Summary
Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å produsere bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk, ved hjelp av en konstruert stamme av Escherichia coli og krever bare standard laboratorieutstyr.
Abstract
Cellefritt genuttrykk gir biologiens kraft uten komplikasjoner av en levende organisme. Selv om mange slike genuttrykkssystemer eksisterer, er de fleste ganske dyre å kjøpe og / eller krever spesialutstyr og fin finpusset kompetanse for å produsere effektivt. Denne protokollen beskriver en metode for å produsere bakteriell cellefri lysat som støtter høye nivåer av genuttrykk, ved hjelp av bare standard laboratorieutstyr og krever minimal behandling. Metoden bruker en Escherichia coli-stamme som produserer en endolysin som ikke påvirker veksten, men som effektivt lyser en høstet cellepellet etter en enkel fryse-tining syklus. Den eneste videre behandlingen som kreves er en kort inkubasjon etterfulgt av sentrifugering for å fjerne autolysat av cellulært rusk. Dynamiske genkretser kan oppnås gjennom heterologt uttrykk for ClpX-protease i cellene før høsting. En E. coli-stamme som mangler lacZ-genet, kan brukes til høysensitive, cellefrie biosensing-applikasjoner ved hjelp av en kolorimetrisk eller fluorescerende avlesning. Hele protokollen krever så få som 8-9 timer, med bare 1-2 timer praktisk arbeid fra inokulasjon til ferdigstillelse. Ved å redusere kostnadene og tiden for å oppnå cellefri lysat, bør denne metoden øke overkommeligheten av cellefritt genuttrykk for ulike applikasjoner.
Introduction
Genuttrykk i cellefrie lysater har flere fordeler i forhold til å bruke levende celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifiseres biokjemisk og brukes under forhold som kan være skadelige for eller umulig å oppnå i levende celler. Genuttrykkskretser trenger ikke å kjempe eller konkurrere med vertsbiologiske prosesser, og testing av nye genetiske kretser er så enkelt som å legge til DNA. Av disse grunnene har cellefritt genuttrykk funnet ulike bruksområder, fra biosensorer5,6 til raskt prototyping av syntetiske genkretser7,8 til utvikling av kunstige celler9. De fleste cellefrie genuttrykk bruker cellulære lysater som har blitt svært bearbeidet, og som vanligvis krever lange og komplekse protokoller, spesialutstyr og/eller sensitive trinn som kan føre til betydelig variasjon mellom brukere og partier10,11.
Dette dokumentet beskriver en enkel, effektiv metode for å produsere cellefri lysat som krever minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er avhengig av E. coli-celler som er konstruert for å lyse etter en enkel fryse-tine syklus. Cellene uttrykker en endolysin fra phage lambda som forringer celleveggen. Etter hvert som cellene vokser, forblir denne endolysinen i cytoplasma, beslaglagt fra celleveggen. Imidlertid forstyrrer en enkel fryse-tining syklus den cytoplasmatiske membranen, frigjør endolysin i periplasma, hvor den forringer celleveggen, noe som resulterer i rask cellelys. Protokollen kan fullføres med bare noen få timers praktisk arbeid og krever bare en fryser, en sentrifuge som er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheter kan brukes med mer forsiktighet for ikke å forstyrre pellet), en virvelblander og en enkel bufferløsning. Funksjonell lysat kan til og med produseres ved å fryse tørking av cellene og rehydrere dem in situ. Denne metoden produserer imidlertid lysater med lavere aktivitet, antagelig på grunn av gjenværende celleavfall.
Lysatene er svært aktive for cellefritt genuttrykk, og de kan forbedres på forskjellige måter avhengig av sluttbruken. Frekvensen av proteinsyntese kan økes ytterligere ved å konsentrere lysatet ved hjelp av standard spinnkonsentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mot nedbrytning ved å tilsette renset GamS-protein. Proteinforringelse, som er nødvendig for mer kompleks kretsdynamikk som oscillasjon, kan oppnås ved å uttrykke en ClpX-heksamer i den autolyserende produserende stammen13. Til slutt aktiveres LacZ-baserte visuelle avlesninger ved hjelp av en autolysert belastning som mangler lacZ. Totalt sett produserer denne metoden svært aktiv cellefri lysat som passer for et bredt spekter av applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjør medier og buffere.
- Forbered 2xYTPG medium.
- Bland 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumfosfatmonobasisk, 13,93 g kaliumfosfatdibasisk og deionisert vann til 2 L.
- Autoklav på væskesyklus med en eksponeringstid på 30 min14.
- Til 400 ml 2xYTP-medier fra 1,1,2 tilsettes 7,2 g D-glukose (dekstrose) og bland til det er oppløst.
- Filtrer steriliser gjennom et filter på 0,2 μm.
- Klargjør S30A-buffer.
- Bland Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM endelig konsentrasjon), kaliumglutamat (60 mM finale) og magnesiumglutamat (14 mM finale).
- Juster pH til 7,7 ved hjelp av 10 M KOH.
- Klargjør løsning 1 (se tabell 1).
- Resuspend 4-(2-hydroksyetyl)-1- piperazineethanesulfonsyre (HEPES) i 2 ml vann.
- Juster pH til 8.0 ved hjelp av KOH.
- Legg til alle andre komponenter fra tabell 1.
- Juster pH til 7,6 ved hjelp av 10 M KOH. Filtersterilisere.
- Klargjør 2,5x forblandingsløsning (se tabell 2).
- Bland alle komponentene i tabell 2.
- Juster pH til 7,5 ved hjelp av KOH.
- Aliquot og fryse ved -80 °C.
MERK: En 20 μL reaksjon bruker 8,9 μL premix.
2. Forbered celler.
- Strekk autolysatcellene på LB agarplater som inneholder 50 μg/ml ampicillin ved hjelp av en inokulerende sløyfe og vokse ved 37 °C (se note 1).
- Velg en enkelt koloni inn i en startkultur av LB / ampicillin medium ved hjelp av en pipet tips og vokse ved 37 °C over natten.
- Inokuler 400 ml 2xYTPG medium som inneholder 50 μg/ml ampicillin med 400 μL startkultur, og vokse ved 37 °C i en 1 L Erlenmeyer-kolbe, risting ved 300 o/min.
- Mål kulturens optiske tetthet med jevne mellomrom ved 600 nm (OD600) ved hjelp av et spektrofotometer for å lese en optisk cuvette med en banelengde på 1 cm. Når OD600 overstiger 1, begynner du å fortynne kulturen 5 ganger før målinger for å sikre at målingene forblir innenfor det lineære området til et typisk laboratoriespektrofotometer. Fortsett å vokse cellene til den 5 ganger fortynnede kulturen når OD600 av 0,3 (tilsvarer en kultur OD600 av 1,5).
3. Forbered lysatet.
- Klargjør S30A-buffer supplert med 2 mM dithiothreitol (DTT). Bland 3 ml S30A buffer med 6 μL DTT lagerløsning ved 1 M. Plasser på is for bruk i trinn 3.7.
- Høst cellene ved sentrifugering ved 1800 × g i 15 min ved romtemperatur.
- Kast supernatanten ved å helle den av og bruke en pipet for å fjerne eventuell gjenværende væske.
- Resuspend pellet i 45 ml kald (4-10 °C) S30A buffer ved hjelp av en virvelblander.
- Vei et tomt 50 ml sentrifugerør, overfør cellene til det, og gjenta trinn 3,2-3,3 for å vaske cellene.
- Vei pelletsen, trekk vekten av et tomt 50 ml rør. Sørg for å forsiktig aspirere eventuelle gjenværende supernatanter for å sikre en nøyaktig måling av pelletsvekt.
MERK: Et typisk utbytte er ~ 1,3 g cellepellet fra 400 ml produksjonskultur. - Tilsett 2 volumer kald S30A buffer supplert med 2 mM dithiothreitol, det vil si 2 ml buffer for hver 1 g cellepellet, og resuspender cellene ved kraftig virvelblanding.
- Frys cellene. Plasser 50 ml-røret som inneholder cellene, i en -20 °C eller -80 °C fryser til pelletsen er grundig frosset.
MERK: Frysetrinnet er et godt stoppested for dagen. - Tine cellene i et vannbad med romtemperatur.
- Virvel kraftig i 2-3 min.
- Inkuber ved 37 °C i 45 minutter med risting ved 300 o/min.
- Fjern prøven av tungt cellulært rusk ved sentrifugering i gjennomsiktige sentrifugerør ved 30.000 × g i 45 minutter ved 4 °C.
MERK: Hvis en sentrifuge som er i stand til 30 000 x g ikke er tilgjengelig, sentrifugerer i 45 min ved 21 000 × g, og vær ekstra forsiktig i trinn 3.13, da pelletsen blir mindre kompakt. - Overfør forsiktig supernatanten til et nytt rør med en pipet, og unngå å forstyrre pellet så mye som mulig. Hvis det overførte supernatantet er forurenset med materiale fra pellets, gjentar du forrige trinn.
- Overfør supernatanten til 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuger igjen ved 21 000 × g (eller maksimal hastighet på en sentrifuge på bordplaten) i 5 minutter.
- Aliquot den ryddede autolysate inn i de ønskede volumene, forsiktig unngå gjenværende pellet, og fryse ved -80 °C eller bruke umiddelbart.
MERK: En enkelt 20 μL reaksjon bruker 8 μL autolysat.
4. Cellefritt genuttrykk
MERK: Autolysatet er nå klart for ønsket sluttbruk. Følgende er et eksempel på en standardprotokoll for cellefritt genuttrykk.
- For en 20 μL reaksjon, bland på is 8 μL autolysat og 8,9 μL premix. Se MERKNAD på slutten av protokollseksjonen om optimalisering av magnesiumglutamat og PEG 8000-konsentrasjoner.
- Tilsett DNA (f.eks. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 i en endelig konsentrasjon på 8 nM), andre reagenser og vann til 20 μL.
- Plasser reaksjonen i en 384-brønns mikroplate og mål fluorescenstiden og/eller endepunktene ved hjelp av en plateleser. For grønt fluorescerende protein (GFP) bruk en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en utslippsbølgelengde på 520 nm.
5. Protokollendringer
MERK: Følgende endringer i protokollen gjør det mulig å betjene andre programmer.
- Cellefritt genuttrykk ved hjelp av lineære DNA-maler
- Utfør trinnene i avsnitt 4, og supplere reaksjonen med 2,2 μM renset GamS-protein (uttrykt og renset som beskrevet12) før tilsetning av det lineære DNA.
- Cellefritt genuttrykk som omfatter proteinforringelse
- I trinn 2.1 bruker du automatisk celler som inneholder plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (se Materialtabellen). I alle vekstmedier inkluderer i tillegg 34 μg / ml kloramfenikol.
- I trinn 2.3, inkludere 40 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) i vekstmediet for å indusere uttrykk fra plasmid.
- Gjenta trinn 3.2-3.4 (vasking) to ekstra ganger (for totalt tre vasker) for å sikre fullstendig fjerning av kloramfenikol, som er en oversettelsesinhibitor. For de to første vaskene (trinn 3.4) erstatter du S30A-bufferen med fosfatbufret saltvann (pH 7.4).
- I trinn 4.2, supplement med en ekstra 3 mM ATP (lagt fra en lagerløsning på 100 mM ATP i vann, pH 7,2) og 4,5 mM magnesiumglutamat (ved hjelp av en 1 M lagerløsning i vann) (endelige konsentrasjoner) for å kompensere for høy ATP-bruk av ClpXP, samt chelation av magnesium ved den ekstra ATP.
- Cellefritt genuttrykk ved hjelp av LacZ-baserte avlesninger (inkludert kolorimetrisk)
- I trinn 2.1 bruker du automatisk celler som ikke uttrykker LacZ (se materialtabellen).
- Alternativt kan du forberede lysate direkte fra frysetørkede celler.
- Utfør alle trinn fra 1.1 til 3.7.
- Bland 8 μL cellefjæring med 8,9 μL premix.
- Tilsett plasmid DNA (om ønskelig), andre tilpassede reagenser og vann for å nå et endelig volum på 20 μL.
- Overfør reaksjonen til en 384-brønns mikroplate og tørk den.
MERK: Frysetørkede prøver kan lagres i opptil en uke og muligens lenger. - For å starte reaksjonen, rehydrer den med 18 μL deionisert vann supplert med ønsket DNA eller andre reagenser.
- Følg fluorescensdynamikken i en plateleser.
MERK 1: Autolysate celler er designet for å lyse på en fryse-tine syklus, så det er spesielt viktig å bruke kryopreotektant når du lager frosne lagre. Vi frøs aksjer i 24% wt / vol glyserol og lagret dem ved -80 °C.
MERK 2: Magnesiumioner og PEG 8000 er avgjørende for lysatytelsen. Basen 2,5x premix, basert på tidligere publiserte data, inneholder henholdsvis 6 mM magnesiumglutamat og 4,8% wt/vol PEG 8000, som blir henholdsvis 2,4 mM og 1,9%, i den endelige reaksjonen. Autolysatet som er utarbeidet med protokollen her, fungerer vanligvis best med ytterligere 5 mM Mg-glutamat og 1,5% PEG 8000 i den endelige reaksjonen. Dette kan imidlertid optimaliseres i området med ytterligere 0-10 mM Mg glutamat og ytterligere 0-3% PEG 8000 (sammenlignet med basisforblandingen). For å forberede forblandingen med anbefalt ekstra 5 mM Mg-glutamat og 1,5% PEG 8000 (endelige konsentrasjoner), bland 380 μL premix med 4,75 μL magnesiumglutamat ved 1 M og 36,1 μL PEG 8000 ved 40% vekt / volum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater kan observeres ved å bruke automatisk til å uttrykke GFP fra en konstituativt uttrykke plasmid, her pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, og registrere et tidsforløp for GFP fluorescens i en plateleser (Figur 1B). En fortynningsserie av plasmid DNA fant sterkt uttrykk selv ved 1 nM DNA. Sammenlignet med et kommersielt tilgjengelig lysat, kan autolysatet gi større total avkastning og oppnådde en større maksimal produksjonsrate, beregnet som tidsderivat for GFP-tidsforløpet (Figur 1C,D). Hvis du vil ha flere resultater ved hjelp av denne metoden, se Didovyk et al.12. Denne protokollen har relativt få feilpunkter. Suboptimale resultater kan imidlertid oppnås hvis autolysatet ikke er tilstrekkelig ryddet for celleavfall. Optimale resultater kan også kreve optimalisering av konsentrasjonene PEG-8000 og Mg2+ for hvert lysatparti (se note 2).
Figur 1: Representative resultater. (A) Visuell representasjon av protokollen. (B) Eksempel på tidsforløp for GFP-uttrykk fra pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 i en fryse-tine automatisk. Maksimal GFP-produksjon (C) og maksimal produksjonsrate (D) av autolysert fremstilt i 2 forskjellige laboratorier av 2 forskjellige forskere, ved hjelp av en 30.000 x g sentrifuge (blå og oransje) eller en 20.000 x g sentrifuge (lilla), sammenlignet med en kommersiell referanselysat (oransje, MYtxtl-70-960M fra MYcroyarra). Alle feilfelt betyr absolutt feil i to tekniske replikeringer. Dette tallet er endret fra 12. Opphavsrett 2017 American Chemical Society. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning 1: Tilsett vann til 4 ml totalt | |
| Navn | Vekt (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| leir | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Flinsyre | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidin | 8.1 |
| tRNAer | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabell 1: Løsning 1. Komponenter i løsning 1.
| 2,5x forblanding | |
| Reagent | Volum (μL) |
| Aminosyreblanding som inneholder 24 mM hver, bortsett fra leucin som er på 20 mM | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) ved 100 mM | 100 |
| Magnesiumglutamat ved 1 M | 25 |
| PEG-8000 ved 40 % wt/vol | 500 |
| Kaliumglutamat ved 2 M | 303 |
| Løsning 1 (se tabell 1) | 714.3 |
Tabell 2: Premix. Komponenter i forblandingsløsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som beskrives her gir svært aktiv bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk. Nøkkelen er å bruke celler som bærer plasmid pAD-LyseR, som uttrykker lambda phage endolysin cytosolisk. Disse cellene er forsterket for å lyse seg ved permeabilisering av den indre membranen, slik at endolysintilgangen til celleveggen, som metoden oppnår gjennom en enkel fryse-tine syklus. Fordi cellene effektivt lyser seg selv, blir produktet referert til som autolysat. Etter at cellene har lysnet, er de eneste gjenværende trinnene inkubasjon og sentrifugering for å fjerne autolysat av cellulært rusk.
Sammenlignet med andre metoder for å produsere bakteriell lysat, er denne tilnærmingen spesielt enkel og rask, men den ofrer ikke lysatets kvalitet. Protokollen kan fullføres i 8-9 timer etter å ha inokulert produksjonskulturen, med bare 1-2 timer praktisk arbeidskraft. Det eneste anbefalte utstyret som ikke er helt standard for molekylærbiologiske laboratorier, er en sentrifuge som er i stand til å oppnå 30.000 × g. Autolysat av sammenlignbar kvalitet kan imidlertid produseres selv med en sentrifuge med lavere hastighet (Figur 1C, D); brukeren må bare være mer forsiktig med å fjerne lysatet fra pellet, kanskje etterlate litt mer væske for å sikre rene prøver. Denne enkelheten er ikke bare et spørsmål om bekvemmelighet; mindre kompliserte protokoller har en tendens til å gi mer reproduserbare resultater, med mindre variasjon når de utføres med forskjellige hender. Modifikasjonen presentert i trinn 5.4, der celler frysetørkes sammen med alle andre reagenser, presenterer en enda enklere protokoll, men med reduserte proteinproduksjonsutbytter. Spesielt i denne modifikasjonen hoppes sentrifugeringstrinnene for å fjerne lysatet av cellulært rusk, noe som ytterligere reduserer behandlingsarbeid; De resterende ruskene reduserer imidlertid uttrykket fralysatet 12.
I de senere år har mange tilnærminger til å produsere cellefri lysat blitt publisert, oppsummert nylig av Cole et al.15. Disse studiene har utforsket ulike strategier for celletype, vekstforhold, lysismetoder og etterbehandling. De fleste andre metoder for lysis har krevd spesialisert utstyr som fransk presse, homogenisator, perle beater eller soniker. Fujiwara og Doi utelot dette utstyret til fordel for en fryse-tine syklus som ligner den som er beskrevet her, bortsett fra at de gjorde cellene utsatt for lysis ved å behandle dem med lysozyme i stedet for å uttrykke en endolysin16. Selv om dette er omtrent like enkelt som den som er beskrevet her, må de lysozymebehandlede cellene vaskes mens de er i sin skjøre tilstand uten å forstyrre dem for tidlig, noe som kan kreve eksperimentell finesse og introdusere en kilde til variasjon.
I tillegg til lysat krever cellefritt genuttrykk en premixløsning som inneholder energikilder, RNA og proteinmonomerer og andre små molekyler. Premix oppskriften ble beskrevet og optimalisert tidligere17, med noen få modifikasjoner. Premixen som ble brukt her inneholdt omtrent 4 ganger høyere konsentrasjoner av aminosyrer, samt ekstra magnesiumglutamat og PEG 8000 som tilsvarer endelige reaksjonskonsentrasjoner på henholdsvis 7,5 mM og 3,5% vekt / volum. Optimale resultater kan kreve justering av de ekstra magnesiumglutamat- og PEG 8000-konsentrasjonene for hver nye gruppe lysat, selv om konsentrasjonene ovenfor konsekvent ga gode resultater (se note 2). Unike bruksområder kan kreve reoptimizing disse konsentrasjonene, for eksempel når du bruker ClpX-supplert lysat13.
En standard E. coli-stamme for produksjon av cellefri lysat er BL21-Gold (DE3). Et derivat av disse cellene som inneholder autolyseplasmid pAD-LyseR har blitt avsatt i et stamme- og plasmidlager (se materialtabellen). Også tilgjengelig er et derivat som mangler genomisk lacZ for å dramatisk redusere bakgrunnen for kretser som bruker LacZ-basert utgang og et uttrykk plasmid pAD-GamS som skal brukes til rensing av GamS-proteinet som kan beskytte lineært DNA mot nedbrytning. Disse cellestammene og plasmidene bør være nyttige for en rekke bruksområder i cellefritt genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H. er medgrunnlegger av GenCirq Inc, som fokuserer på kreftterapeutikk. Han sitter i styret og har egenkapital i GenCirq.
Acknowledgments
Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for vennlig å gi plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for vennlig å gi en høyhastighets kjølesentrifuge. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og ble delvis støttet av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
