Summary
고립 된 토끼 폐 제제는 폐 연구에서 금 표준 도구입니다. 이 간행물은 기도 반응성, 폐 보존 및 폐 이식 및 폐 부종의 전임상 연구에 관여하는 생리적 및 병리학 적 메커니즘의 연구를 위해 개발 된 기술을 설명하는 것을 목표로합니다.
Abstract
고립 된 폐 관류 시스템은 폐 연구에서 널리 사용되어 미세 및 거시적으로 폐의 내부 작동을 해명하는 데 기여했습니다. 이 기술은 순환 물질 과 흡입 또는 perfused 물질의 효과 사이의 상호 작용을 포함하여 대사 활동 과 호흡 기능을 측정하여 폐 생리학 및 병리학의 특성화에 유용합니다. 시험관 내 방법은 조직의 슬라이스 및 배양을 포함하지만, 고립 된 전 생체 폐 관류 시스템은 환기 및 관류를 재현하면서 지속적인 생리 적 기능의 연구를 가능하게하는 완전한 기능성 기관과 함께 작동 할 수 있습니다. 그러나 중앙 내분과 림프 배수의 부재의 효과는 여전히 완전히 평가되어야한다는 점에 유의해야합니다. 이 프로토콜은 실험 실험실 동물로부터 폐와 심장의 수술 추출 및 캐니언화에 이어 분리된 폐 장치의 조립을 설명하고 데이터의 관류 기술 및 신호 처리를 표시하는 것을 목표로 합니다. 격리된 폐의 평균 생존가능성은 5-8h 사이입니다. 이 기간 동안 폐 모세관 투과성이 증가하여 부종과 폐 손상을 유발합니다. 보존된 폐 조직의 기능은 시간이 지남에 따라 폐 부종의 정도를 결정하는 데 사용되는 모세관 여과 계수(Kfc)에 의해 측정됩니다.
Introduction
브로디와 딕슨은 1903년 전 생체폐 관류 시스템을 처음 설명했다. 그 이후로 폐의 생리학, 약리학, 독성학 및 생화학을 연구하기위한 금 표준 도구가되었습니다2,3. 이 기술은 폐 이식의 생존가능성을 평가하고 히스타민, 아라키도니아산 대사산물 및 물질 P와 같은 염증 성 중재자의 효과뿐만 아니라 기관지 수축, 천자 수축 및 폐 적 부종과 같은 폐 현상 동안의 상호 작용을 결정하는 일관되고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 고립 된 폐 시스템은 일반 순환에서 생물 발생 아민의 제거에 폐의 중요한 역할을 공개하는 중요한 기술이었다4,5. 또한, 시스템은 폐 계면 활성제6의 생화학을 평가하는 데 사용되었습니다6. 지난 수십 년 동안, 전 생체 폐 관류 시스템은 폐 이식 연구를위한 이상적인 플랫폼이되었다7. 2001년 Stig Steen의 한 팀은 19세 기증자의 폐를 재조정하기 위해 이 시스템을 사용하여 전 생체 폐 관류 시스템의 첫 임상 적용을 설명했는데, 이 기구는 부상으로 인해 이식 센터에 의해 처음 거부되었습니다. 왼쪽 폐는 65분 동안 수확되고 퍼프되었습니다. 그 후, 그것은 성공적으로 COPD8와 70 세의 남자로 이식되었다. 전 생체 내 관류를 사용하여 폐 재조절에 대한 추가 연구는 부상당한 기증자 폐9,10을 평가하고 치료하기 위해 확장 된 폐 관류를위한 토론토 기술을 개발하도록 주도했습니다. 임상적으로, 전 생체 폐 관류 시스템은 표준 기준 기증자10에 대하여 위험 또는 결과에 있는 중요한 다름을 제시하고, 취급하고 표준 표준 기증자 폐를 재조정하여 기증자 풀을 증가하는 안전한 전략인 것을 보여주었습니다.
고립 된 폐 관류 시스템의 주요 장점은 실험 파라미터가 인공 실험실 설정에서 생리 적 기능을 보존하는 완전한 기능성 기관에서 평가 될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 폐 기계 환기의 측정 및 조작을 통해 기도 저항, 총 혈관 저항, 가스 교환 및 부종 형성과 같은 폐 생리학의 구성 요소를 분석할 수 있으며, 이는 현재까지 실험실 동물에 대한 생체 내에서 정확하게 측정할 수 없다2. 특히, 폐가 침투되는 용액의 조성은 완전히 조절될 수 있으며, 추가 연구를 위해 관류로부터 실시간으로 그 효과를 평가하고 샘플 수집을 할 수 있게 한다11. 고립 된 폐 시스템으로 일하는 연구원은 기계적 환기가 폐 조직의 붕괴를 유발하여 유용한 시간을 단축한다는 것을 명심해야합니다. 기계적 파라미터의 이러한 점진적 낙하는 실험4의 시간 동안 때때로 폐를 과열하여 현저하게 지연될 수 있다. 여전히, 준비는 일반적으로 8 시간 이상 지속될 수 없습니다. 전 생체 폐 관류 시스템에 대한 또 다른 고려 사항은 중추 신경계 조절 및 림프 배수의 부재입니다. 그들의 부재의 효력은 아직 완전히 이해되지 않으며 잠재적으로 특정 실험에 있는 편견의 근원이 될 수 있습니다.
고립 된 폐 관류 시스템 기술은 높은 수준의 일관성과 재현성을 가진 토끼 모델에서 수행 될 수있다. 이 작품은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 엔페르메다데스 호흡증에서 토끼 모델을 위해 개발된 전 생체 내 외 외 폐 관류 기술의 구현을 위한 기술적 및 외과 적 절차를 설명하고, 통찰력을 공유하고이 실험 모델의 적용에 중요한 단계에 대한 명확한 가이드를 제공하려고합니다.
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Protocol
토끼 모델의 고립 된 관류 시스템은 Instituto Nacional 드 Enfermedades 호흡증선의 기관지 과잉 반응 연구소에서 널리 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 대략 무게가 2.5-3kg인 뉴질랜드 토끼가 포함됩니다. 모든 동물은 실험실 동물에 대한 공식 멕시코 지침 (NOM 062-ZOO-1999)과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (8 판, 2011)에 따라 표준 vivarium 조건 및 광고 리비툼 공급에 보관되었습니다. 이 프로토콜에 제시된 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 이전에 Instituto Nacional 드 Enfermedades Respiratorias의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 고립된 폐 관류 시스템의 준비는 마취 하에 그리고 안락사를 통해 동물의 의도적인 죽음을 관련시킵니다.
1. 장비 및 장치의 준비.
- 장비 배치:
- 토끼의 무게에 따라 크기가 있는 수술테이블을 설정합니다.
- 강철 기둥에 인공 흉부 덮개를 장착하고 유리 챔버 아래에 유리 챔버와 측면에 롤러 펌프가있는 인공 호흡기를 장착합니다.
- 커버가 기관장 캐뉼라를 기관지와 일치시키는 경향이 있어 더 빠른 연결을 가능하게 합니다.
- 인공 흉부:
참고 : 그것은 시스템의 필수적인 부분입니다. 특수 커버로 밀봉된 워터 재킷 유리 챔버로 구성되어 있습니다. 커버는 기관및 혈관을 이식할 수 있는 연결과 함께 장기 홀더로 작동합니다.- 인공 흉부 내부에 음압을 생성하기 위해 압축 공기로 작동하는 벤츄리 제트를 설정합니다.
참고: 환기 제어 모듈(VCM)은 호흡 률 및 총 사이클 지속 기간에 대한 호흡 률 및 호흡 기간의 비율을 별도로 조정할 수 있습니다.
- 인공 흉부 내부에 음압을 생성하기 위해 압축 공기로 작동하는 벤츄리 제트를 설정합니다.
- 기구:
- 일반적으로 작동하는 장치는 인공 흉부를 들고 베이스 플레이트에 장착 된 주요 강철 기둥으로 구성되어 있는지 확인하며, 기압 측정기와 무게 트랜스듀서가 그 위와 거품 트랩이있는 예열 코일 뒤에 위치합니다.
- 하나의 차동 압력 변환기를 폐렴기계에 연결하고 다른 하나는 챔버 압력에 연결합니다. 관류 및 정맥 압력을 측정하기 위해 흉부 뒤에 다른 압력 변환기를 설정합니다.
- 산소 공급장치 아래의 전환 재고를 장치 옆에 있는 레벨 전극 및 환기 시스템과 연결합니다.
2. 심폐 블록의 외과 추출.
- 마취:
- 진정제 (자일라진)와 바르비투르산염 (펜토바르비탈)의 조합을 사용합니다.
참고: 다른 마취 칵테일은 실험 결과에 영향을 미치지 않고 사용할 수 있습니다. - 먼저, 건강한 뉴질랜드 토끼를 자일라진 염산염(3-5 mg/kg)의 단일 근육 주사로 진정시킵니다. 토끼가 주입 몇 분 후에 추가 조작을 허용하도록 조용하고 편안한 상태를 유지하십시오.
- 다음 체형, 한계 (측면) 귀 정맥을 펜토 바르 비탈 나트륨 (28 mg/kg)의 정맥 주사와 토끼를 마취에 액세스 할 수 있습니다 사용합니다.
- 진정제 (자일라진)와 바르비투르산염 (펜토바르비탈)의 조합을 사용합니다.
- 모니터링:
- 부족 한 마취 또는 심장 및 호흡 기능의 과도 한 우울증을 방지 하려면 다음 매개 변수를 모니터링. 마취의 깊이를 평가하려면 발가락 핀치 테스트를 수행하십시오.
- 점막이 분홍색인지 확인합니다. 파란색 또는 회색 음영은 저산소증을 나타냅니다.
- 심박수가 120-135비트/분 사이이고 체온이 36.5°C 이하로 떨어지지 않도록 하십시오.
- 동물 배치:
- 토끼의 몸통을 면도하고 동물을 수술대에 놓습니다. 통풍 시스템을 테이블 근처에 놓고 토끼의 머리 뒤에, 기관 절제술 후 캐뉼라를 신속하게 연결하여 티슬 손상을 피하십시오.
- 절개 및 기관 절제술:
- 다이어프램에서 목까지 3-5cm의 복부 중앙분리성 으로 피부를 해부합니다.
- 작동 가위를 사용하여 두 연골 고리 사이에 기관지의 전방 2/3을 잘라 기관 섬유 막을 통해 기관 캐뉼라를 삽입합니다.
- 5mm(외부 직경)를 삽입합니다. OD) 기관 섬유 막을 통해 기관 캐뉼라를 사용하고 신중하게 해결하기 위해 4-0 실크 봉합사를 사용합니다.
- 통관이 기관지에 구부러지지 않도록 집게 또는 핀셋을 기관 아래에 놓습니다.
- 양압 환기:
- 폐가 인공 흉부 외부에 남아있는 한, 수술 중 폐 붕괴를 방지하기 위해 양압을 환기시키기 위해 작은 종 호흡 펌프를 사용합니다.
- 기관 절제술 후 흉부가 열리기 전에 호흡 펌프에 연결된 기관 캐뉼라를 통해 환기를 시작하십시오.
- 조력 량을 10mL/kg으로 설정합니다.
참고: 실험 설정 및 인공 흉부 모델에 따라 음압 또는 다른 환기 를 제공하는 데 사용되는 동일한 환기 펌프로 양압 환기를 제공하여 빠른 재캐닝을 제공합니다.
- 소라코토미와 신전:
- 흉부 구멍에 액세스하려면 메스 또는 가위를 사용하여 흉부 벽을 열고 흉부의 상위 3 분의 1까지 내측 스분루를 수행하십시오.
- 두 개의 리트랙터에 의해 열 흉부 반쪽을 잡아. 몇몇 폐 플랩은 일반적으로 심혼을 포위합니다.
- 우수하고 열등한 베나 카바를 현지화하고 실로 참조하십시오.
- 동물의 멸종 전에, 오른쪽 심실을 식별하고 헤파린의 1000 UI / kg을 주입.
- 주입 직후, 사전 루프 스레드로 우수하고 열등한 베나 카바를 리게이트하고 exsanguination을 수행합니다.
- 심장 폐 수확:
- 심폐 블록을 부드럽고 빠르게 수확하십시오. 흉부에서 폐를 제거하기 위해 결합 조직을 분리하기 위해 직접 디지털 해부 또는 스프링 가위를 사용합니다.
- 식도뿐만 아니라 이 지역의 혈관을 해부합니다.
- 관내 스테미를 잘라 기관 캐뉼라쪽으로 내측 스테르노절제술을 확장하고 양쪽의 기관지를 연결 조직에서 방출합니다.
- 지금, 기관 캐뉼라 위의 기관 절제술. 기관지와 폐의 등쪽 고정이 절제됨에 따라 두개골 축에서 캐뉼라를 부드럽게 당깁니다.
- 캐니어레이션:
- 흉부에서 고립된 폐를 들어 올리고 페트리 접시에 멸균 거즈 위에 조심스럽게 놓습니다.
- atelectasis를 방지하기 위해 2cmH2O로 설정된 양압 환기를 사용하여 폐를 환기시하십시오.
- 대실 홈의 수준에서 심장을 잘라서 심실을 제거합니다.
- 두 개의 심실을 열후, 폐 동맥을 통해 바구니와 토끼에 대한 OD 4.6mm 폐 동맥 캐뉼라를 소개하고 왼쪽 아트리움에 모성 밸브를 통해 바구니와 토끼에 대한 OD 5.9mm 왼쪽 아트리움 캐뉼라를 소개합니다.
- 폐 동맥에 4-0 실크 봉합사를 사용하고 왼쪽 아트리움을 사용하여 캐뉼러를 수정하십시오. 이러한 구조의 팽창을 피하기 위해 폐 동맥의 합자 및 왼쪽 아트리움에 주변 조직을 포함한다.
- 동맥 캐뉼라를 통해 식염수 동소항용액 250mL를 주입하여 혈관 침대에서 남은 혈액을 플러시하십시오.
3. 관류 기술.
- 설치:
- 격리된 폐를 폐 챔버에 조심스럽게 넣습니다.
- 기관체를 챔버 의 표지에 있는 트랜스덕터에 부착합니다.
- 관류 시스템에 캐누액 선박을 연결합니다.
- 챔버를 닫고 회전 잠금 장치로 고정하십시오.
참고: 재순환 관류 회로는 개방형 정맥 저수지, 연동 펌프, 열교환기 및 버블 트랩으로 구성됩니다. - 이 시점에서 챔버 뚜껑을 부착하고 스톱콕을 통해 전환하여 양압 환기로 전환합니다. 폐의 음압 환기와 챔버의 밀폐 폐쇄를 확인하려면 압력 게이지에 대한 폐 및 챔버 압력의 호흡 소풍을 검사합니다.
- 200mL의 인공 혈액 이내 난부(소 알부민의 2.5%를 함유한 크렙스 링거 중탄산완충액)로 폐를 퍼퓨즈합니다.
- 3mL/min/kg에서 난투류 흐름을 시작한 다음 5분 동안 흐름을 5mL/min/kg으로 천천히 강화합니다. 다음 5분 동안 8mL/min/kg의 흐름에 도달한 다음 5분 후에 최대 10mL/min/kg의 플럭스에 도달합니다. 회로에 들어가는 공기를 피하는 것을 돌봐.
참고: 생리 범위 내에서 퍼퓸의 pH 및 온도를 유지한다(pH 7.4-7.5; 온도, 37°C-38°C). pH를 조정하려면 NaHCO3(1N)를 추가하거나 이산화탄소의 흐름을 증가시면 됩니다. 또는 HCl(0.1N)을 사용하여 산성화하십시오.
- 매개 변수:
- 미리 정해진 관류 및 환기 매개 변수가 필요에 따라 설정되었는지 확인합니다.
- 30 bpm의 주파수에서 가습 공기, 10 mL/kg의 조수 부피 및 2cmH2O의 최종 만료 압력 (Pe)으로 폐를 환기시하십시오.
참고: 폐 동맥 압력(0-20 mmHg)은 폐 트렁크 보다 센티미터 높은 산소레이터 또는 저수지의 액체 레벨의 높이에 해당하며, 폐 정맥 압력은 좌심방 위의 압력 평형 챔버의 높이에 해당한다. 두 값을 모두 수정할 수 있습니다. 왼쪽 아트리움 압력도 0-20 mmHg입니다.
- 영역 3 조건 달성:
- 폐 동맥에 고정된 캐뉼러의 측면 포트에 연결된 두 카테터를 사용하여 동맥(Pa) 및 정맥(Pv) 압력을 측정합니다.
- 폐 힐룸(제로 참조)의 수준에서 기준 압력을 설정합니다.
- 영역 3 환기 조건하에서 실험을 수행합니다. 이를 위해 10-15분 동안 대기하여 동위원소 상태를 특징으로 하는 평형을 얻습니다.
- 정맥 압력이 폐포 압력 (Palv)보다 높고 동맥 압력이 Zone 3 조건에 대한 두 가지 (Pa > Pv > Palv)보다 높은 상태로 유지되도록합니다.
- 폐의 무게가 일정하게 유지되고 동맥 및 왼쪽 심방 압력이 안정되어 최대 수의 폐 혈관을 열고 실험 중에 미세 혈관 침대 함량을 유지하기 위해 영역 3 조건을 달성하십시오.
참고: 폐 부종의 지표로서 Kfc를 측정하는 것은 수동 및 자동 관류 시스템 사이에 차이가 없습니다.
- 전자 제어 및 신호 처리: 호흡기 흐름, 체중 변화, 미세 혈관 압력, 조수 부피, 혈관 저항 등이 트랜스듀서에서 나오는 신호를 통합하고 평가 시스템에 표시하는 여러 중앙 전자 장치에 등록되어 있는지 확인합니다.
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Representative Results
고립 된 폐 관류 시스템은 생검에 대한 장기 조작, 관류에서 샘플 수집 및 생리 적 매개 변수의 실시간 데이터 수집을 허용합니다. 고립 된 시스템은 다른 기능과 폐 현상을 포함 하는 많은 가설을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다., 신진 대사와 효소 활동에서 부 종 형성 및 폐 이식에 대 한 보존 기간.
도 1은 환기 시스템 및 계산된 데이터 수집과 함께 완전히 조립된 절연 폐 관류 시스템의 다이어그램을 표시합니다. 시스템의 관류 성분은 난투가 지속적으로 고립 된 폐를 통해 흐르는 것을 보장합니다. 폐 동맥은 유입 관류를 제공하기 위해 캔투, 난투 유출은 심장의 왼쪽 아트리움을 캐너레이션에 의해 제공됩니다. 난투는 롤러 펌프를 사용하여 전달되어 열교환기를 통과한 다음 거품 트랩을 통해 폐 동맥으로, 그리고 마지막으로 폐 혈관 침대로 전달됩니다. 시스템의 환기 성분은 환기 매체가 기관 캐뉼라를 통해 직접 폐렴구균계의 단부를 지나 폐로 지속적으로 흐를 수 있게 합니다.
도 2는 4°C에서 24h까지 보존된 고립된 폐에서 MAO(도 2A) 및 5-HT(도 2B)의 농도를 나타낸다. 세로토닌과 모노아민 산화제 수준은 서로 다른 시간에 얻어진 내분액 샘플로부터 결정되었고 ELISA에 의해 분석되었다. 5-HT 농도는 보존 15분 후에 정점에 달한 다음 다음 6시간 동안 감소하였다. 그 후, 관류 수준은 24 시간까지 비 통계적으로 유의한 증가를 보였다. MAO 수준은 유사한 행동을 보였다, 보존의 15 분 후 피크, 다음 6 시간 동안 감소 24 시간12. 도 3은 4°C에서 단단된 폐 제제에서 24h를 통해 측정된 초기 값의 백분율로 표현된 5-HT 및 MAO 방출 속도를 나타낸다. 보존의 첫번째 시간 도중, 5-HT 수준은 MAO 보다는 높게 상승하고 내피 세포 및 혈소판 및 MAO 매개이화한 이화작용에 의해 탈환된 후에 6 시간 안에 감소했습니다.
도 4는 NEP(광학 밀도/mg 단백질/분), 및 고립된 폐 제제에서 시간을 통해 ACE 효소 활성(광학 밀도/mg 단백질/분)을 나타낸다. NEP 활성(그림 4A)은 N-Dansyl-D-Gly-Gly-pnitro-Phe-Gly를 NEP 기판으로 사용하여 분광측정 분석에 의해 결정되었으며, 그 다음으로 ACE를 억제하기 위한 에날프티프 첨가하였다. ACE 활성(도 4B)은 에널april을 ACE 기판으로 사용하여 분광측정 분석에 의해 결정되었고, 그 다음으로 NEP를 억제하기 위해 인산파아미동을 첨가하였다. 두 솔루션 모두 enalapril를 포함했기 때문에 ACE 활성은 enalapril13의 유무에 관계없이 샘플 간의 형광의 차이로 계산되었습니다.
도 5는 토끼 모델에서 고립된 폐 관류 시스템에서 24h의 기간을 통해 모세관 투과성(mKfc)에서 폐 보존의 효과를 나타낸다. 대조군(n =6)은 수확 직후 평가, 2.8± 0.8(mL/min/cmH2O/g) 표준 오차의 mKfc를 가졌으며, 대조적으로, perfused 폐는 mKfc에서 6h, 10.8 ± 2.3(n =6)에서 7.5± 1.4 (n = 6)로 점진적인 증가를 겪었으며 12시간 에서 16.3± ± 2.5(64시간) 2.5(64시간) 2.54에 도달하였다.
도 6은 다양한 조건하에서 고립된 폐 관류 시스템의 모세관 투과성에서 상이한 첨가제의 효과를 나타낸다. 10cmH2O의 급격한 압력 증분은 모세관 여과 계수(Kfc)를 통해 모세관 층의 투과성을 측정하기 위해 정맥 유출의 부분적인 방해에 의해 생성된다. Kfc를 측정하기 위해 왼쪽 심실에서 크렙스 저수지로 나가는 유출 튜브가 부분적으로 고정되었습니다. 이어서, 부분 클램프는 압력 증분이 10cmH2O에 도달했는지 확인하기 위해 3분 동안 유지되었다. 클램핑이 해제되었고 정상 흐름이 계속되었습니다. 이 기동은 동맥 압력과 폐 체중 확대의 증분으로 등록되었다. 이 마지막 매개 변수는 Kfc로 간주됩니다.
그림 1: 격리된 폐 관류 시스템을 위한 다이어그램. 이 수치는 휴고 삭스 엘렉트로닉 (HSE), 하버드 장치14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세로토닌의 농도 (5-HT) 및 monoamine 산화 제 (MAO) 폐 물질 대사와 혈관 투과성에 관여. (A) MAO 및 (B) 5-HT의 농도는 4°C에서 24시까지 보존된 고립된 폐에서 5-HT를 참조하십시오 .
그림 3: 세로토닌의 방출 속도 (5-HT) 그리고 모노 아민 산화 제 (MAO). 4°C에서 단단된 폐 제제에서 24h를 통해 측정된 초기 값의 백분율로 표현된 5-HT 및 MAO의 방출 속도는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 중성 내피티다제(NEP) 및 안지오텐신 변환 효소(ACE)의 효소 활성. (A) NEP 및 (B) ACE의 효소 활성은 4°C에서 24시까지 보존된 고립된 폐에서 시간을 통해 본 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 모세관 투과성(mKfc)에서 폐 보존의 효과. 이 데이터는 토끼 모델에서 고립된 폐 관류 시스템에서 24h의 기간을 통해 모세관 투과성(mKfc)에서 폐 보존의 효과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 모세관 투과성에서 다른 첨가제의 효과. 다양한 조건하에서 분리된 폐 관류 시스템의 모세관 투과성에서 상이한 첨가제의 효과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 폐 생리학 연구에서 필수적인 기술인 고립된 폐 관류 시스템의 일반적인 견해를 표시합니다. 고립 된 폐 관류 시스템은 그것의 사용에 있는 다재다능성의 큰 정도를 제공하고 가설의 넓은 범위의 시험에서 관련있는 몇몇 매개변수의 평가를 허용합니다15. 고립 된 폐 시스템은 지난 10 년 동안 장기 별 평가를위한 관련성을 더욱 확립하고 중년 줄기 세포16 및 CRISPR / Cas9 게놈 엔지니어링17과 관련된 최첨단 기술과 새로운 치료법의 확장으로 유용성을 확장한 전 세계적으로 존재합니다. 현재 전 생체 폐 관류 연구 영역은 항 염증 전략, 환기 손상 관리 및 예방, 항 거부 치료 및 폐 부종 성능15를 광범위하게 다룹니다.
올바른 데이터 회수를 보장하기 위해서는 장치의 적절한 조립이 필요합니다. 도 1 에 도시된 바와 같이 전체 시스템은 각각 폐의 호흡 및 순환 기능을 모방하는 환기 시스템에 부착된 음압 습식 챔버와 관류 시스템으로 구성된다. 두 시스템 모두 모든 프로토콜의 요구에 맞게 조정할 수 있는 측정 장치를 추가할 수 있는 데이터 수집 시스템에 연결됩니다. 유산소폐블록을 수확하는 외과과정은 실험 중 생리적 기능이 추가간섭 없이 계속될 수 있도록 폐를 가능한 한 그대로 유지하기 위해 추가 조직 손상을 피하기 위해 숙련된 인력에 의해 신속하게 수행되어야 한다. 이 시스템은 또한 다른 폐 기능에서 특정 분자의 효과를 결정하는 데 사용할 수있는 실시간 관류 샘플 수집을 허용합니다 (예를 들어, 폐 보존에 대한 헤파린 효과).
폐 혈관, 즉 모세 혈관 간의 관류 흐름의 적절한 분포를 달성하기 위해 영역 3 조건을 조달해야합니다. 영역 1 조건은 동맥 압력이 폐포 압력 이하로 떨어지는 영역으로 정의되며, 일반적으로 대기압에 접근합니다. 이런 일이 발생하면 모세 혈관이 평평해져 혈액이나 관류 흐름이 불가능합니다. 정상적인 상황에서는 동맥 압력이 유동 분포를 보장하기에 충분하기 때문에 영역 1이 존재할 수 없습니다. 그러나, 영역 1 조건은 동맥 압력이 떨어지거나 폐포 압력이 증가하는 경우 나타날 수 있습니다 (양압 환기 시와 마찬가지로). 영역 1 조건은 가스 교환을 수행할 수 없는 불침투성 환기 폐로 이어집니다. 영역 2 조건에서 동맥 압력은 폐포 압력보다 높습니다. 그러나 정맥 압력은 폐포 압력 아래에 남아 있어 동맥 및 폐포 압력의 차이에 의해 결정된 관류 흐름이 발생합니다. 이 동작은 Starling 저항기로 모델링할 수 있습니다. 영역 3 조건은 동맥 과 정맥 압력의 차이에 의해 결정된다. 영역 3의 관류 흐름의 증가는 모세혈관이 분산되어 최대 수의 폐 혈관개구부를 조절하기 때문에 발생합니다.
이 시스템의 장치는 7개의 모듈로 구성되어 있습니다: 아날로그 LED 바 그래프 신호가 장착된 두 개의 아날로그 트랜스듀서 앰프 모듈(TAM-A)은 동적 신호(혈압, 호흡기 기류, 수축력 등), 디지털 트랜스듀서 앰프 모듈(TAM-D) 1개, 느린 변화하는 펄라틸렌 신호를 모니터링하도록 설계된 디지털 트랜스듀서 앰프 모듈(TAM-D) 1개, 연동 펌프를 사용하여 격리 된 기관 관류의 관류 제어를 위해 TAM-A 및 TAM-D 증폭기와 함께 작동하는 관류 모듈 (SCP)용 서보 컨트롤러는 일정한 압력 모드로 설정하거나 SCP를 통해 수동으로 제어 할 수 있습니다. 폐 중량을 측정하는 부종 균형 모듈(EBM); 양압 및 음압 환기를 제어하는 환기 제어 모듈(VCM)과 VCM을 트리거하여 깊은 영감 주기를 수행할 수 있는 타이머 카운터 모듈(TCM)이 있습니다.
폐 및 호흡기 애정의 높은 글로벌 보급과 현재 치료 옵션의 한계는 폐 이식에 대한 더 큰 수요를 강요하고 있다, 그것은 말기 폐 질환 환자에 대한 금 표준 치료 남아로18. 전 생체 폐 관류 시스템은 기본 및 임상 연구 모두에서 표적 치료를 테스트하는 우수한 플랫폼을 나타냅니다. 임상 수준에서, 전 생체 내 관류 시스템은 이식 전에 격리된 기관을 시험할 수 있도록, 이식의 효과에 대한 보다 정확한 예후를 위한 임상 데이터를 수집하는 것을 돕는, 바디 외부의 접목 조직을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고립 된 폐 관류 시스템의 합리적인 사용은 폐 이식 수술을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다, 그(것)들을 더 안전하고 더 선택적인 절차를 만들기. 고립 된 폐 모델은 또한 중간 엽 줄기 세포 및 기타 면역 매개 요법의 주입과 같은 고급 진단 및 치료 기술의 기본 연구에서 유용하다; 많은 보고는 허혈-재퍼퓨전 손상 및 폐 부종을 피하기 위하여 기술의 발달에 있는 폐 보존에 추가 연구를 하기 위하여 플랫폼으로 전 생체 o 관류 기술의 잠재력을 보여주었습니다, 장기 생존성을 연장하15. 고립된 폐 모델에 관련된 일부 문제 해결 단계 및 제한은 주로 림프 배수 제한뿐만 아니라 기술의 전신 효과에 의해 유도될 수 있는 부종 생성을 위한 이 기술의 짧은 사용 시간이다. 모세관 여과 계수(Kfc) 결정은 보존된 폐 조직의 기능을 측정하고 시간을 통해 부종의 정도를 확립하는 신뢰할 수 있는 기준이다. Kfc19의 매뉴얼과 자동 판정 사이에는 차이가 없습니다.
고립된 폐 관류 시스템의 사용이 대중화되고 새로운 치료법이 임상 환경을 변화함에 따라, 전 생체 내 관류 기술은 다른 폐 병리학에서 환자 결과를 개선하고 수신자의 안전을 손상시키지 않고 잠재적 인 폐 기증자의 풀을 증가시키는 선택적 선택이되고 있으며 폐 보존 및 폐 이식의 새로운 시대를 약속합니다. Covid-19 전염병의 출현과 COPD의 보급증가18,20은 폐 생리학, 폐 보존 및 폐 이식에 대한 추가 기본 연구의 필요성뿐만 아니라 번역 의학을 향한 견해를 가진 새로운 치료법의 전임상 연구의 필요성을 강조합니다. 또한, 전 생체 토끼 모델은 폐학 분야에서 주민과 학생, 특히 흉부 수술 및 ECMO와 관련된 사람들을 양성하는 접근 가능하고 실용적인 모델입니다. 호흡기 또는 흉부 연구 프로토콜에 관여하는 모든 실험실은 격리된 폐 관류 시스템을 실험용 일일 도구의 일부로 고려하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 이 원고를 쓰는 베티나 소머 세르반테스 박사와 키치아 엘레나 라라 사폰트가 일러스트레이션을 지원해 준 것에 대해 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
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