Summary
Den isolerede kanin lunge forberedelse er en guld standard værktøj i lungeforskning. Denne publikation har til formål at beskrive den teknik, der er udviklet til undersøgelse af fysiologiske og patologiske mekanismer, der er involveret i luftvejsreaktivitet, lungebevarelse og præklinisk forskning i lungetransplantation og lungeødem.
Abstract
Det isolerede lungeperfusionssystem har været meget udbredt i lungeforskning, hvilket bidrager til at belyse lungernes indre funktioner, både mikro- og makroskopisk. Denne teknik er nyttig i karakteriseringen af lungefysiologi og patologi ved at måle metaboliske aktiviteter og åndedrætsfunktioner, herunder interaktioner mellem kredsløbsstoffer og virkningerne af inhalerede eller perfunderede stoffer, som i lægemiddeltest. Mens in vitro-metoder involverer udskæring og dyrkning af væv, gør det isolerede ex vivo lungeperfusionssystem det muligt at arbejde med et komplet funktionelt organ, der muliggør studiet af en kontinuerlig fysiologisk funktion, samtidig med at ventilation og perfusion genoprettes. Det skal dog bemærkes, at virkningerne af fraværet af central innervation og lymfedrænage stadig skal vurderes fuldt ud. Denne protokol har til formål at beskrive samlingen af det isolerede lungeapparat, efterfulgt af kirurgisk ekstraktion og cannulation af lunger og hjerte fra eksperimentelle forsøgsdyr, samt at vise perfusionsteknikken og signalbehandlingen af data. Den gennemsnitlige levedygtighed af den isolerede lunge varierer mellem 5-8 timer; i denne periode øges lungekapillær permeabiliteten, hvilket forårsager ødem- og lungeskader. Funktionaliteten af konserveret lungevæv måles ved kapillær filtreringskoefficient (Kfc), der anvendes til at bestemme omfanget af lungeødem gennem tiden.
Introduction
Brodie og Dixon beskrev først ex-vivo lungeperfusionssystemet i 1903 1. Siden da er det blevet et guldstandardværktøj til at studere lungernes fysiologi, farmakologi, toksikologi og biokemi2,3. Teknikken tilbyder en konsekvent og reproducerbar måde at vurdere levedygtigheden af lungetransplantationer, og at bestemme effekten af inflammatoriske mæglere såsom histamin, arachidonsyre metabolitter, og stof P, blandt andre, samt deres interaktioner under lungefænomener såsom bronchoconstriction, atelektase, og lungeødem. Det isolerede lungesystem har været en nøgleteknik til at afsløre lungernes vigtige rolle i elimineringen af biogene aminer fra den generelle cirkulation4,5. Derudover er systemet blevet brugt til at evaluere biokemien af lungebrændingsmiddel6. I løbet af de sidste par årtier er ex-vivo lungeperfusionssystemet blevet en ideel platform for lungetransplantationsforskning7. I 2001 beskrev et hold ledet af Stig Steen den første kliniske anvendelse af ex-vivo lungeperfusionssystemet ved at bruge det til at istandsætte lungerne hos en 19-årig donor, som oprindeligt blev afvist af transplantationscentre på grund af dets skader. Den venstre lunge blev høstet og perfunderet i 65 min; Efterfølgende blev det med succes transplanteret ind i en 70-årig mand med KOL8. Yderligere forskning i lunge istandsættelse ved hjælp af ex-vivo perfusion førte til udvikling af Toronto teknik til udvidet lunge perfusion til at vurdere og behandle sårede donor lunger9,10. Klinisk har ex-vivo lungeperfusionssystemet vist sig at være en sikker strategi for at øge donorpuljer ved at behandle og istandsætte donor lunger, der ikke lever op til standarddonor lunger, hvilket ikke udgør nogen signifikant forskel i risici eller resultater i forhold til standardkriterier donorer10.
Den største fordel ved det isolerede lungeperfusionssystem er, at de eksperimentelle parametre kan evalueres i et komplet funktionelt organ, der bevarer dets fysiologiske funktion under en kunstig laboratorieopsætning. Desuden gør det muligt at måle og manipulere lungemekanisk ventilation for at analysere komponenterne i lungefysiologi som luftvejsmodstand, total vaskulær modstand, gasudveksling og ødemdannelse, som til dato ikke kan måles præcist in vivo på forsøgsdyr2. Navnlig kan sammensætningen af den opløsning, hvormed lungen er gennemsyret, kontrolleres fuldt ud, hvilket gør det muligt at tilsætning af stoffer til at evaluere deres virkninger i realtid og prøveindsamling fra perfusion til yderligere undersøgelse11. Forskere, der arbejder med det isolerede lungesystem, bør huske på, at mekanisk ventilation forårsager henfald af lungevævet, der forkorter dets nyttige tid. Dette progressive fald i mekaniske parametre kan betydeligt forsinkes ved hyperinflatering af lungerne lejlighedsvis i løbet af eksperimentets tid4. Alligevel kan præparatet normalt ikke vare mere end otte timer. En anden overvejelse for ex-vivo lunge perfusion system er fraværet af centralnervesystemet regulering og lymfedrænage. Virkningerne af deres fravær er endnu ikke fuldt forstået og kan potentielt være en kilde til bias i visse eksperimenter.
Den isolerede lungeperfusionssystemteknik kan udføres i kaninmodellen med en høj grad af konsistens og reproducerbarhed. Dette arbejde beskriver de tekniske og kirurgiske procedurer for gennemførelsen af ex-vivo isolerede lungeperfusion teknik som udviklet til kanin model på Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias i Mexico City, der har til hensigt at dele indsigt og give en klar vejledning om centrale trin i anvendelsen af denne eksperimentelle model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det isolerede perfusionssystem i kaninmodellen er blevet meget udbredt i Bronchial Hyperresponsiveness Laboratory på Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Protokollen omfatter New Zealand kaniner med en omtrentlig vægt på 2,5-3 kg. Alle dyr blev holdt under standard vivarium betingelser og ad libitum fodring i overensstemmelse med de officielle mexicanske retningslinjer for forsøgsdyr (NOM 062-ZOO-1999) og under vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (8. udgave, 2011). Alle de dyreprocedurer og dyreplejemetoder, der præsenteres i denne protokol, blev tidligere godkendt af Instituto Nacionals etiske komité for udleder åndedrætsværn.
BEMÆRK: Forberedelsen af det isolerede lungeperfusionssystem indebærer forsætlig død af et dyr under anæstesi og via aktiv dødshjælp.
1. Udstyr og klargøring af apparater.
- Udstyr arrangement:
- Opret et operationsbord med størrelse i henhold til kaninens vægt.
- Monter dækslet af den kunstige brystkasse på stålsøjlen med glaskammeret nedenunder og ventilatoren med en rullepumpe ved siderne.
- Sørg for, at dækslet er let tilbøjelige til at have luftrøret kanylen i overensstemmelse med luftrøret for at tillade en hurtigere forbindelse.
- Kunstig thorax:
BEMÆRK: Det er en væsentlig del af systemet. Den består af et vandjakkeglaskammer forseglet af et specielt dæksel. Dækslet fungerer som organholder med forbindelser til at kannulere luftrøret og fartøjer indlejret i det.- Sæt en venturistråle, der drives af trykluft, op for at generere det negative tryk inde i den kunstige brystkasse.
BEMÆRK: Ventilationskontrolmodulet (VCM) giver mulighed for separate justeringer af inspiratoriske og endeudløbstryk samt respirationshastighed og forholdet mellem inspiratorisk varighed og den samlede cyklusvarighed.
- Sæt en venturistråle, der drives af trykluft, op for at generere det negative tryk inde i den kunstige brystkasse.
- Apparat:
- Sørg for, at et normalt fungerende apparat består af en hovedstålsøjle monteret på en bundplade, der holder den kunstige brystkasse, med pneumotachometeret og vægttransduceren placeret over den og bag forvarmningsspolen med en boblefælde.
- Tilslut en differentialtryktransducer til pneumotachometeret og en anden til kammertrykket. Sæt et par forskellige tryktransducere bag brystkassen for at måle perfusion og venøstryk.
- Tilslut omskiftelageret under oxygenatoren med en planelektrode og ventilationssystemet ved siden af apparatet.
2. Kirurgisk udvinding af kardiopulmonal blok.
- Anæstesi:
- Brug en kombination af et beroligende middel (xylazine) og en barbiturat (pentobarbital).
BEMÆRK: Forskellige bedøvelsescocktails kan bruges uden effekt på eksperimentelle resultater. - For det første bedøve de sunde New Zealand kaniner med en enkelt intramuskulær injektion af xylazinhydrochlorid (3-5 mg/kg). Sørg for, at kaninerne forbliver rolige og afslappede for at tillade yderligere manipulation efter et par minutter af injektionen.
- Efter sedation skal du bruge de marginale (laterale) øreårer som adgang til bedøvelse af kaninerne med en intravenøs injektion af pentobarbital natrium (28 mg/kg).
- Brug en kombination af et beroligende middel (xylazine) og en barbiturat (pentobarbital).
- Overvågning:
- For at undgå utilstrækkelig anæstesi eller overdreven depression af hjerte- og åndedrætsfunktioner skal du overvåge følgende parametre. For at vurdere dybden af anæstesi, udføre en tå knivspids test.
- Sørg for, at slimhinden er lyserød. Blå eller grå nuancer indikerer hypoxi.
- Sørg for, at pulsen er mellem 120-135 slag/min, og at kropstemperaturen ikke falder til under 36,5 °C.
- Placering af dyr:
- Barber kaninens torso og læg dyret på operationsbordet i liggende stilling. Placer ventilationssystemet nær bordet, bag kaninens hoved, for at tillade tilslutning af kanylerne hurtigt efter tracheotomi for at undgå tissular skader.
- Snit og tracheotomi:
- Dissekere huden med en ventral median linje snit på 3-5 cm fra mellemgulvet op til halsen.
- Med driftssaksen skæres den forreste 2/3 af luftrøret mellem to bruskringe for at indsætte tracheal kanylen gennem luftrørets fibrøse membran.
- Indsæt en 5 mm (ydre diameter; OD) luftrør kanyle gennem luftrøret fibrøst membran og bruge en 4-0 silke sutur til at ordne det omhyggeligt.
- Placer enten pincet eller pincet under luftrøret for at sikre, at kanylen ikke bøjede mod luftrøret.
- Ventilation med positivt tryk:
- Så længe lungerne forbliver uden for den kunstige brystkasse, skal du bruge en lille arts respirationspumpe til at ventilere et positivt tryk for at undgå lungekollaps under operationen.
- Start ventilation gennem tracheal kanylen tilsluttet respiration pumpen hurtigt efter tracheotomi og før brystkassen åbnes.
- Indstil tidevandsvolumen til 10 mL/kg.
BEMÆRK: Afhængigt af eksperimentopsætningen og den kunstige brystkassemodel skal du sørge for ventilation med enten den samme ventilationspumpe, der bruges til at give et negativt tryk, eller en anden, hvilket giver en hurtig re-cannulation.
- Thoracotomy og exsanguination:
- For at få adgang til brysthulen skal du bruge en skalpel eller saks til at åbne brystkassen og udføre en mediale sternotomi op til den øverste tredjedel af brystkassen.
- Hold brystkassen halvdele åbne med to retraktorer. Flere lungeflapper omgiver normalt hjertet.
- Lokalisere den overlegne og ringere vena cava og henvise dem med tråde.
- Før dyrets exsanguination identificeres den rigtige ventrikel og injicerer 1000 UI /kg heparin.
- Umiddelbart efter injektionen, ligate den overlegne og ringere vena cava med den præ-looped tråd og udføre exsanguination.
- Hjerte-lunge høst:
- Høst kardiopulmonalblokken forsigtigt og hurtigt. Brug direkte digital dissektion eller fjedersaks til at adskille bindevævet for at fjerne lungerne fra brystkassen.
- Dissekere vaskulaturen i området, samt spiserøret.
- Skær gennem manubrium sterni at udvide den mediale sternotomi mod luftrøret kanylen, frigive luftrøret på begge sider fra at forbinde væv.
- Resekter luftrøret over luftrøret. Træk forsigtigt kanylen op i en craniocaudal akse, da rygfikseringen af luftrøret og lungerne resected.
- Cannulation:
- Løft de isolerede lunger ud af brystkassen og læg dem forsigtigt over en steril gasbind på en petriskål.
- For at forhindre atelektase skal lungerne ventileres ved hjælp af ventilation med positivt endeudløb (PEEP) indstillet til 2 cmH2O.
- Fjern hjertekamrene ved at afskære dem fra hjertet på niveau med atrioventrikulær rille.
- Efter åbning af de to hjertekamre, indføre OD 4,6 mm lungepulsåren kanylen til kaninen med en kurv gennem lungepulsåren og indføre OD 5,9 mm venstre atrium kanyle til kaninen med kurven gennem mitralventilen ind i venstre atrium.
- Brug en 4-0 silke sutur i lungepulsåren og venstre atrium til at fastsætte kanyler. Medtag de omgivende væv i ligaturerne i lungearterien og venstre atrium for at undgå udstribning af disse strukturer.
- Indsprøjt 250 mL saltvands isotonisk opløsning gennem arteriel kanyler for at skylle det resterende blod ud af karlejet.
3. Perfusion teknik.
- Installationsprogrammet:
- Placer de isolerede lunger forsigtigt ind i lungekammeret.
- Fastgør luftrøret til transduktoren på kammerets dæksel.
- Tilslut de kansdyrkede fartøjer til perfusionssystemet.
- Luk kammeret og fastgør det med drejelåsen.
BEMÆRK: Recirkulerende perfusionskredsløb består af et åbent venøs reservoir, en peristaltisk pumpe, en varmeveksler og en boblefælde. - På dette tidspunkt skal du fastgøre kammerlåget og skifte over en stophane for at skifte fra positiv til negativtryksventilation. For at kontrollere trykket ventilation af lungerne og lufttæt lukning af kammeret, inspicere respiratoriske udflugt af lunge og kammer pres på trykmåleren.
- Gennemtræng lungerne med 200 mL kunstig blodfri perfusat (en Krebs-Ringer bicarbonatbuffer, der indeholder 2,5% af kvægalbumin).
- Start perfusatflowet ved 3 mL/min/kg, og optrappes derefter langsomt flowet over en 5-minutters periode til 5 minutter/min/kg. Nå en strøm på 8 mL/min/kg i løbet af de næste 5 min og derefter efter en anden 5-min periode nå en maksimal flux på 10 mL/min/kg. Pas på at undgå luft fra at komme ind i kredsløbet.
BEMÆRK: PH-værdi og temperatur i perfusatet inden for fysiologiske områder (pH 7,4-7,5; temperatur, 37 °C-38 °C). Hvis du vil justere pH-skærmen, skal du tilsætte NaHCO3 (1N) eller øge strømmen af kuldioxid. Alternativt kan du bruge HCl (0.1N) til at forsuring.
- Parametre:
- Kontroller, om de forudbestemte perfusions- og ventilationsparametre er indstillet efter behov.
- Ventiler lungerne med befugtet luft med en frekvens på 30 bpm, et tidevandsvolumen på 10 mL/kg og et endeudløbstryk (Pe) på 2 cmH2O.
BEMÆRK: Lungearterietrykket (0-20 mmHg) svarer til højden af væskeniveauet i oxygenatoren eller reservoiret i centimeter over lungestammen, mens lungefloventrykket svarer til højden af trykekvilibreringskammeret over venstre atrium. Begge værdier kan ændres. Bemærk, at venstre atriumtryk også er 0-20 mmHg.
- Opnåelse af zone 3 betingelser:
- Brug de to katetre forbundet til sideporte af kanyler sikret i lungearterien, venstre atrium, og tryk transducere til at måle arteriel (Pa) og venøse (Pv) pres.
- Indstil baselinetrykket på lunge fæstumniveau (Nulreference).
- Udfør forsøgene under zone 3 ventilationsforhold. For at opnå dette skal du vente i 10-15 minutter for at opnå en ligevægt præget af en isogravimæmisk tilstand.
- Sørg for, at venøstrykket er højere end alveolærtrykket (Palv), og at arterietrykket forbliver højere end begge (Pa > Pv > Palv) for Zone 3 betingelser, der skal forekomme.
- Sørg for, at lungernes vægt forbliver konstant og arteriel og venstre atrietryk er stabil for at opnå zone 3 betingelser for at åbne et maksimalt antal lungekar og opretholde mikrovaskulære seng indhold under forsøget.
BEMÆRK: Målingen af Kfc som indikator for lungeødem har ingen variation mellem en manual og et automatisk perfusionssystem.
- Elektronisk styring og signalbehandling: Sørg for, at åndedrætsstrøm, vægtændringer, mikrovaskulært tryk, tidevandsvolumen, vaskulær modstand, blandt andre, registreres på en flere central elektronikenhed, der integrerer signaler, der kommer fra transducerne og viser dem på evalueringssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det isolerede lungeperfusionssystem muliggør organmanipulation for biopsi, prøveindsamling fra perfusion og realtidsdataindsamling af fysiologiske parametre. Det isolerede system kan bruges til at teste mange hypoteser, der involverer forskellige funktioner og lungefænomener, fra metabolisk og enzymatisk aktivitet til ødemdannelse og konserveringsperioder for lungetransplantationer.
Figur 1 viser et diagram over det fuldt monterede isolerede lungeperfusionssystem sammen med ventilationssystemet og den beregnede dataindsamling. Perfusionskomponenten i systemet sikrer, at perfusate konstant strømmer gennem de isolerede lunger. Lungepulsåren er cannulated at give indstrømning perfusion, mens perfusate udstrømning leveres ved cannulating venstre atrium i hjertet. Perfusate passeres ved hjælp af rullepumpen, så perfusate passerer gennem varmeveksleren, derefter gennem boblefælden ind i lungepulsåren og til sidst ind i lungekarakulær seng. Ventilationskomponenten i systemet gør det muligt for ventilationsmediet at flyde konstant forbi den distale ende af pneumotachometeret direkte via luftrørets kanyle ind i lungerne.
Figur 2 viser koncentrationen af MAO (figur 2A) og 5-HT (figur 2B) i en isoleret lunge, der er bevaret ved 4 °C til 24 timer. Serotonin og monoaminoxidase niveauer blev bestemt fra intravaskulære væskeprøver opnået på forskellige tidspunkter og analyseret af ELISA. 5-HT-koncentrationen toppede efter 15 minutters konservering og faldt derefter i løbet af de næste 6 timer. Derefter viste perfusionsniveauer en ikke-statistisk signifikant stigning op til den 24. time. MAO niveauer viste en lignende adfærd, toppede efter 15 minutters bevarelse, derefter faldende i løbet af de næste seks timer op til den 24. time12. Figur 3 viser 5-HT- og MAO-frigivelsesrater, udtrykt i procent af startværdien, målt til 24 timer i et isoleret lungepræparat ved 4 °C. I løbet af den første time af konservering, 5-HT niveauer steg højere end MAO og faldt inden for 6 timer efter at være blevet generobret af endotelceller og blodplader samt MAO medieret katabolisme12.
Figur 4 viser NEP (optiske tætheder/mg protein/min) og ACE enzymatisk aktivitet (optiske tætheder/mg protein/min) gennem tiden i et isoleret lungepræparat. NEP-aktivitet (Figur 4A) blev bestemt ved spektrofotometrisk analyse ved hjælp af N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly som NEP-substrat efterfulgt af enalapriltiltilføjelse for at hæmme ACE. ACE-aktivitet (figur 4B) blev bestemt ved spektrofotometrisk analyse ved hjælp af enalapril som ACE-substrat efterfulgt af fosforamidontilsætning for at hæmme NEP. Da begge opløsninger indeholdt enalapril, blev ACE-aktiviteten beregnet som forskellen i fluorescens mellem prøver med og uden enalapril13.
Figur 5 viser effekten af lungebevarelse i kapillær permeabilitet (mKfc) gennem en periode på 24 timer i det isolerede lungeperfusionssystem i kaninmodellen. En kontrolgruppe (n = 6), der vurderes umiddelbart efter høsten havde en mKfc på 2,8 ± 0,8 (mL/min/cmH2O/g) standardfejl, derimod led den perfunderede lunge en progressiv stigning på mKfc-score 7,5 ± 1,4 (n = 6) ved 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) ved 12 timer og nåede 16,3 ± 2,5 (n = 6) efter 24 timers konservering13.
Figur 6 viser virkningen af forskellige tilsætningsstoffer i kapillær permeabiliteten af det isolerede lungeperfusionssystem under forskellige forhold. En pludselig trykforøgelse på 10 cmH2O genereres af en delvis obstruktion af venøs udstrømningen for at måle permeabiliteten af kapillærsengen gennem kapillærfiltreringskoefficienten (Kfc). For at måle Kfc var den gennemstrømningsrør, der går ud af venstre ventrikel til Krebs reservoiret, delvist fastspændt. Derefter blev den delvise klemme opretholdt i 3 min og sørgede for, at trykforøgelsen nåede 10 cmH2O. Fastspændingen blev frigivet, og det normale flow fortsatte. Denne manøvre blev registreret som en forøgelse af arterietrykket og en lungevægtforstørrelse. Denne sidste parameter betragtes som Kfc.
Figur 1: Diagram for det isolerede lungeperfusionssystem. Dette tal er ændret fra Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Koncentration af serotonin (5-HT) og monoaminoxidase (MAO), der er involveret i lungemetabolisme og vaskulær permeabilitet. Koncentrationen af (A) MAO og (B) 5-HT i en isoleret lunge bevaret ved 4 °C til 24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Frigivelseshastigheder for serotonin (5-HT) og monoaminoxidase (MAO). Frigivelsesraterne på 5-HT og MAO, udtrykt som en procentdel af startværdien, målt gennem 24 timer i et isoleret lungepræparat ved 4 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Enzymatisk aktivitet af neutral endopeptidase (NEP) og angiotensinkonverterende enzym (ACE). Enzymatisk aktivitet af (A) NEP og (B) ACE gennem tiden i en isoleret lunge bevaret ved 4 °C til 24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Effekt af lungebevarelse i kapillær permeabilitet (mKfc). Dataene viser effekten af lungebevarelse i kapillær permeabilitet (mKfc) gennem en periode på 24 timer i det isolerede lungeperfusionssystem i kaninmodellen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Virkningen af forskellige tilsætningsstoffer i kapillær permeabilitet. Virkningen af forskellige tilsætningsstoffer i kapillær permeabilitet af det isolerede lungeperfusionssystem under forskellige forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde viser et generelt billede af den isolerede lunge perfusion system, en væsentlig teknik i lungefysiologi forskning. Det isolerede lungeperfusionssystem giver en stor grad af alsidighed i dets anvendelser og gør det muligt at evaluere flere parametre, der er relevante i testningen af en bred vifte af hypoteser15. Et isoleret lungesystem er et værktøj med verdensomspændende tilstedeværelse, der i det sidste årti yderligere har fastslået sin relevans for organspecifikke evalueringer og også udvidet dets anvendelighed som en udvidelse af state-of-the-art teknologier og nye terapier, der involverer mesenkymale stamceller16 og CRISPR / Cas9 genom engineering17, blandt andre. Nuværende ex vivo lungeperfusion forskningsområder dækker stort set antiinflammatoriske strategier, ventilationsskadehåndtering og -forebyggelse, anti-afvisningsbehandling og anti-lungeødemydelse15.
Der kræves en korrekt samling af apparatet for at sikre korrekt datarekog. Som vist i figur 1 består hele systemet af et tryk vådt kammer fastgjort til et ventilationssystem og et perfusionssystem, der efterligner henholdsvis lungernes åndedræts- og kredsløbsfunktioner. Begge systemer er forbundet til et dataindsamlingssystem, der gør det muligt at tilse måleenheder, der kan skræddersys til behovene i enhver protokol. Den kirurgiske proces med høst af kardio-lungeblokken skal udføres hurtigt, helst af erfarent personale, for at undgå yderligere vævsskader for at opretholde lungen så intakt som muligt, så den fysiologiske funktion kan fortsætte uden yderligere interferens under forsøget. Systemet giver også mulighed for realtid perfusion prøve indsamling, der kan bruges til at bestemme effekten af visse molekyler i forskellige lungefunktioner (for eksempel heparin effekt på lungebevarelse).
For at opnå en korrekt fordeling af perfusionsstrømmen mellem lungefartøjer, nemlig kapillærer, bør zone 3-betingelser indkøbes. Zone 1 betingelser defineres som det område, hvor arterietrykket falder under alveolær trykket, typisk nærmer sig atmosfærisk tryk. Når dette sker, fladtrykt kapillærerne, hvilket gør blod eller perfusion til at flyde umuligt. Under normale omstændigheder kan zone 1 ikke eksistere, da arterielt tryk er nok til at garantere flowfordeling. Zone 1-betingelser kan dog forekomme, hvis arterietrykket falder, eller alveolærtrykket stiger (som det gør under positiv trykventilation). Zone 1 betingelser fører til en unperfused ventileret lunge, der er ude af stand til at udføre en gas udveksling. Under zone 2 betingelser, arteriel tryk er højere end alveolær tryk. Det venøse tryk forbliver dog under alveolærtrykket, hvilket resulterer i en perfusionsstrøm bestemt af forskellen mellem arterie- og alveolærtryk. Denne adfærd kan modelleret ved hjælp af en Starling modstand. Zone 3 betingelser bestemmes af forskellen mellem arteriel og venøs tryk. Stigningen i perfusionsstrømmen i zone 3 sker, fordi kapillærerne løsnede sig og konditionerer åbningen af et maksimalt antal lungekar.
Systemets enhed består af syv moduler: to analoge transducer forstærker moduler (TAM-A) udstyret med en analog LED bar graf signal til at overvåge dynamiske signaler (blodtryk, luftledningsstrøm, sammentrækning kraft, etc.), en digital transducer forstærker modul (TAM-D) med en digital numerisk skærm designet til at overvåge langsomt skiftende pulsatile signaler; en servo controller til perfusion modul (SCP), der arbejder sammen med TAM-A og TAM-D forstærkere til perfusion kontrol af isolerede organ perfusioner ved hjælp af peristaltisk pumpe, kan pumpen hastigheden indstilles i konstant tryktilstand eller manuelt styres gennem SCP; et ødembalancemodul (EBM), der måler lungevægten et ventilationskontrolmodul (VCM) til styring af positiv og trykventilation og et timertællermodul (TCM), der kan indstilles til at udløse VCM'en til at udføre dybe inspirationscyklusser.
Den høje globale forekomst af lunge- og åndedrætskærlighed og begrænsningerne af de nuværende terapeutiske muligheder tvinger en større efterspørgsel efter lungetransplantationer, da det fortsat er guldstandardbehandlingen for patienter med terminal lungesygdom18. Ex-vivo lungeperfusionssystemet repræsenterer en fremragende platform til at teste målrettede behandlinger i både grundforskning og klinisk forskning. På et klinisk niveau kan ex-vivo perfusionssystemet bruges til at evaluere transplantatvæv uden for kroppen, hvilket gør det muligt at teste det isolerede organ før transplantation, hvilket hjælper med at indsamle kliniske data for en mere præcis prognostisk om effektiviteten af transplantationen. Rationel brug af den isolerede lunge perfusion system kunne hjælpe med at optimere lungetransplantation kirurgi, hvilket gør dem til en sikrere og mere elektiv procedure. Den isolerede lungemodel er også nyttig i grundforskningen af avancerede diagnose- og terapiteknikker såsom instillation af mesenkymale stamceller og andre immunmedierede behandlinger; mange rapporter har vist potentialet i ex-vivo perfusion teknik som en platform til at gøre yderligere forskning i lungebevarelse i udviklingen af teknikker til at undgå iskæmi-reperfusion skade og lungeødem, forlænge organ levedygtighed15. Nogle fejlfinding trin og begrænsninger forbundet med den isolerede lunge model er primært den korte tid af denne teknik til mulig ødem generation induceret af lymfeafløb begrænsning samt den systemiske effekt af teknikken. Kapillær filtreringskoefficienten (Kfc) er et pålideligt kriterium til måling af funktionaliteten af konserveret lungevæv og fastslå omfanget af ødem gennem tiden. Der er ikke fundet nogen forskel mellem de manuelle og automatiske bestemmelser af Kfc19.
Som brugen af den isolerede lunge perfusion system populariserer og nye behandlinger ændre det kliniske landskab, ex-vivo perfusion teknik er ved at blive et valgfag valg til at forbedre patientens resultater i forskellige lungepatologier, samt at øge puljen af potentielle lungedonorer uden at gå på kompromis modtagerens sikkerhed, lovende en ny æra i lungebevarelse og lungetransplantation. Fremkomsten af Covid-19-pandemien og stigningen i KOL's udbredelse18,20 i den globale befolkning understreger behovet for yderligere grundforskning i lungefysiologi, lungebevarelse og lungetransplantation samt præklinisk forskning i nye behandlingsformer med henblik på translationel medicin. Desuden er ex-vivo kaninmodellen en tilgængelig og praktisk model til at uddanne beboere og studerende inden for lungeologi, især dem, der er involveret i thoraxkirurgi og ECMO. Ethvert laboratorium, der er involveret i respiratoriske eller thoracopulmoniske forskningsprotokoller, opfordres til at overveje det isolerede lungeperfusionssystem som en del af deres daglige værktøjer til deres eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Ph.D. Bettina Sommer Cervantes for hendes støtte i skrivning af dette manuskript, og Kitzia Elena Lara Safont for hendes støtte med illustrationerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
