر التهوية في النظام لوسط التهوية بالتدفق باستمرار بعد النهاية البعيدة لمقياس الرئة مباشرة عبر قنية القصبة الهوائية إلى الرئتين.
ويبين الشكل 2 تركيز MAO (الشكل 2A) و5-HT (الشكل 2B) في الرئة المعزولة المحفوظة عند 4 درجات مئوية إلى 24 ساعة. تم تحديد مستويات السيروتونين وأوكسيديز أحادي الأمين من عينات السوائل داخل الأوعية الدموية التي تم الحصول عليها في أوقات مختلفة وتحليلها من قبل ELISA. 5-HT تركيز بلغت ذروتها بعد 15 دقيقة من الحفظ ثم انخفض خلال 6 ساعة المقبل. بعد ذلك ، أظهرت مستويات التشوه زيادة غير ذات دلالة إحصائية تصل إلى الساعة 24. وأظهرت مستويات MAO سلوكا مماثلا، وبلغت ذروتها بعد 15 دقيقة من الحفظ، ثم انخفضت خلال الساعات الست التالية حتى الساعة 2412. ويبين الشكل 3 معدلات إطلاق 5-HT و MAO، المعبر عنها كنسبة مئوية من القيمة الأولية، مقاسة ب 24 ساعة في إعداد رئوي معزول عند 4 درجات مئوية. خلال الساعة الأولى من الحفظ، ارتفعت مستويات 5-HT أعلى من MAO وانخفضت في غضون 6 ساعات بعد استعادتها من قبل الخلايا البطانية والصفائح الدموية وكذلك تقويضية MAO بوساطة12.
ويبين الشكل 4 NEP (الكثافات البصرية / ملغ البروتين / دقيقة)، والنشاط الإنزيمي ACE (الكثافات البصرية / ملغ البروتين / دقيقة) خلال الوقت في إعداد الرئة معزولة. تم تحديد نشاط NEP (الشكل 4A) من خلال التحليل الطيفي باستخدام N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly كركيزة NEP تليها إضافة enalapril لمنع ACE. تم تحديد نشاط ACE (الشكل 4B) من خلال التحليل الطيفي باستخدام enalapril كركيزة ACE ، تليها إضافة الفوسفوراميدون لمنع NEP. وبما أن كلا الحلين يحتويان على إينالابريل، فقد تم حساب نشاط ACE على أنه الفرق في الفلورسينس بين العينات مع وبدون enalapril13.
ويبين الشكل 5 تأثير الحفظ الرئوي في نفاذية الشعرية (mKfc) خلال فترة 24 ساعة في نظام تغلغل الرئة المعزول في نموذج الأرنب. مجموعة مراقبة (n = 6)، تم تقييمها مباشرة بعد الحصاد، كان لديها mKfc من 2.8 ± 0.8 (مل/ دقيقة / cmH2O / ز) خطأ قياسي، في المقابل، عانت الرئة المتغلغلة من زيادة تدريجية في mKfc سجلت 7.5 ± 1.4 (n = 6) عند 6 ساعة و 10.8 ± 2.3 (n = 6) عند 12 ساعة ووصلت إلى 16.3 ± 2.5 (n = 6) بعد 24 ساعة من الحفظ13.
يظهر الشكل 6 تأثير الإضافات المختلفة في نفاذية الشعرية لنظام تغلغل الرئة المعزول في ظل ظروف متنوعة. يتم إنشاء زيادة ضغط مفاجئة قدرها 10 cmH2O عن طريق عرقلة جزئية للتدفق الوريدي لقياس نفاذية السرير الشعري من خلال معامل الترشيح الشعري (Kfc). لقياس كنتاكي، تم تثبيت أنابيب التدفق الخارج التي تخرج من البطين الأيسر إلى خزان كريبس جزئيا. ثم، تم الحفاظ على المشبك الجزئي لمدة 3 دقائق مع التأكد من أن زيادة الضغط وصلت إلى 10 cmH2O. تم تحرير لقط، واستمر التدفق الطبيعي. تم تسجيل هذه المناورة كزيادة في ضغط الشرايين وزيادة وزن الرئة. تعتبر هذه المعلمة الأخيرة Kfc.
الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام تغلغل الرئة المعزول. تم تعديل هذا الرقم من هوغو ساكس Elektronik (HSE)، هارفارد Apparatus14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تركيز السيروتونين (5-HT) وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO) المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للرئة و نفاذية الأوعية الدموية. تركيز (A) MAO و (B) 5-HT في الرئة المعزولة المحفوظة في 4°C من خلال 24 h. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معدلات الافراج عن السيروتونين (5-HT) وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO). معدلات الإفراج عن 5-HT و MAO، وأعرب كنسبة مئوية من القيمة الأولية، تقاس من خلال 24 ساعة في إعداد الرئة معزولة في 4 درجة مئوية .
الشكل 4: النشاط الأنزيمي للاندوبتيداز المحايد (NEP) وإنزيم تحويل الأنجيوتنسين (ACE). النشاط الأنزيمي ل (A) NEP و (B) ACE عبر الزمن في رئة معزولة محفوظة عند 4 درجات مئوية حتى 24 ساعة .
الشكل 5: تأثير الحفاظ الرئوي على نفاذية الشعرية (mKfc). تظهر البيانات تأثير الحفاظ الرئوي في نفاذية الشعرية (mKfc) خلال فترة 24 ساعة في نظام تغلغل الرئة المعزول في نموذج الأرنب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تأثير إضافات مختلفة في نفاذية الشعرية. تأثير إضافات مختلفة في نفاذية الشعرية من نظام انحراف الرئة معزولة في ظل ظروف متنوعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعرض هذا العمل رؤية عامة لنظام تغلغل الرئة المعزول ، وهو تقنية أساسية في أبحاث فسيولوجيا الرئة. يوفر نظام تغلغل الرئة المعزول درجة كبيرة من التنوع في استخدامه ويسمح بتقييم العديد من المعلمات ذات الصلة في اختبار مجموعة واسعة من الفرضيات15. نظام الرئة المعزول هو أداة ذات حضور عالمي ، في العقد الماضي ، زادت من أهميتها للتقييمات الخاصة بالأعضاء ووسعت أيضا فائدتها كامتداد للتكنولوجيات الحديثة والعلاجات الجديدة التي تشمل الخلايا الجذعية الميسينشيمالية16 و CRISPR / Cas9 هندسة الجينوم17 ، من بين أمور أخرى. تغطي مجالات أبحاث الإصابة بالرئة السابقة للحيوية على نطاق واسع الاستراتيجيات المضادة للالتهابات ، وإدارة إصابات التهوية والوقاية منها ، والعلاج المضاد للرفض ، وأداء الوذمة المضادة للرئة15.
مطلوب التجميع السليم للجهاز لضمان تذكر البيانات الصحيحة. كما هو مبين في الشكل 1 يتكون النظام بأكمله من غرفة رطبة الضغط السلبي تعلق على نظام التهوية ونظام التخثر الذي يحاكي وظائف الجهاز التنفسي والدورة الدموية للرئتين، على التوالي. ويرتبط كلا النظامين بنظام الحصول على البيانات الذي يسمح بإضافة أجهزة قياس يمكن تصميمها خصيصا لتلبية احتياجات أي بروتوكول. يجب إجراء العملية الجراحية لحصاد كتلة القلب والرئة بسرعة ، ويفضل أن يكون ذلك من قبل موظفين ذوي خبرة ، لتجنب إصابة إضافية في الأنسجة للحفاظ على الرئة سليمة قدر الإمكان حتى يمكن أن تستمر الوظيفة الفسيولوجية دون مزيد من التدخل أثناء التجربة. كما يسمح النظام بجمع عينات التشوه في الوقت الحقيقي التي يمكن استخدامها لتحديد تأثير جزيئات معينة في وظائف رئوية مختلفة (على سبيل المثال، تأثير الهيبارين على الحفاظ على الرئة).
من أجل تحقيق التوزيع السليم لتدفق التغلغل بين الأوعية الرئوية ، وهي الشعيرات الدموية ، يجب شراء شروط المنطقة 3. تعرف ظروف المنطقة 1 بأنها المنطقة التي ينخفض فيها ضغط الشرايين تحت ضغط الحويصلات الدموية، وعادة ما تقترب من الضغط الجوي. عندما يحدث هذا، تتسطح الشعيرات الدموية، مما يجعل تدفق الدم أو التشوه مستحيلا. في ظل الظروف العادية المنطقة 1 لا يمكن أن توجد منذ ضغط الشرايين يكفي لضمان توزيع التدفق. ومع ذلك، يمكن أن تظهر ظروف المنطقة 1 إذا انخفض ضغط الشرايين، أو زاد ضغط الحويصلات الدموية (كما هو الحال أثناء التهوية الإيجابية للضغط). تؤدي ظروف المنطقة 1 إلى رئة مهوية غير مطعمة غير قادرة على إجراء تبادل للغاز. في المنطقة 2 الشروط، ضغط الشرايين أعلى من ضغط الحويصلات الدموية. ومع ذلك ، يبقى الضغط الوريدي تحت ضغط الحويصلات مما يؤدي إلى تدفق التشوه الذي يحدده الفرق بين الضغوط الشريانية والغلوية. يمكن أن يكون هذا السلوك على غرار باستخدام مقاوم زرزور. يتم تحديد ظروف المنطقة 3 من خلال الفرق بين الضغط الشرياني والعني. تحدث الزيادة في تدفق التشوه في المنطقة 3 لأن الشعيرات الدموية تتفكك ، وتكييف فتح أكبر عدد ممكن من الأوعية الرئوية.
وتتكون وحدة النظام من سبع وحدات: وحدتان تمثيليتان لمضخمات محولات (TAM-A) مجهزتان بإشارة رسم بياني تمثيلية LED لمراقبة الإشارات الديناميكية (ضغط الدم، وتدفق الهواء التنفسي، وقوة الانقباض، وما إلى ذلك)، ووحدة مكبر للصوت محول رقمي (TAM-D) مع شاشة رقمية رقمية مصممة لرصد الإشارات النابضة بطيئة التغير؛ وحدة تحكم سيرفو لوحدة التغلغل (SCP) التي تعمل جنبا إلى جنب مع مضخمات TAM-A و TAM-D للتحكم في التشوه من انحرافات الجهاز المعزول باستخدام المضخة العتمة ، يمكن تعيين سرعة المضخة في وضع الضغط المستمر أو التحكم فيها يدويا من خلال SCP ؛ وحدة توازن وذمة (EBM) التي تقيس وزن الرئة؛ وحدة تحكم التهوية (VCM) للتحكم في التهوية الضغط الإيجابي والسلبي، ووحدة عداد الموقت (TCM) التي يمكن تعيينها لتحريك VCM لأداء دورات إلهام عميق.
إن الانتشار العالمي المرتفع للعواطف الرئوية والتنفسية وقيود الخيارات العلاجية الحالية يفرضان طلبا أكبر على عمليات زرع الرئة ، حيث لا يزال العلاج القياسي الذهبي للمرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المميتة18. يمثل نظام تغلغل الرئة في الجسم الحي السابق منصة ممتازة لاختبار العلاجات المستهدفة في كل من الأبحاث الأساسية والسريرية. على المستوى السريري ، يمكن استخدام نظام التشوه الحي السابق لتقييم أنسجة الكسب غير المشروع خارج الجسم ، مما يسمح باختبار العضو المعزول قبل زرعه ، مما يساعد على جمع البيانات السريرية لتكهنات أكثر دقة حول فعالية عملية الزرع. يمكن أن يساعد الاستخدام العقلاني لنظام تغلغل الرئة المعزول في تحسين جراحة زرع الرئة ، مما يجعلها إجراء أكثر أمانا وأكثر اختيارية. نموذج الرئة المعزول مفيد أيضا في البحث الأساسي للتشخيص المتقدم وتقنيات العلاج مثل غرس الخلايا الجذعية الوسيطة وغيرها من العلاجات بوساطة المناعة. وقد أظهرت العديد من التقارير إمكانات تقنية التشوه السابق الجسم الحي كمنصة لإجراء مزيد من البحوث حول الحفاظ على الرئة في تطوير تقنيات لتجنب إصابة نقص التروية وذمة رئوية، وإطالة صلاحية الجهاز15. بعض خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والقيود المرتبطة نموذج الرئة معزولة هي أساسا الوقت القصير المتاح لهذه التقنية لتوليد وذمة ممكن الناجمة عن الحد من استنزاف اللمفاوية، فضلا عن تأثير الجهازية لهذه التقنية. يعتبر تحديد معامل الترشيح الشعري (Kfc) معيارا موثوقا لقياس وظائف الأنسجة الرئوية المحفوظة وتحديد مدى الوذمة عبر الزمن. لم يتم العثور على أي فرق بين القرارات اليدوية والتلقائية ل Kfc19.
مع انتشار استخدام نظام تغلغل الرئة المعزول وتغيير العلاجات الجديدة للمشهد السريري ، أصبحت تقنية التشوه الحي السابق خيارا اختياريا لتحسين نتائج المرضى في أمراض الرئة المختلفة ، بالإضافة إلى زيادة مجموعة المتبرعين المحتملين بالرئة دون المساس بسلامة المتلقي ، واعدا بعهد جديد في الحفاظ على الرئة وزرع الرئة. ويبرز ظهور وباء كوفيد-19 وزيادة انتشار مرض الانسداد الرئوي المزمن(18,20) بين سكان العالم الحاجة إلى إجراء المزيد من البحوث الأساسية في علم وظائف الأعضاء الرئوية، والحفاظ على الرئة، وزرع الرئة، فضلا عن البحوث قبل السريرية للعلاجات الجديدة ذات الآراء نحو الطب التحويلي. وعلاوة على ذلك، فإن نموذج الأرنب السابق فيفو هو نموذج عملي ويمكن الوصول إليه لتدريب السكان والطلاب في مجال أمراض الرئة، ولا سيما أولئك الذين يشاركون في جراحة الصدر وECMO. يتم تشجيع أي مختبر يشارك في بروتوكولات البحوث التنفسية أو الصدرية على النظر في نظام تغلغل الرئة المعزول كجزء من أدواتهم اليومية لتجاربهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتورة بيتينا سومر سرفانتس على دعمها في كتابة هذه المخطوطة، وكيتزيا إيلينا لارا سافونت على دعمها للرسوم التوضيحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
