Summary
Das isolierte Kaninchenlungenpräparat ist ein Goldstandardwerkzeug in der Lungenforschung. Diese Publikation zielt darauf ab, die Technik zu beschreiben, die für die Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen entwickelt wurde, die an der Reaktivität der Atemwege, der Lungenerhaltung und der präklinischen Forschung bei Lungentransplantationen und Lungenödemen beteiligt sind.
Abstract
Das isolierte Lungenperfusionssystem wurde in der Lungenforschung weit verbreitet eingesetzt und trägt dazu bei, das Innenleben der Lunge sowohl mikro- als auch makroskopisch aufzuklären. Diese Technik ist nützlich bei der Charakterisierung der Lungenphysiologie und -pathologie durch Messung von Stoffwechselaktivitäten und Atmungsfunktionen, einschließlich Wechselwirkungen zwischen Kreislaufsubstanzen und den Wirkungen von eingeatmeten oder perfundierten Substanzen, wie bei Arzneimitteltests. Während In-vitro-Methoden das Schneiden und Kultivieren von Geweben beinhalten, ermöglicht das isolierte ex vivo Lungenperfusionssystem die Arbeit mit einem vollständigen funktionellen Organ, das die Untersuchung einer kontinuierlichen physiologischen Funktion ermöglicht und gleichzeitig Beatmung und Perfusion nachbildet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Auswirkungen des Fehlens einer zentralen Innervation und Lymphdrainage noch vollständig bewertet werden müssen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Aufbau des isolierten Lungenapparates zu beschreiben, gefolgt von der chirurgischen Extraktion und Kanülierung von Lunge und Herz aus experimentellen Labortieren, sowie die Perfusionstechnik und Signalverarbeitung von Daten darzustellen. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit der isolierten Lunge liegt zwischen 5-8 h; Während dieser Zeit nimmt die pulmonale Kapillarpermeabilität zu, was zu Ödemen und Lungenverletzungen führt. Die Funktionalität des konservierten Lungengewebes wird durch den Kapillarfiltrationskoeffizienten (Kfc) gemessen, der verwendet wird, um das Ausmaß des Lungenödems im Laufe der Zeit zu bestimmen.
Introduction
Brodie und Dixon beschrieben das ex-vivo-Lungenperfusionssystem erstmals 1903 1. Seitdem ist es zu einem Goldstandardwerkzeug für das Studium der Physiologie, Pharmakologie, Toxikologie und Biochemie der Lunge geworden2,3. Die Technik bietet eine konsistente und reproduzierbare Möglichkeit, die Lebensfähigkeit von Lungentransplantationen zu bewerten und die Wirkung von Entzündungsmediatoren wie Histamin, Arachidonsäure-Metaboliten und Substanz P sowie deren Wechselwirkungen bei Lungenphänomenen wie Bronchokonstriktion, Atelektase und Lungenödem zu bestimmen. Das isolierte Lungensystem war eine Schlüsseltechnik bei der Aufdeckung der wichtigen Rolle der Lunge bei der Eliminierung biogener Amine aus dem allgemeinen Kreislauf4,5. Darüber hinaus wurde das System verwendet, um die Biochemie von Lungentensid6 zu bewerten. In den letzten Jahrzehnten hat sich das ex-vivo-Lungenperfusionssystem zu einer idealen Plattform für die Lungentransplantationsforschung entwickelt7. Im Jahr 2001 beschrieb ein Team um Stig Steen die erste klinische Anwendung des ex-vivo-Lungenperfusionssystems, indem es die Lunge eines 19-jährigen Spenders rekonditionierte, der aufgrund seiner Verletzungen zunächst von Transplantationszentren abgelehnt wurde. Die linke Lunge wurde geerntet und für 65 min perfundiert; Danach wurde es erfolgreich in einen 70-jährigen Mann mit COPD8 transplantiert. Weitere Forschungen zur Lungenrekonditionierung unter Verwendung der ex-vivo-Perfusion führten zur Entwicklung der Toronto-Technik für eine verlängerte Lungenperfusion zur Beurteilung und Behandlung verletzter Spenderlungen9,10. Klinisch hat sich das ex-vivo-Lungenperfusionssystem als sichere Strategie zur Erhöhung der Spenderpools durch Behandlung und Rekonditionierung substandardisierter Spenderlungen erwiesen, wobei sich die Risiken oder Ergebnisse nicht signifikant von den Standardkriterien der Spender unterscheiden10.
Der Hauptvorteil des isolierten Lungenperfusionssystems besteht darin, dass die experimentellen Parameter in einem vollständigen Funktionsorgan ausgewertet werden können, das seine physiologische Funktion unter einem künstlichen Laboraufbau bewahrt. Darüber hinaus ermöglicht es die Messung und Manipulation der pulmonalen mechanischen Beatmung, um die Komponenten der Lungenphysiologie wie Atemwegswiderstand, gesamter Gefäßwiderstand, Gasaustausch und Ödembildung zu analysieren, die bisher nicht genau in vivo an Labortieren gemessen werden können2. Insbesondere kann die Zusammensetzung der Lösung, mit der die Lunge durchblutet wird, vollständig kontrolliert werden, was die Zugabe von Substanzen zur Bewertung ihrer Wirkung in Echtzeit und die Probenentnahme aus der Perfusion für weitere Studien ermöglicht11. Forscher, die mit dem isolierten Lungensystem arbeiten, sollten bedenken, dass die mechanische Beatmung den Zerfall des Lungengewebes verursacht und seine nützliche Zeit verkürzt. Dieser fortschreitende Abfall der mechanischen Parameter kann durch gelegentliche Hyperinflation der Lunge während der Zeit des Experiments signifikant verzögert werden4. Dennoch kann die Zubereitung in der Regel nicht länger als acht Stunden dauern. Eine weitere Überlegung für das ex-vivo-Lungenperfusionssystem ist das Fehlen einer zentralen Nervenregulation und Lymphdrainage. Die Auswirkungen ihres Fehlens sind noch nicht vollständig verstanden und könnten in bestimmten Experimenten möglicherweise eine Quelle der Verzerrung sein.
Die isolierte Lungenperfusionssystemtechnik kann im Kaninchenmodell mit einem hohen Grad an Konsistenz und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Diese Arbeit beschreibt die technischen und chirurgischen Verfahren für die Implementierung der ex-vivo isolierten Lungenperfusionstechnik, wie sie für das Kaninchenmodell am Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias in Mexiko-Stadt entwickelt wurde, um die Erkenntnisse zu teilen und einen klaren Leitfaden für Schlüsselschritte bei der Anwendung dieses experimentellen Modells zu geben.
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Protocol
Das isolierte Perfusionssystem im Kaninchenmodell wurde im Bronchial Hyperresponsiveness Laboratory am Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias weit verbreitet eingesetzt. Das Protokoll umfasst neuseeländische Kaninchen mit einem ungefähren Gewicht von 2,5-3 kg. Alle Tiere wurden unter Standard-Vivariumsbedingungen und Ad-libitum-Fütterung in Übereinstimmung mit den offiziellen mexikanischen Richtlinien für Labortiere (NOM 062-ZOO-1999) und unter dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, 2011) gehalten. Alle in diesem Protokoll vorgestellten Tierverfahren und Tierpflegemethoden wurden zuvor von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias genehmigt.
HINWEIS: Die Vorbereitung des isolierten Lungenperfusionssystems beinhaltet den absichtlichen Tod eines Tieres unter Narkose und durch Euthanasie.
1. Ausrüstung und Vorbereitung der Apparate.
- Ausstattungsanordnung:
- Stellen Sie einen Operationstisch mit der Größe entsprechend dem Gewicht des Kaninchens auf.
- Montieren Sie die Abdeckung des künstlichen Thorax auf der Stahlsäule mit der Glaskammer darunter und dem Ventilator mit einer Rollenpumpe an den Seiten.
- Stellen Sie sicher, dass die Abdeckung leicht geneigt ist, die Trachealkanüle in Einer Linie mit der Luftröhre zu haben, um eine schnellere Verbindung zu ermöglichen.
- Künstlicher Thorax:
HINWEIS: Es ist ein wesentlicher Bestandteil des Systems. Es besteht aus einer wasserummantelten Glaskammer, die durch eine spezielle Abdeckung versiegelt ist. Die Abdeckung fungiert als Orgelhalter mit den Anschlüssen, um die Luftröhre und die darin eingebetteten Gefäße zu kanülieren.- Richten Sie einen Venturistrahl ein, der mit Druckluft betrieben wird, um den Unterdruck im künstlichen Thorax zu erzeugen.
HINWEIS: Das Beatmungssteuerungsmodul (VCM) ermöglicht die getrennte Einstellung von inspiratorischem und endexspiratorischem Druck sowie der Atemfrequenz und dem Verhältnis von inspiratorischer Dauer zu Gesamtzyklusdauer.
- Richten Sie einen Venturistrahl ein, der mit Druckluft betrieben wird, um den Unterdruck im künstlichen Thorax zu erzeugen.
- Apparat:
- Stellen Sie sicher, dass eine normal funktionierende Vorrichtung aus einer Hauptstahlsäule besteht, die auf einer Grundplatte montiert ist, die den künstlichen Thorax hält, wobei sich der Pneumotachometer und der Gewichtsaufnehmer darüber und hinter der Vorwärmspule mit einem Blasenfänger befinden.
- Schließen Sie einen Differenzdruckaufnehmer an den Pneumotachometer und einen weiteren an den Kammerdruck an. Stellen Sie ein anderes Paar Druckmessumformer hinter dem Thorax ein, um perfusion und venöse Drücke zu messen.
- Verbinden Sie den Wechselschaft unterhalb des Oxygenators mit einer Ebenenelektrode und dem Lüftungssystem neben dem Gerät.
2. Chirurgische Extraktion des Herz-Lungen-Blocks.
- Anästhesie:
- Verwenden Sie eine Kombination aus einem Beruhigungsmittel (Xylazin) und einem Barbiturat (Pentobarbital).
HINWEIS: Verschiedene Anästhesiecocktails können ohne Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse verwendet werden. - Zuerst sedieren Sie die gesunden neuseeländischen Kaninchen mit einer einzigen intramuskulären Injektion von Xylazinhydrochlorid (3-5 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die Kaninchen ruhig und entspannt bleiben, um nach einigen Minuten der Injektion eine weitere Manipulation zu ermöglichen.
- Verwenden Sie nach der Sedierung die marginalen (lateralen) Ohrvenen als Zugang, um die Kaninchen mit einer intravenösen Injektion von Pentobarbital-Natrium (28 mg / kg) zu betäuben.
- Verwenden Sie eine Kombination aus einem Beruhigungsmittel (Xylazin) und einem Barbiturat (Pentobarbital).
- Überwachung:
- Um eine unzureichende Anästhesie oder eine übermäßige Depression der Herz- und Atmungsfunktionen zu vermeiden, überwachen Sie die folgenden Parameter. Um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen, führen Sie einen Zehenquetschtest durch.
- Stellen Sie sicher, dass die Schleimhaut rosa ist. Blau- oder Grautöne weisen auf Hypoxie hin.
- Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz zwischen 120-135 Schlägen/ min liegt und dass die Körpertemperatur nicht unter 36,5 ° C fällt.
- Unterbringung der Tiere:
- Rasieren Sie den Oberkörper des Kaninchens und legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Platzieren Sie das Belüftungssystem in der Nähe des Tisches hinter dem Kopf des Kaninchens, damit die Kanülen nach der Tracheotomie schnell angeschlossen werden können, um tissuläre Schäden zu vermeiden.
- Inzision und Tracheotomie:
- Sezieren Sie die Haut mit einem ventralen Medianlinienschnitt von 3-5 cm vom Zwerchfell bis zum Hals.
- Schneiden Sie mit der Operationsschere die vorderen 2/3 der Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen, um die Trachealkanüle durch die Trachealfasermembran einzuführen.
- Setzen Sie einen 5 mm (Außendurchmesser; OD) Trachealkanüle durch die Trachealfasermembran und verwenden Sie eine 4-0 Seidennaht, um sie vorsichtig zu fixieren.
- Legen Sie entweder eine Pinzette oder eine Pinzette unter die Luftröhre, um sicherzustellen, dass sich die Kanüle nicht gegen die Luftröhre beugt.
- Überdrucklüftung:
- Solange die Lunge außerhalb des künstlichen Thorax bleibt, verwenden Sie eine kleine Artenatmungspumpe, um einen positiven Druck zu belüften, um einen Lungenkollaps während der Operation zu vermeiden.
- Beginnen Sie die Beatmung durch die an die Atempumpe angeschlossene Trachealkanüle schnell nach der Tracheotomie und vor dem Öffnen des Thorax.
- Stellen Sie das Tidalvolumen auf 10 ml/kg ein.
HINWEIS: Je nach Versuchsaufbau und künstlichem Thoraxmodell ist eine Überdruckbeatmung entweder mit derselben Beatmungspumpe, die für die Unterdruckerzeugung verwendet wird, oder mit einer anderen Belüftungspumpe, die eine schnelle Rekannulation gewährleistet, vorgesehen.
- Thorakotomie und Exsanguination:
- Um an die Brusthöhle zu gelangen, öffnen Sie mit einem Skalpell oder einer Schere die Thoraxwand und führen Sie eine mediale Sternotomie bis zum oberen Drittel des Thorax durch.
- Halten Sie die Thoraxhälften mit zwei Retraktoren offen. Mehrere Lungenklappen umgeben normalerweise das Herz.
- Lokalisieren Sie die obere und untere Hohlvene und verweisen Sie sie mit Fäden.
- Identifizieren Sie vor der Exsanguination des Tieres den rechten Ventrikel und injizieren Sie 1000 U / kg Heparin.
- Unmittelbar nach der Injektion die obere und untere Hohlvene mit dem vorgeschlungenen Faden ligatieren und exsanguination durchführen.
- Herz-Lungen-Ernte:
- Ernten Sie den Herz-Lungen-Block sanft und schnell. Verwenden Sie eine direkte digitale Dissektion oder federnde Schere, um das Bindegewebe zu trennen, um die Lunge vom Thorax zu entfernen.
- Sezieren Sie das Gefäßsystem in der Umgebung sowie die Speiseröhre.
- Schneiden Sie durch das Manubrium sterni, um die mediale Sternotomie in Richtung der Trachealkanüle zu verlängern und die Luftröhre auf beiden Seiten aus dem Bindegewebe freizusetzen.
- Resezieren Sie nun die Luftröhre über der Trachealkanüle. Ziehen Sie die Kanüle vorsichtig in einer kraniokaudalen Achse nach oben, während die dorsale Fixierung der Luftröhre und der Lunge reseziert wird.
- Kanülierung:
- Heben Sie die isolierten Lungen aus dem Brustkorb und legen Sie sie vorsichtig über eine sterile Gaze auf eine Petrischale.
- Um eine Atelektase zu verhindern, belüften Sie die Lunge mit einer Überdruckbeatmung mit einem positiven Endexspirationsdruck (PEEP) von 2 cmH2O.
- Entfernen Sie die Ventrikel, indem Sie sie auf Höhe der atrioventrikulären Rille vom Herzen abschneiden.
- Nach dem Öffnen der beiden Ventrikel die OD 4,6 mm Lungenarterienkanüle für das Kaninchen mit einem Korb durch die Lungenarterie einführen und die OD 5,9 mm linke Vorhofkanüle für das Kaninchen mit dem Korb durch die Mitralklappe in den linken Vorhof einführen.
- Verwenden Sie eine 4-0 Seidennaht in der Lungenarterie und im linken Vorhof, um die Kanülen zu fixieren. Schließen Sie das umgebende Gewebe in die Ligaturen der Lungenarterie und des linken Vorhofs ein, um die Dehnung dieser Strukturen zu vermeiden.
- Injizieren Sie 250 ml salzhaltige isotonische Lösung durch die arteriellen Kanülen, um das verbleibende Blut aus dem Gefäßbett zu spülen.
3. Perfusionstechnik.
- Einrichtung:
- Legen Sie die isolierten Lungen vorsichtig in die Lungenkammer.
- Befestigen Sie die Luftröhre am Wandler auf dem Deckel der Kammer.
- Verbinden Sie die kanülierten Gefäße mit dem Perfusionssystem.
- Schließen Sie die Kammer und sichern Sie sie mit dem Drehverschluss.
HINWEIS: Der rezirkulierende Perfusionskreislauf besteht aus einem offenen venösen Reservoir, einer Peristaltikpumpe, einem Wärmetauscher und einer Blasenfalle. - Befestigen Sie an dieser Stelle den Kammerdeckel und schalten Sie einen Absperrhahn um, um von Über- auf Unterdruckbelüftung umzuschalten. Um die Unterdruckbeatmung der Lunge und den luftdichten Verschluss der Kammer zu überprüfen, überprüfen Sie die Atemauslenkung der Lunge und den Kammerdruck auf dem Manometer.
- Die Lunge wird mit 200 ml künstlichem, blutfreiem Perfusat (einem Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer, der 2,5% Rinderalbumin enthält) perfundiert.
- Beginnen Sie den Perfusatfluss bei 3 ml /min/kg und erhöhen Sie den Durchfluss dann langsam über einen Zeitraum von 5 Minuten auf 5 ml/min/kg. Erreichen Sie einen Durchfluss von 8 ml / min / kg in den nächsten 5 minuten und erreichen Sie dann nach einer weiteren 5-minütigen Periode einen maximalen Fluss von 10 ml / min / kg. Achten Sie darauf, dass keine Luft in den Kreislauf gelangt.
HINWEIS: Halten Sie den pH-Wert und die Temperatur des Perfusats innerhalb physiologischer Bereiche (pH 7,4-7,5; Temperatur, 37 °C-38 °C). Um den pH-Wert einzustellen, fügen Sie NaHCO3 (1N) hinzu oder erhöhen Sie den Kohlendioxidfluss. Alternativ können Sie HCl (0,1N) zum Ansäuern verwenden.
- Parameter:
- Prüfen Sie, ob die vorgegebenen Perfusions- und Beatmungsparameter bedarfsgerecht eingestellt sind.
- Belüften Sie die Lunge mit befeuchteter Luft mit einer Frequenz von 30 bpm, einem Tidalvolumen von 10 ml / kg und einem endexspiratorischen Druck (Pe) von 2 cmH2O.
HINWEIS: Der pulmonale arterielle Druck (0-20 mmHg) entspricht der Höhe des Flüssigkeitsspiegels im Oxygenator oder Reservoir in Zentimetern über dem Lungenstamm, während der pulmonale Venendruck der Höhe der Druckgleichgewichtskammer über dem linken Vorhof entspricht. Beide Werte können geändert werden. Beachten Sie, dass der Druck im linken Vorhof ebenfalls 0-20 mmHg beträgt.
- Erreichen der Bedingungen der Zone 3:
- Verwenden Sie die beiden Katheter, die mit den Seitenöffnungen der Kanülen verbunden sind, die in der Lungenarterie, im linken Vorhof und in den Druckmessumformern befestigt sind, um den arteriellen (Pa) und venösen (Pv) Druck zu messen.
- Stellen Sie den Basisdruck auf Höhe des Lungenhums ein (Nullreferenz).
- Führen Sie die Experimente unter Lüftungsbedingungen der Zone 3 durch. Um dies zu erreichen, warten Sie 10-15 Minuten, um ein Gleichgewicht zu erhalten, das durch einen isogravimetrischen Zustand gekennzeichnet ist.
- Stellen Sie sicher, dass der Venendruck höher ist als der Alveolardruck (Palv) und der arterielle Druck höher bleibt als beide (Pa > Pv > Palv), damit Zone 3-Bedingungen auftreten.
- Stellen Sie sicher, dass das Gewicht der Lunge konstant bleibt und der arterielle und linke Vorhofdruck stabil ist, um Zone 3-Bedingungen zu erreichen, um eine maximale Anzahl von Lungengefäßen zu öffnen und den mikrovaskulären Bettinhalt während des Experiments aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Die Messung von Kfc als Indikator für ein Lungenödem weist keine Variation zwischen einem manuellen und einem automatischen Perfusionssystem auf.
- Elektronische Steuerung und Signalverarbeitung: Stellen Sie sicher, dass der Atemfluss, Gewichtsänderungen, der Mikrovaskulardruck, das Tidalvolumen und der Gefäßwiderstand unter anderem auf einer mehreren zentralen Elektronikeinheit registriert werden, die signale von den Wandlern integriert und auf dem Auswertesystem anzeigt.
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Representative Results
Das isolierte Lungenperfusionssystem ermöglicht die Organmanipulation für die Biopsie, die Probenentnahme aus der Perfusion und die Echtzeit-Datenerfassung physiologischer Parameter. Das isolierte System kann verwendet werden, um viele Hypothesen mit verschiedenen Funktionen und Lungenphänomenen zu testen, von der metabolischen und enzymatischen Aktivität bis hin zur Ödembildung und Konservierungszeiten für Lungentransplantationen.
Abbildung 1 zeigt ein Diagramm des vollständig montierten isolierten Lungenperfusionssystems zusammen mit dem Beatmungssystem und der berechneten Datenerfassung. Die Perfusionskomponente des Systems sorgt dafür, dass das Perfusat ständig durch die isolierte Lunge fließt. Die Lungenarterie wird kanüliert, um eine Zuflussperfusion zu gewährleisten, während der Perfusatabfluss durch Kanülierung des linken Vorhofs des Herzens gewährleistet wird. Das Perfusat wird mit der Rollenpumpe geleitet, so dass Perfusat durch den Wärmetauscher, dann durch die Blasenfalle in die Lungenarterie und schließlich in das Lungengefäßbett gelangt. Die Beatmungskomponente des Systems lässt das Beatmungsmedium konstant über das distale Ende des Pneumotachometers direkt über die Trachealkanüle in die Lunge fließen.
Abbildung 2 zeigt die Konzentration von MAO (Abbildung 2A) und 5-HT (Abbildung 2B) in einer isolierten Lunge, die bei 4 °C bis 24 h konserviert ist. Die Serotonin- und Monoaminoxidasespiegel wurden aus intravaskulären Flüssigkeitsproben bestimmt, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und mittels ELISA analysiert wurden. Die 5-HT-Konzentration erreichte nach 15 Minuten Konservierung ihren Höhepunkt und nahm dann während der nächsten 6 h ab. Danach zeigten die Perfusionswerte bis zur 24. Stunde einen nicht statistisch signifikanten Anstieg. Die MAO-Spiegel zeigten ein ähnliches Verhalten, erreichten nach 15 Minuten Konservierung ihren Höhepunkt und nahmen dann in den nächsten sechs Stunden bis zur 24. Stunde ab12. Abbildung 3 zeigt 5-HT- und MAO-Freisetzungsraten, ausgedrückt als Prozentsatz des Anfangswertes, gemessen über 24 h in einem isolierten Lungenpräparat bei 4 °C. Während der ersten Stunde der Konservierung stiegen die 5-HT-Spiegel höher als die von MAO und nahmen innerhalb von 6 h ab, nachdem sie von Endothelzellen und Blutplättchen sowie MAO-vermitteltem Katabolismus zurückerobert worden waren12.
Abbildung 4 zeigt NEP (optische Dichten/mg Protein/min) und ACE-Enzymaktivität (optische Dichten/mg Protein/min) im Laufe der Zeit in einem isolierten Lungenpräparat. Die NEP-Aktivität (Abbildung 4A) wurde durch spektralphotometrische Analyse unter Verwendung von N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly als NEP-Substrat bestimmt, gefolgt von einer Enalapril-Zugabe zur Hemmung von ACE. Die ACE-Aktivität (Abbildung 4B) wurde durch spektralphotometrische Analyse unter Verwendung von Enalapril als ACE-Substrat bestimmt, gefolgt von phosphoramidon zur Hemmung der NEP. Da beide Lösungen Enalapril enthielten, wurde die ACE-Aktivität als Differenz in der Fluoreszenz zwischen Proben mit und ohne Enalapril13 berechnet.
Abbildung 5 zeigt die Wirkung der Lungenerhaltung bei der Kapillarpermeabilität (mKfc) über einen Zeitraum von 24 h im isolierten Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell. Eine Kontrollgruppe (n = 6), die unmittelbar nach der Ernte beurteilt wurde, wies einen mKfc-Standardfehler von 2,8 ± 0,8 (ml/min/cmH2O/g) auf, im Gegensatz dazu erlitt die perfundierte Lunge einen progressiven Anstieg des mKfc-Scores 7,5 ± 1,4 (n = 6) bei 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) bei 12 h und erreichte nach 24 h Konservierung 16,3 ± 2,5 (n = 6).
Abbildung 6 zeigt den Einfluss verschiedener Additive auf die Kapillarpermeabilität des isolierten Lungenperfusionssystems unter verschiedenen Bedingungen. Ein plötzlicher Druckanstieg von 10 cmH2O wird durch eine partielle Obstruktion des venösen Abflusses erzeugt, um die Permeabilität des Kapillarbettes durch den Kapillarfiltrationskoeffizienten (Kfc) zu messen. Zur Messung des Kfc wurde der Ausflussschlauch, der aus dem linken Ventrikel zum Krebsreservoir führt, teilweise eingeklemmt. Dann wurde die Teilklemme für 3 min aufrechterhalten, um sicherzustellen, dass der Druckanstieg 10 cmH2O erreichte. Die Klemmung wurde gelöst und der normale Fluss setzte sich fort. Dieses Manöver wurde als Inkrement des arteriellen Drucks und als Lungengewichtsvergrößerung registriert. Dieser letzte Parameter wird als Kfc betrachtet.
Abbildung 1: Diagramm für das isolierte Lungenperfusionssystem. Diese Figur wurde von Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Konzentration von Serotonin (5-HT) und Monoaminoxidase (MAO), die am Lungenstoffwechsel und an der Gefäßpermeabilität beteiligt sind. Die Konzentration von (A) MAO und (B) 5-HT in einer isolierten Lunge, die bei 4°C bis 24 h konserviert ist.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Freisetzungsraten von Serotonin (5-HT) und Monoaminoxidase (MAO). Die Freisetzungsraten von 5-HT und MAO, ausgedrückt als Prozentsatz des Ausgangswertes, gemessen über 24 h in einem isolierten Lungenpräparat bei 4 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Enzymatische Aktivität der neutralen Endopeptidase (NEP) und des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE). Enzymatische Aktivität von (A) NEP und (B) ACE im Laufe der Zeit in einer isolierten Lunge, die bei 4 °C bis 24 h konserviert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Wirkung der Lungenerhaltung bei Kapillarpermeabilität (mKfc). Die Daten zeigen die Wirkung der Lungenerhaltung bei der Kapillarpermeabilität (mKfc) über einen Zeitraum von 24 h im isolierten Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Einfluss verschiedener Additive auf die Kapillarpermeabilität. Die Wirkung verschiedener Additive auf die Kapillarpermeabilität des isolierten Lungenperfusionssystems unter verschiedenen Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Arbeit zeigt einen allgemeinen Überblick über das isolierte Lungenperfusionssystem, eine wesentliche Technik in der lungenphysiologischen Forschung. Das isolierte Lungenperfusionssystem bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit in seiner Anwendung und ermöglicht die Bewertung mehrerer Parameter, die für die Prüfung einer Vielzahl von Hypothesen relevant sind15. Ein isoliertes Lungensystem ist ein weltweit präsentes Werkzeug, das in den letzten zehn Jahren seine Relevanz für organspezifische Bewertungen weiter gefestigt und auch seine Nützlichkeit als Erweiterung modernster Technologien und neuartiger Therapien unter anderem mit mesenchymalen Stammzellen16 und CRISPR/Cas9 Genome Engineering17 ausgebaut hat. Die aktuellen Ex-vivo-Lungenperfusionsforschungsgebiete umfassen im Großen und Ganzen entzündungshemmende Strategien, Das Management und die Prävention von Beatmungsverletzungen, die Anti-Abstoßungsbehandlung und die Leistung von antipulmonalen Ödemen15.
Eine ordnungsgemäße Montage des Geräts ist erforderlich, um eine korrekte Datenerfassung zu gewährleisten. Wie in Abbildung 1 gezeigt, besteht das gesamte System aus einer Unterdruck-Nasskammer, die an ein Beatmungssystem angeschlossen ist, und einem Perfusionssystem, das die Atmungs- bzw. Kreislauffunktionen der Lunge nachahmt. Beide Systeme sind mit einem Datenerfassungssystem verbunden, das das Hinzufügen von Messgeräten ermöglicht, die auf die Bedürfnisse jedes Protokolls zugeschnitten werden können. Der chirurgische Prozess der Ernte des Herz-Lungen-Blocks sollte schnell durchgeführt werden, vorzugsweise von erfahrenem Personal, um zusätzliche Gewebeverletzungen zu vermeiden, um die Lunge so intakt wie möglich zu halten, damit die physiologische Funktion während des Experiments ohne weitere Störungen fortgesetzt werden kann. Das System ermöglicht auch die Sammlung von Perfusionsproben in Echtzeit, mit denen die Wirkung bestimmter Moleküle in verschiedenen Lungenfunktionen bestimmt werden kann (z. B. Heparineffekt auf die Lungenkonservierung).
Um eine richtige Verteilung des Perfusionsflusses zwischen den Lungengefäßen, nämlich den Kapillaren, zu erreichen, sollten Bedingungen der Zone 3 beschafft werden. Zone 1-Bedingungen sind definiert als der Bereich, in dem der arterielle Druck unter den Alveolardruck fällt und sich typischerweise dem atmosphärischen Druck nähert. Wenn dies geschieht, flachen die Kapillaren ab, wodurch blut- oder perfusionsfluss unmöglich wird. Unter normalen Umständen kann Zone 1 nicht existieren, da der arterielle Druck ausreicht, um die Flussverteilung zu gewährleisten. Zone-1-Bedingungen können jedoch auftreten, wenn der arterielle Druck abfällt oder der Alveolardruck ansteigt (wie dies bei der Überdruckbeatmung der Fall ist). Zone-1-Bedingungen führen zu einer nicht durchbluteten belüfteten Lunge, die nicht in der Lage ist, einen Gasaustausch durchzuführen. Unter Bedingungen der Zone 2 ist der arterielle Druck höher als der Alveolardruck. Der venöse Druck bleibt jedoch unter dem Alveolardruck, was zu einem Perfusionsfluss führt, der durch die Differenz zwischen arteriellem und alveolärem Druck bestimmt wird. Dieses Verhalten kann mit einem Starling-Widerstand modelliert werden. Die Bedingungen der Zone 3 werden durch die Differenz zwischen arteriellem und venösem Druck bestimmt. Die Zunahme des Perfusionsflusses in Zone 3 tritt auf, weil sich die Kapillaren aufdehnen und die Öffnung einer maximalen Anzahl von Lungengefäßen konditionieren.
Die Einheit des Systems besteht aus sieben Modulen: zwei analogen Wandlerverstärkermodulen (TAM-A), die mit einem analogen LED-Balkendiagrammsignal zur Überwachung dynamischer Signale (Blutdruck, Atemluftstrom, Kontraktionskraft usw.) ausgestattet sind, einem digitalen Wandlerverstärkermodul (TAM-D) mit einer digitalen numerischen Anzeige zur Überwachung sich langsam ändernder Pulsationssignale; ein Servoregler für perfusionsmodul (SCP), der zusammen mit TAM-A- und TAM-D-Verstärkern zur Perfusionskontrolle isolierter Organperfusionen mit der Peristaltikpumpe arbeitet, kann die Pumpendrehzahl im Konstantdruckmodus eingestellt oder manuell über den SCP gesteuert werden; ein Ödem-Balance-Modul (EBM), das das Lungengewicht misst; ein Lüftungssteuerungsmodul (VCM) zur Steuerung der Über- und Unterdrucklüftung und ein Timerzählermodul (TCM), das so eingestellt werden kann, dass der VCM tiefe Inspirationszyklen durchführt.
Die weltweit hohe Prävalenz von Lungen- und Atemwegserkrankungen und die Einschränkungen der derzeitigen therapeutischen Optionen zwingen zu einer größeren Nachfrage nach Lungentransplantationen, da sie nach wie vor die Goldstandardbehandlung für Patienten mit terminaler Lungenerkrankung sind18. Das ex-vivo-Lungenperfusionssystem stellt eine hervorragende Plattform dar, um zielgerichtete Therapien sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Forschung zu testen. Auf klinischer Ebene kann das Ex-vivo-Perfusionssystem verwendet werden, um Transplantatgewebe außerhalb des Körpers zu bewerten, so dass das isolierte Organ vor der Transplantation getestet werden kann, um klinische Daten für eine genauere Prognose der Wirksamkeit des Transplantats zu sammeln. Der rationelle Einsatz des isolierten Lungenperfusionssystems könnte dazu beitragen, die Lungentransplantation zu optimieren und sie zu einem sichereren und elektiveren Verfahren zu machen. Das isolierte Lungenmodell ist auch nützlich in der Grundlagenforschung fortgeschrittener Diagnose- und Therapietechniken wie der Instillation von mesenchymalen Stammzellen und anderen immunvermittelten Therapien; Viele Berichte haben das Potenzial der Ex-vivo-Perfusionstechnik als Plattform für weitere Forschungen zur Lungenerhaltigung bei der Entwicklung von Techniken zur Vermeidung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen und Lungenödemen gezeigt, die die Lebensfähigkeit der Organe verlängern15. Einige Schritte zur Fehlerbehebung und Einschränkungen, die mit dem isolierten Lungenmodell verbunden sind, sind hauptsächlich die kurze verfügbare Zeit dieser Technik für eine mögliche Ödembildung, die durch lymphatische Drainrestriktion induziert wird, sowie die systemische Wirkung der Technik. Die Bestimmung des Kapillarfiltrationskoeffizienten (Kfc) ist ein zuverlässiges Kriterium, um die Funktionalität des konservierten Lungengewebes zu messen und das Ausmaß des Ödems im Laufe der Zeit zu bestimmen. Es wurde kein Unterschied zwischen den manuellen und automatischen Bestimmungen von Kfc19 gefunden.
Da die Verwendung des isolierten Lungenperfusionssystems populär wird und neue Therapien die klinische Landschaft verändern, wird die Ex-vivo-Perfusionstechnik zu einer elektiven Wahl, um die Patientenergebnisse bei verschiedenen Lungenpathologien zu verbessern und den Pool potenzieller Lungenspender zu erhöhen, ohne die Sicherheit der Empfänger zu beeinträchtigen, was eine neue Ära in der Lungenkonservierung und Lungentransplantation verspricht. Das Aufkommen der Covid-19-Pandemie und die Zunahme der COPD-Prävalenz18,20 in der Weltbevölkerung unterstreicht die Notwendigkeit weiterer Grundlagenforschung in den Bereichen Lungenphysiologie, Lungenerhaltung und Lungentransplantation sowie präklinische Forschung zu neuartigen Therapien mit Blick auf die translationale Medizin. Darüber hinaus ist das ex-vivo-Kaninchenmodell ein zugängliches und praktisches Modell zur Ausbildung von Assistenzärzten und Studenten im Bereich der Pneumologie, insbesondere derjenigen, die sich mit Thoraxchirurgie und ECMO befassen. Jedes Labor, das an respiratorischen oder thorakopulmonalen Forschungsprotokollen beteiligt ist, wird ermutigt, das isolierte Lungenperfusionssystem als Teil seiner täglichen Werkzeuge für seine Experimente zu betrachten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Ph.D. Bettina Sommer Cervantes für ihre Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts und Kitzia Elena Lara Safont für ihre Unterstützung bei den Illustrationen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
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