Summary
Den isolerte kanin lungepreparatet er et gullstandardverktøy i lungeforskning. Denne publikasjonen tar sikte på å beskrive teknikken som utviklet for studiet av fysiologiske og patologiske mekanismer involvert i luftveisreaktivitet, lungebevaring og preklinisk forskning innen lungetransplantasjon og lungeødem.
Abstract
Det isolerte lungeperfusjonssystemet har vært mye brukt i lungeforskning, noe som bidrar til å belyse lungenes indre arbeid, både mikro- og makroskopisk. Denne teknikken er nyttig i karakteriseringen av lungefysiologi og patologi ved å måle metabolske aktiviteter og åndedrettsfunksjoner, inkludert interaksjoner mellom sirkulasjonsstoffer og effekten av inhalerte eller perfunderte stoffer, som i legemiddeltesting. Mens in vitro-metoder involverer kutting og dyrking av vev, gjør det isolerte ex vivo lungeperfusjonssystemet det mulig å jobbe med et komplett funksjonelt organ som gjør det mulig å studere en kontinuerlig fysiologisk funksjon mens du gjenskaper ventilasjon og perfusjon. Det skal imidlertid bemerkes at effekten av fraværet av sentral innervering og lymfatisk drenering fortsatt må vurderes fullt ut. Denne protokollen tar sikte på å beskrive monteringen av det isolerte lungeapparatet, etterfulgt av kirurgisk ekstraksjon og kannkulasjon av lunger og hjerte fra eksperimentelle laboratoriedyr, samt å vise perfusjonsteknikk og signalbehandling av data. Den gjennomsnittlige levedyktigheten til den isolerte lungen varierer mellom 5-8 timer; I løpet av denne perioden øker lungekapillær permeabilitet, forårsaker ødem og lungeskade. Funksjonaliteten til bevart lungevev måles av kapillærfiltreringskoeffisienten (Kfc), som brukes til å bestemme omfanget av lungeødem gjennom tidene.
Introduction
Brodie og Dixon beskrev først ex-vivo lungeperfusjonssystemet i 1903 1. Siden da har det blitt et gullstandardverktøy for å studere lungenes fysiologi, farmakologi, toksikologi og biokjemi2,3. Teknikken gir en konsistent og reproduserbar måte å evaluere levedyktigheten av lungetransplantasjoner, og å bestemme effekten av inflammatoriske mediatorer som histamin, arakidonsyremetabolitter og substans P, blant andre, samt deres interaksjoner under lungefenomener som bronkokonstriksjon, atelektase og lungeødem. Det isolerte lungesystemet har vært en nøkkelteknikk for å avdekke lungenes viktige rolle i eliminering av biogene aminer fra generell sirkulasjon4,5. I tillegg har systemet blitt brukt til å evaluere biokjemien til lungeoveraktivt middel6. I løpet av de siste tiårene har ex-vivo lungeperfusjonssystemet blitt en ideell plattform for lungetransplantasjonsforskning7. I 2001 beskrev et team ledet av Stig Steen den første kliniske anvendelsen av ex-vivo lungeperfusjonssystemet ved å bruke det til å rekondisjonere lungene til en 19 år gammel donor, som først ble avvist av transplantasjonssentre på grunn av skadene. Venstre lunge ble høstet og perfundert i 65 min; Etterpå ble det vellykket transplantert inn i en 70 år gammel mann med KOLS8. Videre forskning på lunge rekondisjonering ved hjelp av ex-vivo perfusjon førte til utvikling av Toronto-teknikken for utvidet lungeperfusjon for å vurdere og behandle skadede donor lunger9,10. Klinisk har ex-vivo lungeperfusjonssystemet vist seg å være en sikker strategi for å øke donorpoolene ved å behandle og rekondisjonere substandard donor lunger, og presenterer ingen signifikant forskjell i risiko eller utfall mot standardkriterier donorer10.
Den største fordelen med det isolerte lungeperfusjonssystemet er at de eksperimentelle parametrene kan evalueres i et komplett funksjonelt organ som bevarer sin fysiologiske funksjon under et kunstig laboratorieoppsett. Videre tillater det måling og manipulering av lungemekanisk ventilasjon for å analysere komponentene i lungefysiologi som luftveismotstand, total vaskulær motstand, gassutveksling og ødemdannelse, som til dags dato ikke kan måles nøyaktig in vivo på laboratoriedyr2. Spesielt kan sammensetningen av løsningen som lungen er perfundert, kontrolleres fullt ut, slik at tilsetning av stoffer kan evaluere effektene i sanntid og prøveinnsamling fra perfusjon for videre studier11. Forskere som arbeider med det isolerte lungesystemet bør huske på at mekanisk ventilasjon forårsaker forfall av lungevevet som forkorter sin brukne tid. Dette progressive fallet i mekaniske parametere kan bli betydelig forsinket ved å hyperinflisere lungene av og til i løpet av eksperimentets tid4. Likevel kan preparatet vanligvis ikke vare mer enn åtte timer. En annen vurdering for ex-vivo lungeperfusjonssystemet er fraværet av sentralnerveregulering og lymfatisk drenering. Effektene av deres fravær er ennå ikke fullt ut forstått og kan potensielt være en kilde til skjevheter i visse eksperimenter.
Den isolerte lungeperfusjonssystemteknikken kan utføres i kaninmodellen med høy grad av konsistens og reproduserbarhet. Dette arbeidet beskriver de tekniske og kirurgiske prosedyrene for implementeringen av den tidligere vivo-isolerte lungeperfusjonsteknikken som utviklet for kaninmodellen ved Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias i Mexico City, som har til hensikt å dele innsikten og gi en klar guide til viktige trinn i anvendelsen av denne eksperimentelle modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det isolerte perfusjonssystemet i kaninmodellen har blitt mye brukt i Bronchial Hyperresponsiveness Laboratory ved Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Protokollen inkluderer New Zealand kaniner med en omtrentlig vekt på 2,5-3 kg. Alle dyr ble holdt i standard vivariumforhold og ad libitum fôring i samsvar med de offisielle meksikanske retningslinjene for forsøksdyr (NOM 062-ZOO-1999) og under Guide for care and use of Laboratory Animals (8. utgave, 2011). Alle dyreprosedyrer og dyrepleiemetoder presentert i denne protokollen ble tidligere godkjent av Etikkkomiteen i Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
MERK: Forberedelsen av det isolerte lungeperfusjonssystemet innebærer bevisst død av et dyr under anestesi og via eutanasi.
1. Utstyr og tilberedning av apparater.
- Utstyrsarrangement:
- Sett opp et operasjonsbord med størrelse i henhold til kaninens vekt.
- Monter dekselet på den kunstige thoraxen på stålsøylen med glasskammeret under og ventilatoren med en rullepumpe ved sidene.
- Sørg for at dekselet er lett tilbøyelig til å ha trakealkanylen i tråd med luftrøret for å gi en raskere tilkobling.
- Kunstig thorax:
MERK: Det er en viktig del av systemet. Den består av et vannjakket glasskammer forseglet av et spesielt deksel. Dekselet fungerer som organholder med tilkoblinger for å kanylere luftrøret og karene som er innebygd i den.- Sett opp en venturistråle drevet av trykkluft for å generere det negative trykket inne i den kunstige thoraxen.
MERK: Ventilasjonskontrollmodulen (VCM) tillater separate justeringer av inspiratoriske og sluttutløpende trykk samt respirasjonshastighet og forholdet mellom inspiratorisk varighet og total syklusvarighet.
- Sett opp en venturistråle drevet av trykkluft for å generere det negative trykket inne i den kunstige thoraxen.
- Apparat:
- Påse at et normalt arbeidsapparat består av en hovedstålskolonne montert på en bunnplate som holder den kunstige thoraxen, med pneumotachometeret og vekttransduseren plassert over den og bak forvarmingsspolen med en boblefelle.
- Koble en differensialtrykktransduser til pneumotachometeret og en annen til kammertrykket. Sett et annet par trykktransdusere bak thoraxen for å måle perfusjon og venøst trykk.
- Koble omkoblingslageret under oksygenatoren med en nivåelektrode og ventilasjonssystemet ved siden av apparatet.
2. Kirurgisk ekstraksjon av kardiopulmonalblokken.
- Anestesi:
- Bruk en kombinasjon av beroligende (xylazin) og et barbiturat (pentobarbital).
MERK: Ulike bedøvelsescocktailer kan brukes uten effekt på eksperimentelle resultater. - Først sedate de sunne New Zealand kaniner med en enkelt intramuskulær injeksjon av xylazinhydroklorid (3-5 mg / kg). Forsikre deg om at kaninene forblir rolige og avslappet for å tillate ytterligere manipulering etter noen minutter av injeksjonen.
- Etter sedasjon, bruk de marginale (laterale) øreårene som tilgang til bedøvelse av kaninene med en intravenøs injeksjon av pentobarbital natrium (28 mg / kg).
- Bruk en kombinasjon av beroligende (xylazin) og et barbiturat (pentobarbital).
- Overvåking:
- For å unngå utilstrekkelig anestesi eller overdreven depresjon av hjerte- og åndedrettsfunksjoner, overvåk følgende parametere. For å vurdere dybden av anestesi, utfør en tåklemmetest.
- Forsikre deg om at slimhinnen er rosa. Blå eller grå nyanser indikerer hypoksi.
- Pass på at hjertefrekvensen er mellom 120-135 slag/min, og at kroppstemperaturen ikke faller under 36,5 °C.
- Plassering av dyr:
- Barber kaninens torso og legg dyret på operasjonsbordet i liggende stilling. Plasser ventilasjonssystemet nær bordet, bak kaninens hode, for å tillate tilkobling av kanylen raskt etter trakeotomi for å unngå tissulær skade.
- Snitt og trakeotomi:
- Disseker huden med et ventralt medianlinjesnitt på 3-5 cm fra membranen opp til nakken.
- Med operasjonssaksen, kutt den fremre 2/3 av luftrøret mellom to bruskringer for å sette inn trakealkanylen gjennom den trakeale fibrøse membranen.
- Sett inn en 5 mm (ytre diameter; OD) trakeal kanyle gjennom trakeal fibrøs membran og bruk en 4-0 silke sutur for å fikse den forsiktig.
- Plasser enten tang eller pinsett under luftrøret for å sikre at kanylen ikke bøyde seg mot luftrøret.
- Positiv trykkventilasjon:
- Så lenge lungene forblir utenfor den kunstige thoraxen, bruk en liten arts respirasjonspumpe for å ventilere et positivt trykk for å unngå lungekollaps under operasjonen.
- Start ventilasjonen gjennom trakealkanylen som er koblet til åndedrettspumpen raskt etter trakeotomi og før thoraxen åpnes.
- Still inn tidevannsvolumet på 10 ml/kg.
MERK: Avhengig av eksperimentoppsettet og den kunstige thoraxmodellen, gi positiv trykkventilasjon enten ved hjelp av den samme ventilasjonspumpen som brukes til å gi negativt trykk eller en annen, noe som gir en rask re-kannasjon.
- Thoracotomy og exsanguination:
- For å få tilgang til thoracic hulrommet, bruk en skalpell eller saks for å åpne thoraxveggen og utfør en medial sternotomy opp til den øvre tredjedel av thoraxen.
- Hold thoraxhalvdelene åpne med to retraktorer. Flere lungeklaffer omgir vanligvis hjertet.
- Lokaliser den overlegne og dårligere vena cava og henvise dem med tråder.
- Før ekssanguinasjon av dyret, identifiser riktig ventrikel og injiser 1000 UI / kg heparin.
- Umiddelbart etter injeksjonen, ligate den overlegne og dårligere vena cava med pre-looped tråden og utføre exsanguination.
- Hjerte-lunge høsting:
- Høst kardiopulmonalblokken forsiktig og raskt. Bruk direkte digital disseksjon eller vårsaks for å skille bindevevet for å fjerne lungene fra thoraxen.
- Disseker vaskulaturen i området, så vel som spiserøret.
- Skjær gjennom manubrium sterni for å forlenge medial sternotomy mot trakealkanyle, og frigjør luftrøret på begge sider fra bindevev.
- Nå, resect luftrøret over trakeal kanyle. Trekk forsiktig opp kanylen i en kraniokryaudal akse når dorsal fiksering av luftrøret og lungene blir resektert.
- Kannkulasjon:
- Løft de isolerte lungene ut av thoraxen og legg dem forsiktig over en steril gasbind på en petriskål.
- For å forhindre atelektase, ventiler lungene ved hjelp av positiv trykkventilasjon med positivt sluttutløpende trykk (PEEP) satt til 2 cmH2O.
- Fjern ventriklene ved å kutte dem av hjertet på nivået av atrioventrikkelsporet.
- Etter å ha åpnet de to ventriklene, introduser OD 4,6 mm lungearteriekanyle for kaninen med en kurv gjennom lungearterien og innfør OD 5,9 mm venstre atriumkanyle til kaninen med kurven gjennom mitralventilen inn i venstre atrium.
- Bruk en 4-0 silke sutur i lungearterien og venstre atrium for å fikse kanylene. Inkluder de omkringliggende vevene i ligaturene i lungearterien og venstre atrium for å unngå distensjon av disse strukturene.
- Injiser 250 ml saltoppløsning isotonisk løsning gjennom arteriell kanyle for å skylle det gjenværende blodet fra den vaskulære sengen.
3. Perfusjonsteknikk.
- Installasjonsprogrammet:
- Plasser de isolerte lungene forsiktig inn i lungekammeret.
- Fest luftrøret til transduktoren på dekselet på kammeret.
- Koble de kanylerte karene til perfusjonssystemet.
- Lukk kammeret og fest det med den roterende låsen.
MERK: Den resirkulerende perfusjonskretsen består av et åpent vene reservoar, en peristaltisk pumpe, en varmeveksler og en boblefelle. - På dette tidspunktet fester du kammerlokket og bytter over en stoppekran for å bytte fra positiv til negativ trykkventilasjon. For å kontrollere den negative trykkventilasjonen av lungene og lufttett lukking av kammeret, kontroller luftveiene i lungen og kammertrykket på trykkmåleren.
- Perfuse lungene med 200 ml kunstig blodfri perfusat (en Krebs-Ringer bikarbonatbuffer som inneholder 2,5% av bovint albumin).
- Start den perfusatstrømmen ved 3 ml/min/kg, og tråkk deretter langsomt opp gjennomstrømningen over en periode på 5 minutter til 5 ml/min/kg. Nå en strøm på 8 ml/min/kg i løpet av de neste 5 minutter, og deretter når en annen periode på 5 minutter maksimalt 10 ml/min/kg. Pass på å unngå at luft kommer inn i kretsen.
MERK: Opprettholde pH og temperaturen på perfusate innenfor fysiologiske områder (pH 7,4-7,5; temperatur, 37 °C-38 °C). For å justere pH, tilsett NaHCO3 (1N) eller øk strømmen av karbondioksid. Alternativt kan du bruke HCl (0.1N) for å surgjøre.
- Parametere:
- Kontroller om de forhåndsbestemte perfusjons- og ventilasjonsparametrene er angitt etter behov.
- Ventiler lungene med fuktet luft med en frekvens på 30 bpm, et tidevannsvolum på 10 ml/kg og et endeutløpstrykk (Pe) på 2 cmH2O.
MERK: Lungearterialtrykket (0-20 mmHg) tilsvarer høyden på væskenivået i oksygenatoren eller reservoaret i centimeter over lungestammen, mens lungelyset tilsvarer høyden på trykklikevektkammeret over venstre atrium. Begge verdiene kan endres. Vær oppmerksom på at venstre atriumtrykk også er 0-20 mmHg.
- Oppnå sone 3 forhold:
- Bruk de to katetreene som er koblet til sideportene i kanylen som er festet i lungearterien, venstre atrium og trykktransdusere for å måle arterielle (Pa) og venøse (Pv) trykk.
- Still inn grunnlinjetrykket på lunge-hilumnivået (Nullreferanse).
- Utfør forsøkene under sone 3 ventilasjonsforhold. For å oppnå dette, vent i 10-15 min for å få en likevekt preget av en isogravimetrisk tilstand.
- Forsikre deg om at venøst trykk er høyere enn alveolartrykket (Palv) og arterielt trykk forblir høyere enn begge (Pa > Pv > Palv) for sone 3 forhold skal oppstå.
- Sørg for at lungenes vekt forblir konstant og arteriell og venstre atrietrykk er stabilt for å oppnå sone 3 forhold for å åpne opp et maksimalt antall lungekar og opprettholde mikrovaskulært sengeinnhold under eksperimentet.
MERK: Målingen av Kfc som indikator på lungeødem har ingen variasjon mellom en manuell og et automatisk perfusjonssystem.
- Elektronisk kontroll og signalbehandling: Sørg for at luftveiene, vektendringer, mikrovaskulært trykk, tidevannsvolum, vaskulær motstand, blant annet, registreres på en fler sentral elektronikkenhet som integrerer signaler som kommer fra transduserne og viser dem på evalueringssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det isolerte lungeperfusjonssystemet tillater organmanipulering for biopsi, prøveinnsamling fra perfusjon og sanntidsdatainnsamling av fysiologiske parametere. Det isolerte systemet kan brukes til å teste mange hypoteser som involverer forskjellige funksjoner og lungefenomener, fra metabolsk og enzymatisk aktivitet til ødemdannelse og bevaringsperioder for lungetransplantasjoner.
Figur 1 viser et diagram over det ferdigmonterte isolerte lungeperfusjonssystemet sammen med ventilasjonssystemet og den beregnede datainnsamlingen. Perfusjonskomponenten i systemet sikrer at perfusatet hele tiden strømmer gjennom de isolerte lungene. Lungearterien er kanylert for å gi tilstrømningsperfusjon, mens perfusatutstrømning er gitt ved å kanylere venstre atrium i hjertet. Perfusatet passeres ved hjelp av rullepumpen slik at perfusate passerer gjennom varmeveksleren, deretter gjennom boblefellen inn i lungearterien, og til slutt inn i lungevaskulær seng. Ventilasjonskomponenten i systemet gjør at ventilasjonsmediet kan strømme konstant forbi den distale enden av pneumotachometeret direkte via trakealkanylen inn i lungene.
Figur 2 viser konsentrasjonen av MAO (figur 2A) og 5-HT (figur 2B) i en isolert lunge bevart ved 4 °C til og med 24 timer. Serotonin- og monoaminoksidasenivåer ble bestemt fra intravaskulære væskeprøver oppnådd på forskjellige tidspunkter og analysert av ELISA. 5-HT konsentrasjonen toppet seg etter 15 min bevaring og deretter redusert i løpet av de neste 6 h. Etterpå viste perfusjonsnivåene en ikke-statistisk signifikant økning frem til 24. MAO-nivåer viste en lignende oppførsel, toppet etter 15 minutters bevaring, og deretter avtok i løpet av de neste seks timene opp til den 24. Figur 3 viser 5-HT- og MAO-frigjøringshastigheter, uttrykt som en prosentandel av startverdien, målt gjennom 24 timer i et isolert lungepreparat ved 4 °C. I løpet av den første timen med bevaring steg 5-HT-nivåene høyere enn MAO og reduserte innen 6 timer etter å ha blitt gjenerobret av endotelceller og blodplater samt MAO-mediert katabolisme12.
Figur 4 viser NEP (optisk tetthet/mg protein/min) og ACE enzymatisk aktivitet (optisk tetthet/mg protein/min) gjennom tidene i et isolert lungepreparat. NEP-aktivitet (figur 4A) ble bestemt av spektrofotometrisk analyse ved hjelp av N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly som NEP-substrat etterfulgt av enalapril addisjon for å hemme ACE. ACE-aktivitet (figur 4B) ble bestemt av spektrofotometrisk analyse ved bruk av enalapril som ACE-substrat, etterfulgt av fosforamidontilsetning for å hemme NEP. Siden begge løsningene inneholdt enalapril, ble ACE-aktivitet beregnet som forskjellen i fluorescens mellom prøver med og uten enalapril13.
Figur 5 viser effekten av lungebevaring i kapillær permeabilitet (mKfc) gjennom en periode på 24 timer i det isolerte lungeperfusjonssystemet i kaninmodellen. En kontrollgruppe (n = 6), vurdert umiddelbart etter høsting, hadde en mKfc på 2,8 ± 0,8 (ml/min/cmH2O/g) standardfeil, Derimot led den perfused lungen en progressiv økning på mKfc scoring 7,5 ± 1,4 (n = 6) ved 6 t, 10,8 ± 2,3 (n = 6) ved 12 timer og nådde 16,3 ± 2,5 (n = 6) etter 24 h bevaring13.
Figur 6 viser effekten av forskjellige tilsetningsstoffer i den kapillære permeabiliteten til det isolerte lungeperfusjonssystemet under ulike forhold. En plutselig trykkøkning på 10 cmH2O genereres ved en delvis hindring av venøs utstrømning for å måle permeabiliteten til kapillærsengen gjennom kapillærfiltreringskoeffisienten (Kfc). For å måle Kfc ble utstrømningsslangen som går ut av venstre ventrikel til Krebs-reservoaret delvis klemt. Deretter ble den delvise klemmen opprettholdt i 3 minutter og sørget for at trykkøkningen nådde 10 cmH2O. Klemmen ble sluppet, og den normale strømmen fortsatte. Denne manøveren ble registrert som en økning av arterielt trykk og en lungevektforstørrelse. Denne siste parameteren regnes som Kfc.
Figur 1: Diagram for det isolerte lungeperfusjonssystemet. Denne figuren er modifisert fra Hugo Sachs Elektronik (HMS), Harvard Apparatus14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konsentrasjon av serotonin (5-HT) og monoaminoksidase (MAO) involvert i lungemetabolisme og vaskulær permeabilitet. Konsentrasjonen av (A) MAO og (B) 5-HT i en isolert lunge bevart ved 4 °C til og med 24 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Frigjøringshastigheter for serotonin (5-HT) og monoaminoksidase (MAO). Frigjøringsratene på 5-HT og MAO, uttrykt som en prosentandel av startverdien, målt gjennom 24 timer i et isolert lungepreparat ved 4 °C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Enzymatisk aktivitet av nøytral endopeptidase (NEP) og angiotensinkonverterende enzym (ACE). Enzymatisk aktivitet av (A) NEP og (B) ACE gjennom tidene i en isolert lunge bevart ved 4 °C til og med 24 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekt av lungebevaring ved kapillær permeabilitet (mKfc). Dataene viser effekten av lungebevaring i kapillær permeabilitet (mKfc) gjennom en periode på 24 timer i det isolerte lungeperfusjonssystemet i kaninmodellen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effekt av forskjellige tilsetningsstoffer i kapillær permeabilitet. Effekten av forskjellige tilsetningsstoffer i kapillær permeabilitet av det isolerte lungeperfusjonssystemet under forskjellige forhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet viser et generelt syn på det isolerte lungeperfusjonssystemet, en viktig teknikk i lungefysiologiforskning. Det isolerte lungeperfusjonssystemet gir en stor grad av allsidighet i bruken og tillater evaluering av flere parametere som er relevante for testing av et bredt spekter av hypoteser15. Et isolert lungesystem er et verktøy med verdensomspennende tilstedeværelse som i løpet av det siste tiåret har ytterligere etablert sin relevans for organspesifikke evalueringer og også utvidet nytten som en forlengelse av toppmoderne teknologier og nye terapier som involverer mesenchymale stamceller16 og CRISPR / Cas9 genomteknikk17, blant andre. Nåværende ex vivo lungeperfusjonsforskningsområder dekker i stor grad antiinflammatoriske strategier, ventilasjonsskadehåndtering og forebygging, anti-avvisningsbehandling og antipulmonal ødemytelse15.
En riktig montering av apparatet er nødvendig for å garantere riktig dataerindring. Som vist i figur 1 består hele systemet av et vått trykkkammer med negativt trykk festet til et ventilasjonssystem og et perfusjonssystem som etterligner henholdsvis lungenes åndedretts- og sirkulasjonsfunksjoner. Begge systemene er koblet til et datainnsamlingssystem som gjør det mulig å legge til måleenheter som kan skreddersys for behovene til enhver protokoll. Den kirurgiske prosessen med å høste kardiopulmonalblokken bør utføres raskt, helst av erfarent personell, for å unngå ytterligere vevsskade for å opprettholde lungen så intakt som mulig, slik at den fysiologiske funksjonen kan fortsette uten ytterligere forstyrrelser under eksperimentet. Systemet muliggjør også perfusjonsprøvesamling i sanntid som kan brukes til å bestemme effekten av visse molekyler i forskjellige lungefunksjoner (for eksempel heparineffekt på lungebevaring).
For å oppnå en riktig fordeling av perfusjonsstrømmen mellom lungefartøy, nemlig kapillærer, bør sone 3-forhold anskaffes. Sone 1 forhold er definert som regionen der arterielt trykk faller under alveolartrykket, vanligvis nærmer seg atmosfærisk trykk. Når dette skjer, flater kapillærene ut, noe som gjør blod eller perfusjon umulig. Under normale omstendigheter kan sone 1 ikke eksistere siden arterielt trykk er nok til å garantere strømningsfordeling. Imidlertid kan sone 1-forhold oppstå hvis arterielt trykk faller, eller alveolartrykket øker (som det gjør under positiv trykkventilasjon). Sone 1-forhold fører til en uforstyrret ventilert lunge som ikke er i stand til å utføre en gassutveksling. Under sone 2-forhold er arterielt trykk høyere enn alveolartrykket. Venøst trykk forblir imidlertid under alveolartrykket, noe som resulterer i en perfusjonsstrøm bestemt av forskjellen mellom arteriell og alveolartrykk. Denne virkemåten kan modelleres ved hjelp av en Starling-motstand. Sone 3-forholdene bestemmes av forskjellen mellom arteriell og venøs trykk. Økningen i perfusjonsstrømmen i sone 3 oppstår fordi kapillærene distend, kondisjonerer åpningen av et maksimalt antall lungefartøy.
Systemets enhet består av syv moduler: to analoge svingerforsterkermoduler (TAM-A) utstyrt med et analogt LED-stolpegrafsignal for å overvåke dynamiske signaler (blodtrykk, luftstrøm, sammentrekningskraft, etc.), en digital svingerforsterkermodul (TAM-D) med et digitalt numerisk display designet for å overvåke sakte skiftende pulsatilesignaler; en servokontroller for perfusjonsmodul (SCP) som fungerer sammen med TAM-A- og TAM-D-forsterkere for perfusjonskontroll av isolerte organperfusjoner ved hjelp av den peristaltiske pumpen, kan pumpehastigheten stilles inn i konstant trykkmodus eller kontrolleres manuelt gjennom SCP; en ødembalansemodul (EBM) som måler lungevekt; en ventilasjonskontrollmodul (VCM) for å kontrollere positiv og negativ trykkventilasjon, og en timertellermodul (TCM) som kan stilles inn til å utløse VCM for å utføre dype inspirasjonssykluser.
Den høye globale utbredelsen av lunge- og respiratoriske følelser og begrensningene i dagens terapeutiske alternativer tvinger frem en større etterspørsel etter lungetransplantasjoner, da det fortsatt er gullstandardbehandling for pasienter med terminal lungesykdom18. Ex-vivo lungeperfusjonssystemet representerer en utmerket plattform for å teste målrettede terapier i både grunnleggende og klinisk forskning. På et klinisk nivå kan ex-vivo perfusjonssystemet brukes til å evaluere graftvev utenfor kroppen, slik at man kan teste det isolerte organet før transplantasjon, og bidra til å samle kliniske data for en mer presis prognostisk på transplantasjonens effektivitet. Rasjonell bruk av det isolerte lungeperfusjonssystemet kan bidra til å optimalisere lungetransplantasjonskirurgi, noe som gjør dem til en tryggere og mer valgbar prosedyre. Den isolerte lungemodellen er også nyttig i grunnforskningen av avanserte diagnose- og terapiteknikker som instillasjon av mesenchymale stamceller og andre immunmediert terapi; mange rapporter har vist potensialet i ex-vivo perfusjonsteknikken som en plattform for å gjøre videre forskning på lungebevaring i utviklingen av teknikker for å unngå iskemi-reperfusjonsskade og lungeødem, og forlenge organ levedyktighet15. Noen feilsøkingstrinn og begrensninger knyttet til den isolerte lungemodellen er hovedsakelig den korte tilgjengelige tiden for denne teknikken for mulig ødemgenerering indusert av lymfatisk dreneringsbegrensning samt den systemiske effekten av teknikken. Den kapillære filtreringskoeffisienten (Kfc) er et pålitelig kriterium for å måle funksjonaliteten til bevart lungevev og etablere omfanget av ødem gjennom tidene. Det er ikke funnet noen forskjell mellom de manuelle og automatiske bestemmelsene til Kfc19.
Etter hvert som bruken av det isolerte lungeperfusjonssystemet populariserer og nye terapier endrer det kliniske landskapet, blir ex-vivo-perfusjonsteknikken et valgbart valg for å forbedre pasientresultatene i forskjellige lungepatologier, samt å øke bassenget med potensielle lungedonorer uten å gå på kompromiss med mottakersikkerheten, og lover en ny epoke innen lungebevaring og lungetransplantasjon. Fremveksten av Covid-19-pandemien og økningen av KOLS's utbredelse18,20 i den globale befolkningen fremhever behovet for ytterligere grunnleggende forskning på lungefysiologi, lungebevaring og lungetransplantasjon, samt preklinisk forskning på nye terapier med syn på translasjonsmedisin. Videre er ex-vivo kaninmodellen en tilgjengelig og praktisk modell for å trene beboere og studenter innen pulmonologi, spesielt de som er involvert i thoraxkirurgi og ECMO. Ethvert laboratorium som er involvert i respiratoriske eller thoracopulmonary forskningsprotokoller oppfordres til å vurdere det isolerte lungeperfusjonssystemet som en del av deres daglige verktøy for sine eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Ph.D. Bettina Sommer Cervantes for hennes støtte i skrivingen av dette manuskriptet, og Kitzia Elena Lara Safont for hennes støtte til illustrasjonene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
