Summary
İzole tavşan akciğer hazırlığı pulmoner araştırmalarda altın standart bir araçtır. Bu yayın, tekniğin hava yolu reaktivitesi, akciğerin korunması ve akciğer nakli ve pulmoner ödemde preklinik araştırmalarda yer alan fizyolojik ve patolojik mekanizmaların incelenmesi için geliştirilmiş olarak tanımlanmaktadır.
Abstract
İzole akciğer perfüzyon sistemi pulmoner araştırmalarda yaygın olarak kullanılmış ve akciğerlerin iç işleyişini hem mikro hem de makroskopik olarak aydınlatmaya katkıda bulunmaktadır. Bu teknik, ilaç testinde olduğu gibi dolaşım maddeleri arasındaki etkileşimler ve solunan veya perfüzyonlu maddelerin etkileri de dahil olmak üzere metabolik aktiviteleri ve solunum fonksiyonlarını ölçerek pulmoner fizyoloji ve patolojinin karakterizasyonunda yararlıdır. İn vitro yöntemler dokuların dilimlenerek kültünü içerirken, izole ex vivo akciğer perfüzyon sistemi, havalandırma ve perfüzyonu yeniden canlandırırken sürekli fizyolojik bir fonksiyonun çalışmasını mümkün kılması için eksiksiz bir fonksiyonel organla çalışmaya izin verir. Bununla birlikte, merkezi innervasyon ve lenfatik drenajın yokluğunun etkilerinin hala tam olarak değerlendirilmesi gerektiği belirtilmelidir. Bu protokol, izole edilen akciğer aparatının montajını, ardından deneysel laboratuvar hayvanlarından akciğerlerin ve kalbin cerrahi olarak çıkarılmasını ve kanülasyonunu tanımlamayı ve verilerin perfüzyon tekniğini ve sinyal işlemesini görüntülemeyi amaçlamaktadır. İzole akciğerin ortalama canlılığı 5-8 saat arasında değişmektedir; bu dönemde pulmoner kılcal geçirgenlik artarak ödem ve akciğer yaralanmasına neden oluyor. Korunmuş pulmoner dokunun işlevselliği, zaman içinde pulmoner ödemin boyutunu belirlemek için kullanılan kılcal filtrasyon katsayısı (Kfc) ile ölçülür.
Introduction
Brodie ve Dixon ilk olarak 1903 1'de ex-vivo akciğer perfüzyon sistemini tanımladılar. O zamandan beri, akciğerlerin fizyolojisi, farmakolojisi, toksikolojisi ve biyokimyasını incelemek için altın standart bir araç haline gelmiştir2,3. Teknik, akciğer nakillerinin uygulanabilirliğini değerlendirmek ve histamin, araşidonik asit metabolitleri ve P maddesi gibi enflamatuar mediatörlerin yanı sıra bronkokonstriksiyon, atelektaz ve pulmoner ödem gibi pulmoner fenomenler sırasında etkileşimlerinin etkisini belirlemek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yol sunar. İzole akciğer sistemi, biyojenik aminlerin genel dolaşımdan elimine edilmesinde akciğerlerin önemli rolünü ortaya çıkarmada önemli bir teknik olmuştur4,5. Ek olarak, sistem pulmoner yüzey aktif maddesinin biyokimyasını değerlendirmek için kullanılmıştır6. Son birkaç on yılda, ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi akciğer nakli araştırmaları için ideal bir platform haline gelmiştir7. 2001 yılında Stig Steen liderliğindeki bir ekip, ex-vivo akciğer perfüzyon sisteminin ilk klinik uygulamasını, yaralanmaları nedeniyle başlangıçta transplantasyon merkezleri tarafından reddedilen 19 yaşındaki bir donörün akciğerlerini yenilemek için kullanarak tanımladı. Sol akciğer 65 dakika boyunca hasat edildi ve perfüzyon yapıldı; daha sonra, KOAH8'li 70 yaşındaki bir adama başarıyla nakledildi. Ex-vivo perfüzyonu kullanarak akciğer yenileme ile ilgili daha fazla araştırma, yaralı donör akciğerleri değerlendirmek ve tedavi etmek için genişletilmiş akciğer perfüzyonu için Toronto tekniğinin geliştirilmesine yol açtı9,10. Klinik olarak, ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi, standart altı donör akciğerleri tedavi ederek ve yenileyerek donör havuzlarını artırmak için güvenli bir strateji olduğunu göstermiş ve standart kriterlere karşı risklerde veya sonuçlarda önemli bir fark sunmamıştır10.
İzole akciğer perfüzyon sisteminin en büyük avantajı, deneysel parametrelerin yapay bir laboratuvar kurulumu altında fizyolojik işlevini koruyan tam bir fonksiyonel organda değerlendirilebilmesidir. Ayrıca, pulmoner mekanik ventilasyonun ölçülmesi ve manipülasyonunun, pulmoner fizyolojinin hava yolu direnci, toplam vasküler direnç, gaz değişimi ve ödem oluşumu gibi bileşenlerini analiz etmesine izin verir, bu da bugüne kadar laboratuvar hayvanları üzerinde tam olarak in vivo olarak ölçülemez2. Özellikle, akciğerin perfüzyona maruz kalan çözeltinin bileşimi tamamen kontrol edilebilir, bu da maddelerin eklenmesinin etkilerini gerçek zamanlı olarak değerlendirmesini ve daha fazla çalışma için perfüzyondan örnek toplamasını sağlar11. İzole edilmiş akciğer sistemi ile çalışan araştırmacılar, mekanik ventilasyonun akciğer dokusunun çürümesine neden olduğunu ve kullanım süresini kısalttığını akılda bulundurmalıdır. Mekanik parametrelerdeki bu ilerleyici düşüş, deney sırasında akciğerlerin zaman zaman hiperenflasyona uğrayarak önemli ölçüde gecikebilir4. Yine de, hazırlık genellikle sekiz saatten fazla süremez. Ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi için bir diğer husus merkezi sinir düzenlemesi ve lenfatik drenajın olmamasıdır. Yokluklarının etkileri henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve bazı deneylerde potansiyel olarak önyargı kaynağı olabilir.
İzole akciğer perfüzyon sistemi tekniği tavşan modelinde yüksek derecede kıvam ve tekrarlanabilirlik ile yapılabilir. Bu çalışma, Mexico City'deki Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias'ta tavşan modeli için geliştirilen ex-vivo izole akciğer perfüzyon tekniğinin uygulanması için teknik ve cerrahi prosedürleri açıklar ve bu deneysel modelin uygulanmasındaki önemli adımlar hakkında içgörüleri paylaşmayı ve net bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tavşan modelinde izole perfüzyon sistemi, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias'taki Bronşiyal Hiperresponsiflik Laboratuvarı'nda yaygın olarak kullanılmaktadır. Protokol, yaklaşık 2,5-3 kg ağırlığında yeni Zelanda tavşanlarını içerir. Tüm hayvanlar standart vivarium koşullarında ve ad libitum beslemesi laboratuvar hayvanları için resmi Meksika yönergelerine (NOM 062-ZOO-1999) uygun olarak ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (8. baskı, 2011) altında tutulmuştur. Bu protokolde sunulan tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakım yöntemleri daha önce Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: İzole akciğer perfüzyon sisteminin hazırlanması, anestezi altında ve ötanazi yoluyla bir hayvanın kasıtlı ölümünü içerir.
1. Ekipman ve aparatların hazırlanması.
- Ekipman düzenlemesi:
- Tavşanın ağırlığına göre boyuta sahip bir ameliyat masası kurun.
- Yapay toraksın kapağını, altında cam hazne bulunan çelik kolona ve yanlarında bir makaralı pompa ile vantilatöre monte edin.
- Kapağın, daha hızlı bir bağlantı sağlamak için trakea ile aynı hizada trakeal canüle kolayca eğimli olduğundan emin olun.
- Yapay toraks:
NOT: Sistemin önemli bir parçasıdır. Özel bir kapakla kapatılmış su ceketli bir cam odadan oluşur. Kapak, nefes borusunu ve içine gömülü damarları kanüle etme bağlantılarına sahip organ tutucu olarak çalışır.- Yapay toraksın içindeki negatif basıncı oluşturmak için basınçlı hava ile çalışan bir venturi jeti kurun.
NOT: Havalandırma kontrol modülü (VCM), solunum ve son ekspirasyon basınçlarının yanı sıra solunum hızı ve inspiratuar sürenin toplam döngü süresine oranının ayrı ayrı ayarlanmasına izin verir.
- Yapay toraksın içindeki negatif basıncı oluşturmak için basınçlı hava ile çalışan bir venturi jeti kurun.
- Cihaz:
- Normalde çalışan bir aparatın, üzerinde pnömotachometer ve ağırlık dönüştürücüsü bulunan ve bir kabarcık tuzağı ile ön ısıtma bobininin arkasında bulunan yapay toraksı tutan bir taban plakasına monte edilmiş bir ana çelik kolondan oluştuğundan emin olun.
- Bir diferansiyel basınç dönüştürücüserini pnömotachometreye, diğerini de oda basıncına bağlayın. Perfüzyon ve venöz basınçları ölçmek için toraksın arkasına farklı birkaç basınç dönüştürücü ayarlayın.
- Oksijenatörnün altındaki değişim stoğunu seviyeli bir elektrot ve cihazın yanındaki havalandırma sistemi ile bağlayın.
2. Kardiyopulmoner bloğun cerrahi olarak çıkarılması.
- Anestezi:
- Yatıştırıcı (kslazine) ve barbitürat (pentobarbital) kombinasyonu kullanın.
NOT: Deneysel sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi olmadan farklı anestezik kokteyller kullanılabilir. - İlk olarak, sağlıklı Yeni Zelanda tavşanlarını tek bir intramüsküler ksüller kslorür enjeksiyonu ile yatıştırın (3-5 mg / kg). Enjeksiyondan birkaç dakika sonra daha fazla manipülasyona izin vermek için tavşanların sakin ve rahat kalmasını sağlayın.
- Sedasyondan sonra, marjinal (yanal) kulak damarlarını, tavşanları pentobarbital sodyumun (28 mg/ kg) intravenöz enjeksiyonu ile uyuşturmaya erişim olarak kullanın.
- Yatıştırıcı (kslazine) ve barbitürat (pentobarbital) kombinasyonu kullanın.
- Izleme:
- Yetersiz anestezi veya kalp ve solunum fonksiyonlarının aşırı depresyondan kaçınmak için aşağıdaki parametreleri izleyin. Anestezinin derinliğini değerlendirmek için bir parmak sıkışma testi gerçekleştirin.
- Mukoza zarının pembe olduğundan emin olun. Mavi veya gri tonları hipoksiyi gösterir.
- Kalp atış hızının 120-135 atım/dk arasında olduğundan ve vücut sıcaklığının 36,5 °C'nin altına düşmemesini sağlayın.
- Hayvan yerleşimi:
- Tavşanın gövdesini tıraş edin ve hayvanı ameliyat masasına supine pozisyonda yerleştirin. Tissular hasarı önlemek için trakeotomiden sonra kolayın hızlı bir şekilde bağlanmasına izin vermek için havalandırma sistemini masanın yanına, tavşan kafasının arkasına yerleştirin.
- Kesi ve trakeotomi:
- Cildi diyaframdan boyuna kadar 3-5 cm'lik bir ventral ortanca çizgi kesisi ile parçalara ayrıştırın.
- Çalışma makası ile trakeanın ön 2/3'ü iki kıkırdak halkası arasından kesiği keserek trakeal fibrüz membrandan trakeal kanamayı yerleştirin.
- 5 mm (dış çap) yerleştirin; OD) trakeal lifli membrandan trakeal canül ve dikkatlice sabitlemek için 4-0 ipek dikiş kullanın.
- Kanonun nefes borusuna doğru bükülmemesini sağlamak için nefes borusunun altına tokmak veya cımbız yerleştirin.
- Pozitif basınçlı havalandırma:
- Akciğerler yapay toraksın dışında kaldığı sürece, ameliyat sırasında akciğer çökmesini önlemek için pozitif bir basıncı havalandırmak için küçük bir tür solunum pompası kullanın.
- Trakeotomiden sonra ve toraks açılmadan önce solunum pompasına bağlı trakeal kanondan havalandırmayı başlatın.
- Gelgit hacmini 10 mL/kg olarak ayarlayın.
NOT: Deney kurulumuna ve yapay toraks modeline bağlı olarak, negatif basınç sağlamak için kullanılan aynı havalandırma pompası veya farklı bir havalandırma pompası ile pozitif basınçlı havalandırma sağlayarak hızlı bir yeniden canülasyon sağlar.
- Torakotomi ve eksanguinasyon:
- Torasik boşluğa erişmek için, toraks duvarını açmak için bir neşter veya makas kullanın ve toraksın üst üçte birine kadar medial sternotomi yapın.
- Toraks yarılarını iki retraktörle açık tutun. Birkaç akciğer kapağı genellikle kalbi çevreler.
- Üstün ve alt vena kavayı yerelleştirin ve ipliklerle yönlendirin.
- Hayvanın eksanguinasyonundan önce, sağ ventrikülü tanımlayın ve 1000 UI / kg heparin enjekte edin.
- Enjeksiyondan hemen sonra, üstün ve alt vena kavayı önceden döngülü iplikle lige edin ve exsanguination yapın.
- Kalp-akciğer hasadı:
- Kardiyopulmoner bloğu nazikçe ve hızlı bir şekilde hasat edin. Akciğerleri torakstan çıkarmak için bağ dokusunu ayırmak için doğrudan dijital diseksiyon veya yay makası kullanın.
- Bölgedeki vaskülatın yanı sıra yemek borusunu da parçalara ayrıştırın.
- Medial sternotomiyi trakeal canüle doğru uzatmak için manubrium sterniyi kesin ve her iki taraftaki trakeayı bağlantı dokusundan serbest bırakın.
- Şimdi, trakeayı trakeal canülden yukarıya resect. Trakea ve akciğerlerin dorsal fiksasyonu reseksiyonu reseksiyon edilirken, kavunu kraniokoaudal bir eksende hafifçe yukarı çekin.
- Kanülasyon:
- İzole edilmiş akciğerleri torakstan kaldırın ve bir petri kabının üzerine steril bir gazlı bez üzerine dikkatlice yerleştirin.
- Atelektazi önlemek için, akciğerleri pozitif basınçlı ventilasyon kullanarak 2 cmH2O'ya ayarlanmış pozitif uç-ekspiratuar basınç (PEEP) ile havalandırın.
- Ventrikülleri atriyoventriküler oluk seviyesinde kalpten keserek çıkarın.
- İki ventrikülü açtıktan sonra, tavşan için OD 4.6 mm pulmoner arter kanüllerini pulmoner arterden bir sepetle tanıtın ve tavşan için OD 5.9 mm sol atriyum kanülini sepetle mitral kapaktan sol kulakçığa sokun.
- Kanülleri sabitlemek için pulmoner arterde ve sol kulakçıkta 4-0 ipek dikiş kullanın. Bu yapıların şişkinliğini önlemek için çevre dokuları pulmoner arter ve sol atriyumun ligatürlerine dahil edin.
- Kalan kanı damar yatağından temizlemek için arteriyel kanülden 250 mL salin izotonik çözelti enjekte edin.
3. Perfüzyon tekniği.
- Kurulum:
- İzole edilmiş akciğerleri dikkatlice akciğer odasına yerleştirin.
- Trakeayı odanın kapağındaki dönüştürücüye takın.
- Kanüle edilmiş damarları perfüzyon sistemine bağlayın.
- Hazneyi kapatın ve döner kilit ile sabitleyin.
NOT: Devridaim perfüzyon devresi açık bir venöz rezervuar, peristaltik pompa, ısı eşanjörü ve kabarcık tuzağından oluşur. - Bu noktada, oda kapağını takın ve pozitiften negatif basınç havalandırmasına geçmek için bir stopcock'un üzerine geçin. Akciğerlerin negatif basınç havalandırmasını ve odanın hava geçirmez kapanmasını kontrol etmek için, akciğerin solunum gezisini ve basınç göstergesi üzerindeki oda basıncını inceleyin.
- Akciğerleri 200 mL yapay kansız perfüzat (sığır albümin% 2.5'ini içeren krebs-Ringer bikarbonat tamponu) ile perfüzyon.
- Perfüzyon akışını 3 mL/dk/kg'dan başlatın, ardından 5 dakikalık bir süre boyunca akışı yavaşça 5 mL/dk/kg'a yükseltin. Sonraki 5 dakika boyunca 8 mL/ dk / kg akışa ulaşın ve daha sonra 5 dakikalık bir süre sonra maksimum 10 mL / dk / kg akıya ulaşın. Havanın devreye girmesini önlemeye dikkat edin.
NOT: pH'ı ve perfüzyonun sıcaklığını fizyolojik aralıklarda koruyun (pH 7.4-7.5; sıcaklık, 37 °C-38 °C). pH'ı ayarlamak için NaHCO3 (1N) ekleyin veya karbondioksit akışını artırın. Alternatif olarak, asitleştirmek için HCl (0.1N) kullanın.
- Parametre:
- Önceden belirlenmiş perfüzyon ve havalandırma parametrelerinin gerektiği gibi ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin.
- Akciğerleri 30 bpm frekansta nemlendirilmiş hava, 10 mL/kg gelgit hacmi ve 2 cmH2O'luk bir uç ekspirasyon basıncı (Pe) ile havalandırın.
NOT: Pulmoner arteriyel basınç (0-20 mmHg), oksijenatördeki veya rezervuardaki sıvı seviyesinin pulmoner gövdenin santimetrelerce yüksekliğine, pulmoner venöz basınç ise sol kulakçık üzerindeki basınç denge odasının yüksekliğine karşılık gelir. Her iki değer de değiştirilebilir. Sol atriyum basıncının da 0-20 mmHg olduğunu unutmayın.
- Bölge 3 koşullarının eldei:
- Pulmoner arterde sabitlenmiş kanülün yan portlarına bağlı iki kateter, sol kulakçık ve basınç dönüştürücülerini arteriyel (Pa) ve venöz (Pv) basınçları ölçmek için kullanın.
- Taban çizgisi basınçlarını akciğer hilum seviyesinde ayarlayın (Sıfır referans).
- Deneyleri bölge 3 havalandırma koşullarında gerçekleştirin. Bunu başarmak için, izogravimetrik bir durum ile karakterize bir denge elde etmek için 10-15 dakika bekleyin.
- Bölge 3 koşullarının oluşması için venöz basıncın alveolar basınçtan (Palv) daha yüksek olduğundan ve arteriyel basıncın her ikisinden de (Pa > Pv > Palv) daha yüksek kaldığından emin olun.
- Maksimum sayıda pulmoner damar açmak ve deney sırasında mikrovasküler yatak içeriğini korumak için bölge 3 koşullarını elde etmek için akciğerlerin ağırlığının sabit ve arteriyel ve sol atriyal basınçların stabil olduğundan emin olun.
NOT: Kfc'nin pulmoner ödem göstergesi olarak ölçülmesinin manuel ve otomatik perfüzyon sistemi arasında bir varyasyonu yoktur.
- Elektronik kontrol ve sinyal işleme: Solunum akışının, ağırlık değişimlerinin, mikrovasküler basıncın, gelgit hacminin, vasküler direncin, diğerlerinin yanı sıra, dönüştürücülerden gelen sinyalleri entegre eden ve değerlendirme sisteminde görüntüleyen birden fazla merkezi elektronik üniteye kayıtlı olduğundan emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzole akciğer perfüzyon sistemi biyopsi için organ manipülasyonu, perfüzyondan numune toplanması ve fizyolojik parametrelerin gerçek zamanlı veri toplanmasına izin verir. İzole sistem, metabolik ve enmatik aktiviteden akciğer nakilleri için ödem oluşumu ve koruma dönemlerine kadar farklı fonksiyonları ve akciğer olaylarını içeren birçok hipotezin test edilmesi için kullanılabilir.
Şekil 1, havalandırma sistemi ve hesaplanan veri toplama ile birlikte tamamen monte edilmiş izole edilmiş akciğer perfüzyon sisteminin bir diyagramını görüntüler. Sistemin perfüzyon bileşeni, perfüzyonun izole edilmiş akciğerlerden sürekli akmasını sağlar. Pulmoner arter giriş perfüzyonu sağlamak için kanüle edilirken, perfüzyon çıkışı kalbin sol kulakçıklarının canlanmasıyla sağlanır. Perfüzyon makara pompası kullanılarak geçirilir, böylece perfüzyon ısı eşanjöründen, daha sonra kabarcık tuzağından pulmoner artere ve son olarak akciğer damar yatağına geçer. Sistemin havalandırma bileşeni, havalandırma ortamının pnömokokometrenin distal ucundan doğrudan trakeal akarak akciğerlere akmasını sağlar.
Şekil 2, 4 °C ila 24 saat arasında korunmuş izole bir akciğerde MAO (Şekil 2A) ve 5-HT (Şekil 2B) konsantrasyonlarını göstermektedir. Farklı zamanlarda elde edilen ve ELISA tarafından analiz edilen intravasküler sıvı örneklerinden serotonin ve monoamin oksidaz düzeyleri belirlendi. 5-HT konsantrasyonu 15 dakikalık korumadan sonra zirve yaptı ve sonraki 6 saat boyunca azaldı. Daha sonra perfüzyon düzeyleri istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış göstererek 24. MAO seviyeleri benzer bir davranış gösterdi, 15 dakikalık korumadan sonra zirve yaptı, daha sonra sonraki altı saat boyunca 24. Şekil 3, 4 °C'de izole edilmiş bir akciğer preparatında 24 saat ile ölçülen başlangıç değerinin yüzdesi olarak ifade edilen 5-HT ve MAO salınım oranlarını göstermektedir. Korumanın ilk saatinde, 5-HT seviyeleri MAO'dan daha yüksek yükseldi ve endotel hücreleri ve trombositlerin yanı sıra MAO aracılı katabolizma12 tarafından tekrar yakalandıktan sonra 6 saat içinde azaldı.
Şekil 4'te izole bir akciğer hazırlığında zaman içinde NEP (optik yoğunluklar/mg protein/dk) ve ACE enzimmatik aktivitesi (optik yoğunluklar/mg protein/dk) göstermektedir. NEP aktivitesi (Şekil 4A), NEP substratı olarak N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly kullanılarak spektrofotometrik analiz ve ardından ACE'yi inhibe etmek için enalapril ilavesi ile belirlendi. ACE aktivitesi (Şekil 4B), enalapril ACE substratı olarak kullanılarak spektrofotometrik analiz ile belirlendi ve ardından NEP'i inhibe etmek için fosforamidon ilavesi yapıldı. Her iki çözüm de enalapril içerdiğinden, ACE aktivitesi enalapril13 ile ve enalaprilsiz örnekler arasındaki floresan farkı olarak hesaplandı.
Şekil 5 , tavşan modelinde izole akciğer perfüzyon sisteminde 24 saat boyunca kılcal geçirgenlikte (mKfc) pulmoner korumanın etkisini göstermektedir. Hasat edildikten hemen sonra değerlendirilen bir kontrol grubu (n = 6), 2,8 ± 0,8 (mL/dk/cmH2O/g) standart hata, Buna karşılık, perfüzyonlu akciğer 6 saatte 7.5 ± 1.4 (n = 6), 12 saatte 10.8 ± 2.3 (n = 6) puanlamada ilerleyici bir artış yaşadı ve 24 saat korumadan sonra 16.3 ± 2.5 'e (n = 6) ulaştı13.
Şekil 6 , izole akciğer perfüzyon sisteminin kılcal geçirgenliğinde farklı katkı maddelerinin çeşitli koşullar altında etkisini göstermektedir. Kılcal yatağın kılcal filtrasyon katsayısı (Kfc) yoluyla geçirgenliğini ölçmek için venöz çıkışın kısmi bir tıkanması ile 10 cmH2O ani basınç artışı oluşur. Kfc'yi ölçmek için, sol ventrikülden Krebs rezervuarına giden çıkış tüpü kısmen kenetlendi. Daha sonra, basınç artışı 10 cmH2O'ya ulaştığından emin olmak için kısmi kelepçe 3 dakika boyunca muhafaza edildi. Sıkma serbest bırakıldı ve normal akış devam etti. Bu manevra arteriyel basıncın artışı ve akciğer ağırlığı artışı olarak kaydedildi. Bu son parametre Kfc olarak kabul edilir.
Şekil 1: İzole akciğer perfüzyon sistemi için diyagram. Bu rakam Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akciğer metabolizması ve vasküler geçirgenlikte rol oynayan serotonin (5-HT) ve monoamin oksidaz (MAO) konsantrasyonu. 4°C'den 24 saate kadar korunmuş izole bir akciğerde (A) MAO ve (B) 5-HT konsantrasyonu .
Şekil 3: Serotonin (5-HT) ve monoamin oksidaz (MAO) salınım oranları. 4 °C'de izole bir akciğer preparatında 24 saat boyunca ölçülen başlangıç değerinin yüzdesi olarak ifade edilen 5-HT ve MAO'nun salınım oranları.
Şekil 4: Nötr endopeptidaz (NEP) ve Anjiyotensin dönüştürücü enzimin (ACE) enzimatik aktivitesi. (A) NEP ve (B) ACE'nin 4 °C'den 24 saate kadar korunmuş izole bir akciğerde zaman içinde enzymatic aktivitesi .
Şekil 5: Pulmoner korumanın kılcal geçirgenlikteki etkisi (mKfc). Veriler, tavşan modelinde izole akciğer perfüzyon sisteminde 24 saat boyunca kılcal geçirgenlikte (mKfc) pulmoner korumanın etkisini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kılcal geçirgenlikte farklı katkı maddelerinin etkisi. İzole akciğer perfüzyon sisteminin kılcal geçirgenliğinde farklı katkı maddelerinin çeşitli koşullar altında etkisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, pulmoner fizyoloji araştırmalarında önemli bir teknik olan izole akciğer perfüzyon sisteminin genel bir görünümünü görüntüler. İzole akciğer perfüzyon sistemi, kullanımlarında çok yönlülük sunar ve çok çeşitli hipotezlerin testinde ilgili çeşitli parametrelerin değerlendirilmesine izin verir15. İzole edilmiş bir akciğer sistemi, son on yılda organa özgü değerlendirmelerle ilgisini daha da ortaya koymuştur ve ayrıca mezenkimal kök hücreler16 ve CRISPR / Cas9 genom mühendisliğini içeren yeni tedavilerin bir uzantısı olarak kullanışlılığını genişleten dünya çapında bir araçtır16 ve CRISPR / Cas9 genom mühendisliği17. Mevcut ex vivo akciğer perfüzyon araştırma alanları anti-enflamatuar stratejileri, ventilasyon yaralanma yönetimi ve önlenmesi, anti-ret tedavisi ve anti-pulmoner ödem performansını geniş ölçüde kapsamaktadır15.
Doğru veri rekoltesini garanti etmek için cihazın uygun bir montajı gereklidir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tüm sistem sırasıyla bir havalandırma sistemine bağlı negatif basınçlı ıslak oda ve akciğerlerin solunum ve dolaşım fonksiyonlarını taklit eden bir perfüzyon sisteminden oluşur. Her iki sistem de herhangi bir protokolün ihtiyaçlarına göre uyarlanabilen ölçüm cihazlarının eklenmesini sağlayan bir veri toplama sistemine bağlıdır. Kardiyo-pulmoner bloğun toplanmasının cerrahi süreci, tercihen deneyimli personel tarafından, akciğeri mümkün olduğunca sağlam tutmak için ek doku yaralanmasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır, böylece fizyolojik fonksiyon deney sırasında daha fazla müdahale olmadan devam edebilir. Sistem ayrıca, belirli moleküllerin farklı pulmoner fonksiyonlardaki etkisini (örneğin, pulmoner koruma üzerindeki heparin etkisi) belirlemek için kullanılabilecek gerçek zamanlı perfüzyon numunesi toplanmasına izin verir.
Pulmoner damarlar, yani kılcal damarlar arasında perfüzyon akışının uygun bir dağılımını sağlamak için bölge 3 koşulları temin edilmelidir. Bölge 1 koşulları, arteriyel basıncın alveolar basıncın altına düştüğü, tipik olarak atmosferik basınca yaklaşan bölge olarak tanımlanır. Bu olduğunda, kılcal damarlar düzleştirilerek kan veya perfüzyon akışını imkansız hale getirir. Normal şartlarda arteriyel basınç akış dağılımını garanti etmek için yeterli olduğundan bölge 1 mevcut olamaz. Bununla birlikte, arteriyel basınç düşerse veya alveolar basınç artarsa (pozitif basınç havalandırması sırasında olduğu gibi) bölge 1 koşulları ortaya çıkabilir. Bölge 1 koşulları, gaz değişimi yapamayan, bozulmamış bir havalandırılmış akciğere yol açar. Bölge 2 koşullarında arteriyel basınç alveolar basınçtan daha yüksektir. Bununla birlikte, venöz basınç alveolar basıncın altında kalır ve arteriyel ve alveolar basınçlar arasındaki farkla belirlenen bir perfüzyon akışı ile sonuçlanır. Bu davranış bir Sığırcık direnci kullanılarak modellenebilir. Bölge 3 koşulları arteriyel ve venöz basınçlar arasındaki farka göre belirlenir. Bölge 3'teki perfüzyon akışındaki artış, kılcal damarların dağılması ve maksimum sayıda pulmoner damarın açılmasını şartlandırması nedeniyle meydana gelir.
Sistemin ünitesi yedi modülden oluşur: dinamik sinyalleri (kan basıncı, solunum hava akımı, kasılma kuvveti vb.) izlemek için analog LED çubuk grafik sinyali ile donatılmış iki analog dönüştürücü amplifikatör modülü (TAM-A), yavaş değişen pulsatile sinyalleri izlemek için tasarlanmış dijital sayısal ekranlı bir dijital dönüştürücü amplifikatör modülü (TAM-D); peristaltik pompayı kullanarak izole organ perfüzyonlarının perfüzyon kontrolü için TAM-A ve TAM-D amplifikatörleri ile birlikte çalışan perfüzyon modülü (SCP) için bir servo kontrol cihazı, pompa hızı sabit basınç modunda ayarlanabilir veya SCP aracılığıyla manuel olarak kontrol edilebilir; akciğer ağırlığını ölçen bir ödem dengesi modülü (EBM); pozitif ve negatif basınç havalandırmasını kontrol etmek için bir havalandırma kontrol modülü (VCM) ve derin ilham döngüleri gerçekleştirmek için VCM'yi tetikleyecek şekilde ayarlanabilen bir zamanlayıcı sayaç modülü (TCM).
Akciğer ve solunum sevgisinin yüksek küresel yaygınlığı ve mevcut terapötik seçeneklerin sınırlamaları, terminal akciğer hastalığı olan hastalar için altın standart tedavi olmaya devam ettiği için akciğer nakline daha fazla talep getirmektedir18. Ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi, hem temel hem de klinik araştırmalarda hedeflenen tedavileri test etmek için mükemmel bir platformu temsil eder. Klinik düzeyde, ex-vivo perfüzyon sistemi, vücut dışındaki greft dokusunu değerlendirmek için kullanılabilir, nakilden önce izole organın test edilmesine izin verir ve naklin etkinliği hakkında daha kesin bir prognoz için klinik verilerin toplanmasına yardımcı olur. İzole akciğer perfüzyon sisteminin rasyonel kullanımı, akciğer nakli ameliyatını optimize etmeye yardımcı olabilir ve bu da onları daha güvenli ve daha elektif bir prosedür haline getirebilir. İzole akciğer modeli, mezenkimal kök hücrelerin ve diğer immün aracılı tedavilerin aşılanması gibi ileri tanı ve tedavi tekniklerinin temel araştırmalarında da yararlıdır; birçok rapor , ex-vivo perfüzyon tekniğinin, iskemi-reperfüzyon yaralanmasını ve pulmoner ödemi önlemek için tekniklerin geliştirilmesinde pulmoner koruma konusunda daha fazla araştırma yapmak için bir platform olarak potansiyelini göstermiştir ve organ canlılığını uzatmaktadır15. İzole akciğer modeli ile ilgili bazı sorun giderme adımları ve sınırlamaları, esas olarak lenfatik drenaj sınırlamasının neden olduğu olası ödem üretimi için bu tekniğin kısa kullanım süresi ve tekniğin sistemik etkisidir. Kılcal filtrasyon katsayısı (Kfc) tayini, korunmuş pulmoner dokunun işlevselliğini ölçmek ve zaman içinde ödem boyutunu belirlemek için güvenilir bir kriterdir. Kfc19'un manuel ve otomatik belirlemeleri arasında fark bulunamadı.
İzole akciğer perfüzyon sisteminin kullanımı popülerleşir ve yeni tedaviler klinik manzarayı değiştirirken, ex-vivo perfüzyon tekniği, farklı pulmoner patolojilerde hasta sonuçlarını iyileştirmek ve alıcı güvenliğinden ödün vermeden potansiyel akciğer donörlerinin havuzunu artırmak için seçmeli bir seçim haline gelerek pulmoner koruma ve akciğer naklinde yeni bir dönem vaat ediyor. Covid-19 salgınının ortaya çıkması ve KOAH'ın küresel nüfustaki yaygınlığının18,20 artması, pulmoner fizyoloji, pulmoner koruma ve akciğer nakli ile ilgili daha fazla temel araştırmanın yanı sıra çeviri tıbbına yönelik görüşlere sahip yeni tedavilerin preklinik araştırmalarına duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Ayrıca, ex-vivo tavşan modeli, pulmonoloji alanında, özellikle göğüs cerrahisi ve ECMO ile ilgili sakinleri ve öğrencileri eğitmek için erişilebilir ve pratik bir modeldir. Solunum veya torakopulmoner araştırma protokollerinde yer alan herhangi bir laboratuvar, izole edilmiş akciğer perfüzyon sistemini deneyleri için günlük araçlarının bir parçası olarak düşünmeye teşvik edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar, bu makalenin yazılmasındaki desteği için Doktora Bettina Sommer Cervantes'e ve illüstrasyonlara verdiği destek için Kitzia Elena Lara Safont'a teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
