Summary
Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.
Abstract
L'espressione genica senza cellule offre il potere della biologia senza le complicazioni di un organismo vivente. Sebbene esistano molti di questi sistemi di espressione genica, la maggior parte sono piuttosto costosi da acquistare e / o richiedono attrezzature speciali e competenze finemente affinate per produrre in modo efficace. Questo protocollo descrive un metodo per produrre lisato batterico privo di cellule che supporta alti livelli di espressione genica, utilizzando solo apparecchiature di laboratorio standard e richiedendo un'elaborazione minima. Il metodo utilizza un ceppo di Escherichia coli che produce un'endolisina che non influisce sulla crescita, ma che lisa in modo efficiente un pellet cellulare raccolto seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. L'unica ulteriore elaborazione richiesta è una breve incubazione seguita da centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari. I circuiti genici dinamici possono essere ottenuti attraverso l'espressione eterologa della proteasi ClpX nelle cellule prima della raccolta. Un ceppo di E. coli privo del gene lacZ può essere utilizzato per applicazioni di biorilevamento ad alta sensibilità e prive di cellule utilizzando una lettura colorimetrica o fluorescente. L'intero protocollo richiede solo 8-9 ore, con solo 1-2 ore di lavoro pratico dall'inoculazione al completamento. Riducendo i costi e i tempi per ottenere lisato senza cellule, questo metodo dovrebbe aumentare l'accessibilità economica dell'espressione genica senza cellule per varie applicazioni.
Introduction
L'espressione genica nei lisati privi di cellule ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule vive1,2,3,4. I lisati possono essere facilmente modificati biochimicamente e utilizzati in condizioni che potrebbero essere dannose o impossibili da ottenere nelle cellule vive. I circuiti di espressione genica non devono competere o competere con i processi biologici dell'ospite e testare nuovi circuiti genetici è semplice come aggiungere DNA. Per questi motivi, l'espressione genica cell-free ha trovato varie applicazioni, dai biosensori5,6 alla prototipazione rapida di circuiti genici sintetici7,8 allo sviluppo di cellule artificiali9. La maggior parte dell'espressione genica senza cellule utilizza lisati cellulari che sono stati altamente elaborati, generalmente richiedendo protocolli lunghi e complessi, attrezzature specializzate e / o passaggi sensibili che possono portare a variazioni significative tra utenti e lotti10,11.
Questo documento descrive un metodo semplice ed efficiente per la produzione di lisato senza cellule che richiede un'elaborazione e un'esperienza minime (Figura 1A)12. Il metodo si basa su cellule di E. coli che sono progettate per lisare seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Le cellule esprimono un'endolisina dal fago lambda che degrada la parete cellulare. Mentre le cellule crescono, questa endolisina rimane nel citoplasma, sequestrata dalla parete cellulare. Tuttavia, un semplice ciclo di congelamento-disgelo interrompe la membrana citoplasmatica, rilasciando l'endolisina nel periplasma, dove degrada la parete cellulare, con conseguente rapida lisi cellulare. Il protocollo può essere completato con poche ore di lavoro pratico e richiede solo un congelatore, una centrifuga capace di 30.000 × g (per risultati ottimali; velocità inferiori possono essere utilizzate con maggiore attenzione per non disturbare il pellet), un miscelatore a vortice e una semplice soluzione tampone. Il lisato funzionale può anche essere prodotto liofilizzando le cellule e reidratandole in situ. Tuttavia, questo metodo produce lisati con attività inferiore, presumibilmente a causa dei detriti cellulari rimanenti.
I lisati sono altamente attivi per l'espressione genica senza cellule e possono essere migliorati in vari modi a seconda dell'uso finale. La velocità di sintesi proteica può essere ulteriormente aumentata concentrando il lisato utilizzando concentratori di spin standard. Il DNA lineare può essere protetto dalla degradazione aggiungendo proteine GamS purificate. La degradazione delle proteine, necessaria per dinamiche circuitali più complesse come l'oscillazione, può essere ottenuta coesprimendo un esamere ClpX nel ceppo13produttore di autolizzato. Infine, le letture visive basate su LacZ sono abilitate utilizzando un ceppo autolizzato privo di lacZ. Nel complesso, questo metodo produce lisato privo di cellule altamente attivo che è adatto per una vasta gamma di applicazioni.
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Protocol
1. Preparare supporti e buffer.
- Preparare 2xYTPG medio.
- Mescolare 62 g di polvere 2xYT, 5,99 g di fosfato di potassio monobasico, 13,93 g di fosfato di potassio bibasico e acqua deionizzata a 2 L.
- Autoclave su ciclo liquido con un tempo di esposizione di 30 min14.
- A 400 mL di 2xYTP media da 1.1.2, aggiungere 7,2 g di D-glucosio (destrosio) e mescolare fino a quando non si scioglie.
- Filtrare-sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Preparare il buffer S30A.
- Mescolare Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM di concentrazione finale), glutammato di potassio (60 mM finale) e glutammato di magnesio (14 mM finale).
- Regolare il pH a 7,7 utilizzando 10 M KOH.
- Preparare la soluzione 1 (vedere Tabella 1).
- Sospendere l'acido 4-(2-idrossietil)-1- piperazineetanosolfonico (HEPES) in 2 ml di acqua.
- Regolare il pH a 8,0 usando KOH.
- Aggiungere tutti gli altri componenti dalla Tabella 1.
- Regolare il pH a 7,6 utilizzando 10 M KOH. Filtro-sterilizzare.
- Preparare una soluzione premiscelata 2,5x (vedere Tabella 2).
- Mescolare tutti i componenti nella Tabella 2.
- Regolare il pH a 7,5 utilizzando KOH.
- Aliquota e congelamento a -80 °C.
NOTA: una reazione da 20 μL utilizza 8,9 μL di premiscela.
2. Preparare le cellule.
- Strisciare le cellule autolizzate su piastre di agar LB contenenti ampicillina da 50 μg/mL utilizzando un ciclo inoculante e crescere a 37 °C (vedere Nota 1).
- Scegliere una singola colonia in una coltura iniziale di LB/ampicillina media usando una punta di pipetta e crescere a 37 °C durante la notte.
- Inoculare 400 mL di terreno 2xYTPG contenente ampicillina da 50 μg/mL con 400 μL di coltura iniziale e crescere a 37 °C in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, agitando a 300 giri/min.
- Misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro per leggere una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di 1 cm. Quando l'OD600 supera 1, iniziare a diluire la coltura 5 volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio. Continuare a far crescere le cellule fino a quando la coltura diluita 5 volte raggiunge OD600 di 0,3 (corrispondente a una coltura OD600 di 1,5).
3. Preparare il lisato.
- Preparare il tampone S30A integrato con 2 mM di ditiotreitolo (DTT). Miscelare 3 mL di tampone S30A con 6 μL di soluzione madre DTT a 1 M. Posto su ghiaccio per l'uso nel passaggio 3.7.
- Raccogliere le cellule centrifugando a 1800 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante versandolo e usando un pipetto per rimuovere il liquido rimanente.
- Risospendare il pellet in 45 mL di tampone freddo (4-10 °C) S30A utilizzando un miscelatore a vortice.
- Pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 ml, trasferire le celle al suo interno e ripetere i passaggi 3.2-3.3 per lavare le celle.
- Pesare il pellet, sottraendo il peso di un tubo vuoto da 50 ml. Assicurarsi di aspirare accuratamente qualsiasi surnatante rimanente per garantire una misurazione accurata del peso del pellet.
NOTA: Una resa tipica è di ~ 1,3 g di pellet cellulare da 400 ml di coltura di produzione. - Aggiungere 2 volumi di tampone S30A freddo integrato con 2 mM di ditiotreitolo, cioè 2 mL di tampone per ogni 1 g di pellet cellulare, e risospesciare le cellule mescolando vigorosamente il vortice.
- Congelare le cellule. Posizionare il tubo da 50 ml contenente le celle in un congelatore a -20 °C o -80 °C fino a quando il pellet non è completamente congelato.
NOTA: il passaggio di congelamento è un buon punto di arresto per la giornata. - Scongelare le celle in un bagno d'acqua a temperatura ambiente.
- Vortice vigoroso per 2-3 min.
- Incubare a 37 °C per 45 minuti con agitazione a 300 giri/min.
- Eliminare il campione da detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifugati trasparenti a 30.000 × g per 45 minuti a 4 °C.
NOTA: se non è disponibile una centrifuga capace di 30.000 x g, centrifugare per 45 minuti a 21.000 × ge prestare maggiore attenzione nel passaggio 3.13, poiché il pellet sarà meno compatto. - Trasferire con cura il surnatante in un nuovo tubo con una pipetta, evitando di disturbare il più possibile il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale dal pellet, ripetere il passaggio precedente.
- Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 mL e centrifugare ancora una volta a 21.000 × g (o la velocità massima di una centrifuga da tavolo) per 5 minuti.
- Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati, evitando accuratamente qualsiasi pellet rimanente, e congelare a -80 °C o utilizzare immediatamente.
NOTA: Una singola reazione da 20 μL utilizza 8 μL di autolizzato.
4. Espressione genica senza cellule
NOTA: l'autolizzato è ora pronto per qualsiasi uso finale desiderato. Di seguito è riportato un protocollo standard di esempio per l'espressione genica senza cellule.
- Per una reazione di 20 μL, mescolare su ghiaccio 8 μL di autolizzato e 8,9 μL di premiscela. Vedi NOTA alla fine della sezione del protocollo riguardante l'ottimizzazione delle concentrazioni di glutammato magnesio e PEG 8000.
- Aggiungere DNA (ad esempio, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentrazione finale di 8 nM), qualsiasi altro reagente e acqua a 20 μL.
- Posizionare la reazione in una micropiastra a 384 pozzetti e misurare il decorso temporale di fluorescenza e/o gli endpoint utilizzando un lettore di piastre. Per la proteina fluorescente verde (GFP), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.
5. Modifiche del protocollo
Nota : le seguenti modifiche del protocollo consentono di servire altre applicazioni.
- Espressione genica senza cellule utilizzando modelli di DNA lineare
- Eseguire i passaggi di cui al paragrafo 4, integrando la reazione con una proteina GamS purificata da 2,2 μM (espressa e purificata come descritto12)prima dell'aggiunta del DNA lineare.
- Espressione genica priva di cellule che incorpora la degradazione proteica
- Nel passaggio 2.1, utilizzare cellule autolizzate contenenti il plasmide pACYC-FLAG-dN6-His (vedere la tabella dei materiali). In tutti i mezzi di crescita, includono anche 34 μg / mL di cloramfenicolo.
- Nella fase 2.3, includere 40 μM isopropil β-D-1-tiogalattopoliranoside (IPTG) nel mezzo di crescita per indurre l'espressione dal plasmide.
- Ripetere i passaggi 3.2-3.4 (lavaggio) altre due volte (per un totale di tre lavaggi) per garantire la completa rimozione del cloramfenicolo, che è un inibitore della traduzione. Per i primi due lavaggi (fase 3.4), sostituire il tampone S30A con soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7.4).
- Nel passaggio 4.2, integrare con un ulteriore 3 mM di ATP (aggiunto da una soluzione madre di 100 mM di ATP in acqua, pH 7,2) e 4,5 mM di glutammato di magnesio (utilizzando una soluzione madre da 1 M in acqua) (concentrazioni finali) per compensare l'elevato uso di ATP da parte di ClpXP, nonché la chelazione del magnesio da parte dell'ATP aggiuntivo.
- Espressione genica senza cellule mediante letture basate su LacZ (inclusa colorimetrica)
- Nel passaggio 2.1, utilizzare celle autolizzate che non esprimono nativamente LacZ (vedere la tabella dei materiali).
- In alternativa, preparare il lisato direttamente dalle cellule liofilizzate.
- Eseguire tutti i passaggi dalla versione 1.1 alla versione 3.7.
- Miscelare 8 μL di sospensione cellulare con 8,9 μL di premiscela.
- Aggiungere DNA plasmidico (se lo si desidera), altri reagenti personalizzati e acqua per raggiungere un volume finale di 20 μL.
- Trasferire la reazione su una micropiastra a 384 pozzetti e liofilizzarla.
NOTA: i campioni liofilizzati possono essere conservati per un massimo di una settimana e possibilmente più a lungo. - Per iniziare la reazione, reidratarla con 18 μL di acqua deionizzata integrata con qualsiasi DNA desiderato o altri reagenti.
- Segui le dinamiche di fluorescenza in un lettore di lastre.
NOTA 1: Le cellule autolizzate sono progettate per lisare in un ciclo di congelamento-disgelo, quindi è particolarmente importante utilizzare il crioprotettore quando si producono scorte congelate. Abbiamo congelato le scorte al 24% di glicerolo wt/vol e le abbiamo conservate a -80 °C.
NOTA 2: Gli ioni di magnesio e PEG 8000 sono fondamentali per le prestazioni del lisato. La premiscela di base 2,5x, basata su dati precedentemente pubblicati, contiene 6 mM di glutammato di magnesio e 4,8% wt/vol PEG 8000, che diventano rispettivamente 2,4 mM e 1,9%, nella reazione finale. L'autolizzato preparato con il protocollo qui in genere funziona meglio con un ulteriore 5 mM Mg-glutammato e 1,5% PEG 8000 nella reazione finale. Tuttavia, questo può essere ottimizzato nell'intervallo di un ulteriore glutammato 0-10 mM Mg e un ulteriore 0-3% PEG 8000 (rispetto alla premiscela di base). Per preparare la premiscela con i raccomandati 5 mM di Mg-glutammato e 1,5% di PEG 8000 (concentrazioni finali), mescolare 380 μL di premiscela con 4,75 μL di glutammato di magnesio a 1 M e 36,1 μL di PEG 8000 al 40% peso/volume.
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Representative Results
I risultati rappresentativi possono essere osservati utilizzando l'autolizzato per esprimere GFP da un plasmide che esprime costitutivamente, qui pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, e registrando un corso temporale di fluorescenza GFP in un lettore di piastre (Figura 1B). Una serie di diluizione di DNA plasmidico ha trovato una forte espressione anche a 1 nM di DNA. Rispetto ad un lisato disponibile in commercio, l'autolizzato può produrre una maggiore resa totale e raggiungere un maggiore tasso massimo di produzione, calcolato come derivato temporale del corso temporale GFP(Figura 1C,D). Per ulteriori risultati utilizzando questo metodo, vedere Didovyk et al.12. Questo protocollo ha relativamente pochi punti di errore; tuttavia, si potrebbero ottenere risultati non ottimali se l'autolizzato non è sufficientemente eliminato dai detriti cellulari. Risultati ottimali possono anche richiedere l'ottimizzazione delle concentrazioni di PEG-8000 e Mg2+ per ogni lotto di lisato (vedere Nota 2).
Figura 1: Risultati rappresentativi. (A) Rappresentazione visiva del protocollo. (B) Esempio di decorso temporale dell'espressione GFP da pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 in un autolizzato freeze-thaw. Produzione massima di GFP(C)e massima di produzione(D)di autolizzato preparati in 2 diversi laboratori da 2 diversi ricercatori, utilizzando una centrifuga da 30.000 x g (blu e arancione) o una centrifuga da 20.000 x g (viola), rispetto a un lisato di riferimento commerciale (arancione, MYtxtl-70-960M di MYcroarray). Tutte le barre di errore sono errori assoluti medi di due repliche tecniche. Questa cifra è stata modificata da 12. Copyright 2017 American Chemical Society. Abbreviazione: GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione 1: aggiungere acqua a 4 ml totali | |
| Nome | Peso (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| accampamento | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP · | 28.4 |
| Acido folinico | 1.9 |
| GTP · | 47.6 |
| HEPES · | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidina | 8.1 |
| tRNA | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabella 1: Soluzione 1. Componenti della soluzione 1.
| 2.5x Premix | |
| Reagente | Volume (μL) |
| Miscela di aminoacidi contenente 24 mM ciascuno, ad eccezione della leucina che è a 20 mM | 2500 |
| ditiotreitolo (DTT) a 100 mM | 100 |
| Glutammato di magnesio a 1 M | 25 |
| PEG-8000 al 40% wt/vol | 500 |
| Glutammato di potassio a 2 M | 303 |
| Soluzione 1 (vedere tabella 1) | 714.3 |
Tabella 2: Premiscela. Componenti della soluzione premiscelata.
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Discussion
Il protocollo qui descritto produce lisato batterico altamente attivo per l'espressione genica senza cellule. La chiave è utilizzare cellule portatrici del plasmide pAD-LyseR, che esprime citosolicamente l'endolisina del fago lambda. Queste cellule vengono potenziate per lisarsi dopo la permeabilizzazione della membrana interna, consentendo all'endolisina l'accesso alla parete cellulare, che il metodo ottiene attraverso un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Poiché le cellule si lisano efficacemente, il prodotto viene definito autolizzato. Dopo che le cellule sono state lisate, gli unici passaggi rimanenti sono l'incubazione e la centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari.
Rispetto ad altri metodi per la produzione di lisato batterico, questo approccio è notevolmente semplice e rapido, ma non sacrifica la qualità del lisato. Il protocollo può essere completato in 8-9 ore dopo aver inoculato la coltura di produzione, con solo 1-2 ore di lavoro pratico. L'unica apparecchiatura consigliata che non è del tutto standard per i laboratori di biologia molecolare è una centrifuga in grado di raggiungere 30.000 × g. Tuttavia, l'autolizzato di qualità comparabile può essere prodotto anche con una centrifuga a velocità inferiore(Figura 1C,D); l'utente dovrebbe solo stare più attento a rimuovere il lisato dal pellet, magari lasciando dietro di sé un po ' più di liquido per garantire campioni puliti. Questa semplicità non è solo una questione di convenienza; protocolli meno complicati tendono a produrre risultati più riproducibili, con meno variazioni se eseguiti con mani diverse. La modifica presentata nel passaggio 5.4, in cui le cellule vengono liofilizzate insieme a tutti gli altri reagenti, presenta un protocollo ancora più semplice, sebbene con rese di produzione proteica ridotte. In particolare, in questa modifica, le fasi di centrifugazione per eliminare il lisato dai detriti cellulari vengono saltate, il che riduce ulteriormente il lavoro di lavorazione; tuttavia, i detriti rimanenti riducono l'espressione dal lisato12.
Negli ultimi anni, sono stati pubblicati molti approcci alla produzione di lisato senza cellule, riassunti di recente da Cole et al.15. Questi studi hanno esplorato varie strategie per il tipo di cellula, le condizioni di crescita, le metodologie di lisi e la post-elaborazione. La maggior parte degli altri metodi per la lisi hanno richiesto attrezzature specializzate come una pressa francese, un omogeneizzatore, un battitore di perline o un sonicatore. Fujiwara e Doi hanno omesso questa apparecchiatura a favore di un ciclo di congelamento-disgelo simile a quello qui descritto, tranne per il fatto che hanno reso le cellule suscettibili alla lisi trattandole con lisozima piuttosto che esprimere un'endolisina16. Sebbene questo sia un protocollo più o meno semplice come quello descritto qui, le cellule trattate con lisozima devono essere lavate mentre si trovano nel loro stato fragile senza interromperle prematuramente, il che potrebbe richiedere finezza sperimentale e introdurre una fonte di variabilità.
Oltre al lisato, l'espressione genica libera da cellule richiede una soluzione premiscelata contenente fonti di energia, RNA e monomeri proteici e altre piccole molecole. La ricetta premix è stata descritta e ottimizzata in precedenza17, con alcune modifiche. La premiscela qui utilizzata conteneva concentrazioni circa 4 volte superiori di amminoacidi, oltre a glutammato di magnesio aggiuntivo e PEG 8000 corrispondenti a concentrazioni di reazione finale di 7,5 mM e 3,5% peso/volume, rispettivamente. Risultati ottimali possono richiedere la regolazione delle concentrazioni supplementari di glutammato di magnesio e PEG 8000 per ogni nuovo lotto di lisato, sebbene le concentrazioni di cui sopra abbiano costantemente prodotto buoni risultati (vedere Nota 2). Applicazioni uniche possono richiedere la riottimizzazione di queste concentrazioni, ad esempio, quando si utilizza il lisato13integrato con ClpX.
Un ceppo standard di E. coli per la produzione di lisato privo di cellule è BL21-Gold (DE3). Un derivato di queste cellule contenente il plasmide di autolisi pAD-LyseR è stato depositato in un deposito di ceppi e plasmidi (vedi la Tabella dei materiali). Sono inoltre disponibili un derivato privo di lacZ genomico per ridurre drasticamente lo sfondo per i circuiti che utilizzano l'output basato su LacZ e un plasmide di espressione pAD-GamS da utilizzare per la purificazione della proteina GamS in grado di proteggere il DNA lineare dalla degradazione. Questi ceppi cellulari e plasmidi dovrebbero essere utili per una varietà di applicazioni nell'espressione genica senza cellule.
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Disclosures
J.H. è co-fondatore di GenCirq Inc, che si concentra sulle terapie contro il cancro. Fa parte del Consiglio di amministrazione e ha partecipazioni in GenCirq.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Zachary Sun e Richard Murray (California Institute of Technology) per aver gentilmente fornito il plasmide P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) per aver gentilmente fornito una centrifuga di raffreddamento ad alta velocità. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health e dal programma ARO MURI ed è stato in parte supportato dalla Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
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