该协议描述了一种快速而简单的方法,使用工程化的 大肠杆菌 菌株生产细菌裂解物以实现无细胞基因表达,并且只需要标准的实验室设备。
无细胞基因表达提供了生物学的力量,而没有生物体的并发症。尽管存在许多这样的基因表达系统,但大多数购买和/或需要特殊设备和精细磨练的专业知识才能有效生产。该协议描述了一种生产细菌无细胞裂解物的方法,该裂解物仅使用标准实验室设备并且需要最少的处理, 支持高水平的基因表达。该方法使用大肠杆菌菌株产生不影响生长的内溶素,但在简单的冻融循环后有效地裂解收获的细胞沉淀。唯一需要的进一步处理是短暂的孵育,然后离心以清除细胞碎片的自溶物。动态基因回路可以通过收获前细胞中ClpX蛋白酶的异源表达来实现。缺乏lacZ基因的大肠杆菌菌株可用于使用比色法或荧光读数的高灵敏度,无细胞生物传感应用。整个方案只需要8-9个小时,从接种到完成只需要1-2个小时的动手劳动。通过降低获得无细胞裂解物的成本和时间,该方法应提高各种应用中无细胞基因表达的可负担性。
与使用活细胞1,2,3,4相比,无细胞裂解物中的基因表达有几个优点。裂解物可以很容易地进行生物化学修饰,并用于可能对活细胞有害或不可能实现的条件下。基因表达回路不必与宿主生物过程竞争或竞争,测试新的遗传回路就像添加DNA一样简单。由于这些原因,无细胞基因表达已经找到了各种应用,从生物传感器5,6到快速原型合成基因电路7,8到发育中的人造细胞9。大多数无细胞基因表达利用经过高度处理的细胞裂解物,通常需要漫长而复杂的实验方案,专用设备和/或敏感步骤,这可能导致使用者和批次之间的显着差异10,11。
本文描述了一种简单、有效的无细胞裂解物生产方法,该方法需要最少的处理和专业知识(图1A)12。该方法依赖于大肠杆菌细胞,这些细胞被设计为在简单的冻融循环后裂解。细胞从噬菌体λ中表达一种内溶解素,该内溶蛋白会降解细胞壁。随着细胞的生长,这种内溶蛋白保留在细胞质中,与细胞壁隔离。然而,一个简单的冻融循环会破坏细胞质膜,将内溶蛋白释放到周质中,在那里它会降解细胞壁,从而导致快速细胞裂解。该协议只需几个小时的动手工作即可完成,只需要一个冰箱,一个能够30,000×克的离心机(以获得最佳结果;可以使用较低的速度,更小心地不要干扰沉淀),一个涡旋混合器和一个简单的缓冲溶液。功能性裂解物甚至可以通过冷冻干燥细胞并原位再水化来产生 。然而,这种方法产生活性较低的裂解物,可能是由于剩余的细胞碎片。
裂解物对无细胞基因表达具有高度活性,并且可以根据最终用途以各种方式增强。通过使用标准离心浓缩器浓缩裂解物,可以进一步提高蛋白质合成速率。通过添加纯化的GamS蛋白,可以保护线性DNA免于降解。蛋白质降解是振荡等更复杂的电路动力学所必需的,可以通过在产生自洽物的菌株13中共表达ClpX六聚体来实现。最后,通过使用缺乏lacZ的自溶物菌株来启用基于 LacZ的视觉读数。总体而言,该方法可产生高活性的无细胞裂解物,适用于广泛的应用。
这里描述的方案产生用于无细胞基因表达的高活性细菌裂解物。关键是使用携带质粒pAD-LyseR的细胞,其以胞质方式表达lambda噬菌体内溶蛋白。这些细胞被增强以在内膜的通透性下裂解自身,允许内溶蛋白进入细胞壁,该方法通过简单的冻融循环实现。由于细胞有效地裂解自身,因此该产物被称为自溶物。细胞裂解后,仅剩的步骤是孵育和离心以清除细胞碎片的自溶物。
与其?…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Zachary Sun和Richard Murray(加州理工学院)提供了质粒P_araBAD-gamS,并感谢Kaeko Kamei(京都工业大学)提供了高速冷却离心机。这项工作得到了美国国立卫生研究院和ARO MURI计划的资助,并得到了日本文部科学省优秀青年研究人员领先倡议的部分支持。
2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |