Summary
Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.
Abstract
A expressão genética livre de células oferece o poder da biologia sem as complicações de um organismo vivo. Embora existam muitos desses sistemas de expressão genética, a maioria é bastante cara para comprar e/ou requer equipamentos especiais e experiência finamente aprimorada para produzir efetivamente. Este protocolo descreve um método para produzir lisesato bacteriano livre de células que suporta altos níveis de expressão genética, utilizando apenas equipamentos de laboratório padrão e exigindo processamento mínimo. O método utiliza uma cepa Escherichia coli produzindo uma endolise que não afeta o crescimento, mas que lises eficientemente uma pelota celular colhida após um simples ciclo de congelamento. O único processamento adicional necessário é uma breve incubação seguida de centrifugação para limpar o autolise de detritos celulares. Circuitos genéticos dinâmicos podem ser alcançados através da expressão heteróloga da protease ClpX nas células antes da colheita. Uma cepa de E. coli sem o gene lacZ pode ser usada para aplicações de biossensão de alta sensibilidade e livre de células usando uma leitura colorimétrica ou fluorescente. Todo o protocolo requer apenas 8-9 horas, com apenas 1-2 horas de trabalho prático desde a inoculação até a conclusão. Ao reduzir o custo e o tempo para obter o lise livre de células, este método deve aumentar a acessibilidade da expressão genética livre de células para várias aplicações.
Introduction
A expressão genética em lises livres de células tem várias vantagens sobre o uso de células vivas1,2,3,4. Os lysatos podem ser facilmente modificados bioquimicamente e usados em condições que podem ser prejudiciais ou impossíveis de alcançar em células vivas. Circuitos de expressão genética não têm que lutar ou competir com processos biológicos hospedeiros, e testar novos circuitos genéticos é tão simples quanto adicionar DNA. Por essas razões, a expressão genética livre de células encontrou várias aplicações, desde biosensores5,6 até a rápida prototipagem de circuitos genéticos sintéticos7,8 até o desenvolvimento de células artificiais9. A maioria da expressão genética livre de células utiliza lises celulares altamente processadas, geralmente exigindo protocolos longos e complexos, equipamentos especializados e/ou etapas sensíveis que podem levar a variações significativas entre usuários e lotes10,11.
Este artigo descreve um método simples e eficiente para produzir lysate livre de células que requer processamento e experiência mínimos(Figura 1A)12. O método conta com células E. coli que são projetadas para lise após um simples ciclo de congelamento. As células expressam uma endolise de lambda de phage que degrada a parede celular. À medida que as células crescem, essa endolise permanece no citoplasma, sequestrado da parede celular. No entanto, um simples ciclo de congelamento interrompe a membrana citoplasmática, liberando a endolise no periplasma, onde degrada a parede celular, resultando em rápida lise celular. O protocolo pode ser concluído com apenas algumas horas de trabalho prático e requer apenas um freezer, uma centrífuga capaz de 30.000 × g (para resultados ideais; velocidades mais baixas podem ser usadas com mais cuidado para não perturbar a pelota), uma batedeira de vórtice e uma solução tampão simples. O lisete funcional pode até ser produzido secando as células e reidratação-as in situ. No entanto, este método produz lises com menor atividade, presumivelmente devido aos detritos celulares restantes.
Os lises são altamente ativos para a expressão genética livre de células, e podem ser aprimorados de várias maneiras, dependendo do uso final. A taxa de síntese proteica pode ser aumentada concentrando o liseto usando concentradores de spin padrão. O DNA linear pode ser protegido da degradação adicionando proteína GamS purificada. A degradação proteica, necessária para dinâmicas de circuitos mais complexas, como a oscilação, pode ser alcançada co-expressando um hexamer ClpX na cepa produtora de auto-lysato13. Finalmente, as leituras visuais baseadas em LacZ são habilitadas usando uma cepa de massa automática sem lacZ. No geral, este método produz um lysate altamente ativo livre de células que é adequado para uma ampla gama de aplicações.
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Protocol
1. Prepare a mídia e os buffers.
- Prepare o meio 2xYTPG.
- Misture 62 g 2xYT em pó, 5,99 g de fosfato de potássio monobásico, 13,93 g de fosfato de potássio dibasic e água desionizada a 2 L.
- Autoclave no ciclo líquido com um tempo de exposição de 30 min14.
- A 400 mL de mídia 2xYTP a partir de 1.1.2, adicione 7,2 g D-glicose (dextrose) e misture até dissolver.
- Esterilize o filtro através de um filtro de 0,2 μm.
- Prepare o buffer S30A.
- Mix Tris-HCl (pH 7.7, 50 mM concentração final), glutamato de potássio (final de 60 mM) e glutamato de magnésio (final de 14 mM).
- Ajuste o pH para 7,7 usando 10 M KOH.
- Preparar a solução 1 (ver Tabela 1).
- Resuspend 4-(2-hidroxitila)-1- ácido piperazineetanesulfônico (HEPES) em 2 mL de água.
- Ajuste o pH para 8.0 usando KOH.
- Adicione todos os outros componentes da Tabela 1.
- Ajuste o pH para 7,6 usando 10 M KOH. Esterilizar filtros.
- Prepare a solução de pré-10x (ver Tabela 2).
- Misture todos os componentes na Tabela 2.
- Ajuste o pH para 7,5 usando KOH.
- Alíquota e congelamento a -80 °C.
NOTA: Uma reação de 20 μL usa 8,9 μL de pré-x.
2. Prepare as células.
- Estiche as células de auto-lise em placas de ágar LB contendo 50 μg/mL ampicillin usando um laço inoculante e cresça a 37 °C (ver Nota 1).
- Escolha uma única colônia em uma cultura inicial de meio LB/ampicillin usando uma ponta de pipeta e cresça a 37 °C durante a noite.
- Inocular 400 mL de meio 2xYTPG contendo 50 μg/mL ampicillin com 400 μL de cultura inicial, e crescer a 37 °C em um frasco de 1 L Erlenmeyer, tremendo a 300 rpm.
- Meça periodicamente a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectotómetro para ler um cuvette óptico com um comprimento de caminho de 1 cm. Quando o OD600 exceder 1, comece a diluir a cultura 5 vezes antes das medições para garantir que as medidas permaneçam dentro da faixa linear de um espectrofotômetro de laboratório típico. Continue crescendo as células até que a cultura diluída de 5 vezes atinja OD600 de 0,3 (correspondente a uma cultura OD600 de 1,5).
3. Prepare o lise.
- Prepare o tampão S30A complementado com dithiothreitol de 2 mM (DTT). Misture 3 mL de tampão S30A com 6 μL de solução de estoque DTT a 1 M. Coloque no gelo para uso na etapa 3.7.
- Colher as células por centrifugação a 1800 × g por 15 min a temperatura ambiente.
- Descarte o supernatante derramando-o e usando uma tubulação para remover qualquer líquido restante.
- Resuspenha a pelota em 45 mL de tampão S30A frio (4-10 °C) usando um misturador de vórtice.
- Pesar um tubo vazio de centrífugas de 50 mL, transferir as células para ele e repetir as etapas 3.2-3.3 para lavar as células.
- Pese a pelota, subtraindo o peso de um tubo vazio de 50 mL. Certifique-se de aspirar cuidadosamente qualquer supernante restante para garantir uma medição precisa do peso da pelota.
NOTA: Um rendimento típico é de ~1,3 g de pelota celular de 400 mL de cultura de produção. - Adicione 2 volumes de tampão S30A frio suplementado com dithiothiothreitol de 2 mM, ou seja, 2 mL de tampão para cada 1 g de pelota celular, e resuspenque as células por uma mistura vigorosa de vórtice.
- Congele as células. Coloque o tubo de 50 mL contendo as células em um congelador de -20 °C ou -80 °C até que a pelota esteja completamente congelada.
NOTA: O passo de congelamento é um bom ponto de parada para o dia. - Descongele as células em um banho de água de temperatura ambiente.
- Vórtice vigorosamente por 2-3 min.
- Incubar a 37 °C por 45 min com agitação a 300 rpm.
- Limpe a amostra de detritos celulares pesados por centrifugação em tubos de centrífuga transparente a 30.000 × g por 45 min a 4 °C.
NOTA: Se uma centrífuga capaz de 30.000 x g não estiver disponível, centrífuga por 45 min a 21.000 × g, e tome cuidado adicional na etapa 3.13, pois a pelota será menos compacta. - Transfira cuidadosamente o supernatante para um novo tubo com uma pipeta, evitando perturbar a pelota o máximo possível. Se o supernante transferido estiver contaminado com material da pelota, repita a etapa anterior.
- Transfira o supernatante para tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga mais uma vez a 21.000 × g (ou a velocidade máxima de uma centrífuga de mesa) por 5 minutos.
- Alíquotar o auto-lisato limpo nos volumes desejados, evitando cuidadosamente qualquer pelota restante, e congele a -80 °C ou use imediatamente.
NOTA: Uma única reação de 20 μL usa 8 μL de autolysato.
4. Expressão genética livre de células
NOTA: O auto-acordo está agora pronto para qualquer uso final desejado. A seguir, um protocolo padrão de exemplo para a expressão genética livre de células.
- Para uma reação de 20 μL, misture no gelo 8 μL de autolysato e 8,9 μL de pré-x. Consulte NOTA no final da seção de protocolo sobre a otimização de glutamato de magnésio e concentrações PEG 8000.
- Adicione DNA (por exemplo, pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500 a uma concentração final de 8 nM), quaisquer outros reagentes e água a 20 μL.
- Coloque a reação em uma microplaca de 384 poços e meça o curso de tempo de fluorescência e/ou pontos finais usando um leitor de placas. Para proteína fluorescente verde (GFP), use um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.
5. Modificações de protocolo
NOTA: As seguintes modificações do protocolo permitem que ele atenda outras aplicações.
- Expressão genética livre de células usando modelos lineares de DNA
- Realize as etapas na seção 4, complementando a reação com proteína GamS purificada de 2,2 μM (expressa e purificada como descrito12) antes da adição do DNA linear.
- Expressão genética livre de células incorporando a degradação da proteína
- Na etapa 2.1, use células de autolysato contendo o plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (ver a Tabela de Materiais). Em todas as mídias de crescimento, além disso, incluem 34 μg/mL chloramphenicol.
- Na etapa 2.3, inclua 40 μM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) no meio de crescimento para induzir a expressão do plasmídeo.
- Repita as etapas 3.2-3.4 (lavagem) duas vezes adicionais (para um total de três lavagens) para garantir a remoção completa do clororamfenicol, que é um inibidor de tradução. Para as duas primeiras lavagens (etapa 3.4), substitua o tampão S30A por soro fisiológico tamponado por fosfato (pH 7.4).
- Na etapa 4.2, complemente com um ATP adicional de 3 mM (adicionado a partir de uma solução de estoque de 100 mM ATP em água, pH 7.2) e glúteo de magnésio de 4,5 mM (usando uma solução de estoque de 1 M em água) (concentrações finais) para compensar o alto uso de ATP pelo ClpXP, bem como a quelação de magnésio pelo ATP adicional.
- Expressão genética livre de células usando leituras baseadas em LacZ (incluindo colorimétrica)
- Na etapa 2.1, utilize células de auto-liseto que não expressem nativamente LacZ (ver a Tabela de Materiais).
- Alternativamente, prepare o lise diretamente de células congeladas.
- Realize todas as etapas de 1,1 a 3,7.
- Misture 8 μL de suspensão celular com 8,9 μL de pré-x.
- Adicione DNA plasmídeo (se desejar), outros reagentes personalizados e água para atingir um volume final de 20 μL.
- Transfira a reação para uma microplacão de 384 poços e congele-a.
NOTA: As amostras congeladas podem ser armazenadas por até uma semana e possivelmente por mais tempo. - Para começar a reação, reidrate-o com 18 μL de água deionizada suplementada com qualquer DNA desejado ou outros reagentes.
- Siga a dinâmica da fluorescência em um leitor de placas.
NOTA 1: As células de auto-lise são projetadas para lise em um ciclo de congelamento, por isso é particularmente importante usar crioprotetor ao fazer estoques congelados. Congelamos os estoques em 24% de glicerol wt/vol e armazenamos a -80 °C.
NOTA 2: Íons de magnésio e PEG 8000 são fundamentais para o desempenho do lysate. A precex base de 2,5x, baseada em dados publicados anteriormente, contém glúteo de magnésio de 6 mM e 4,8% wt/vol PEG 8000, que se tornam 2,4 mM e 1,9%, respectivamente, na reação final. O autolysate preparado com o protocolo aqui normalmente tem melhor desempenho com um adicional de 5 mM Mg-glutamato e 1,5% PEG 8000 na reação final. No entanto, isso pode ser otimizado na faixa de um glutamato adicional de 0-10 mM Mg e um adicional de 0-3% PEG 8000 (em comparação com a pré-mistura base). Para preparar a pré-mistura com o recomendado adicional de 5 mM Mg-glutamato e 1,5% PEG 8000 (concentrações finais), misture 380 μL de pré-x com 4,75 μL de glutamato de magnésio a 1 M e 36,1 μL de PEG 8000 a 40% de peso/volume.
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Representative Results
Os resultados representativos podem ser observados usando o auto-desapedo para expressar GFP a partir de um plasmídeo expresso constitutivamente, aqui pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500, e registrando um curso de tempo de fluorescência GFP em um leitor de placas(Figura 1B). Uma série de diluição de DNA plasmídeo encontrou forte expressão mesmo em DNA de 1 nM. Em comparação com um lysate comercialmente disponível, o autolysato pode produzir um rendimento total maior e alcançar uma taxa máxima de produção maior, calculada como derivada temporal do curso de tempo GFP(Figura 1C,D). Para obter resultados adicionais usando este método, consulte Didovyk et al.12. Este protocolo tem relativamente poucos pontos de falha; no entanto, resultados subótimos poderiam ser obtidos se o autoalto não for suficientemente limpo de detritos celulares. Os resultados ideais também podem exigir a otimização das concentrações de PEG-8000 e Mg2+ para cada lote de lise (ver Nota 2).
Figura 1: Resultados representativos. (A) Representação visual do protocolo. (B) Exemplo de tempo de expressão GFP a partir de pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500 em um auto-degelo congelado. Produção máxima de GFP (C) e taxa máxima de produção(D)de autolysato preparados em 2 laboratórios diferentes por 2 pesquisadores diferentes, utilizando uma centrífuga de 30.000 x g (azul e laranja) ou uma centrífuga de 20.000 x g (roxo), em comparação com uma referência comercial (laranja, MYtxtl-70-960M de MYcroy. Todas as barras de erro são erro absoluto de duas réplicas técnicas. Este número foi modificado a partir de 12. Copyright 2017 American Chemical Society. Abreviação: GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução 1: Adicione água ao total de 4 mL | |
| Nome | Peso (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| acampamento | 13.8 |
| Rio CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Ácido fônico | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Esperdina | 8.1 |
| tRNAs | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabela 1: Solução 1. Componentes da solução 1.
| 2,5x Premix | |
| Reagente | Volume (μL) |
| Mistura de aminoácido contendo 24 mM cada, exceto a leucina que está em 20 mM | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) a 100 mM | 100 |
| Glutamato de magnésio a 1 M | 25 |
| PEG-8000 a 40% wt/vol | 500 |
| Glutamato de potássio a 2 M | 303 |
| Solução 1 (ver Tabela 1) | 714.3 |
Tabela 2: Pré-x. Componentes da solução de pré-1x.
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Discussion
O protocolo descrito aqui produz lisesto bacteriano altamente ativo para a expressão genética livre de células. A chave é usar células que carregam o plasmídeo pAD-LyseR, que expressa a lambda phage endolysin citosolicamente. Essas células são potencializados para se desobrilarem após a permeabilização da membrana interna, permitindo o acesso da endolise à parede celular, que o método consegue através de um simples ciclo de congelamento. Como as células se lisem efetivamente, o produto é referido como auto-lysate. Após a implantação das células, as únicas etapas restantes são a incubação e a centrifugação para limpar o autolise dos detritos celulares.
Em comparação com outros métodos de produção de lise bacteriana, essa abordagem é notavelmente simples e rápida, mas não sacrifica a qualidade do lysate. O protocolo pode ser concluído em 8-9 h após inocular a cultura de produção, com apenas 1-2 horas de trabalho prático. O único equipamento recomendado que não é totalmente padrão para laboratórios de biologia molecular é uma centrífuga capaz de atingir 30.000 × g. No entanto, o autolysate de qualidade comparável pode ser produzido mesmo com uma centrífuga de menor velocidade (Figura 1C, D); o usuário teria que ter mais cuidado para remover o lysate da pelota, talvez deixando para trás um pouco mais líquido para garantir amostras limpas. Essa simplicidade não é apenas uma questão de conveniência; protocolos menos complicados tendem a produzir resultados mais reprodutíveis, com menor variação quando realizados com diferentes mãos. A modificação apresentada na etapa 5.4, na qual as células são congeladas junto com todos os outros reagentes, apresenta um protocolo ainda mais simples, embora com rendimentos reduzidos de produção de proteínas. Notavelmente, nesta modificação, são ignoradas as etapas de centrifugação para limpar o lise de detritos celulares, o que reduz ainda mais o trabalho de processamento; no entanto, os detritos restantes reduzem a expressão dolysate 12.
Nos últimos anos, muitas abordagens para produzir lysate livre de células foram publicadas, resumidas recentemente por Cole et al.15. Esses estudos têm explorado várias estratégias para o tipo celular, condições de crescimento, metodologias de lise e pós-processamento. A maioria dos outros métodos de lise requerou equipamentos especializados, como uma prensa francesa, homogeneizador, batedor de contas ou sonicator. Fujiwara e Doi omitiram este equipamento em favor de um ciclo de congelamento semelhante ao descrito aqui, exceto que eles tornaram as células suscetíveis à lise tratando-as com lise em vez de expressar uma endolise16. Embora este seja mais ou menos um protocolo tão simples quanto o descrito aqui, as células tratadas com lise deve ser lavadas em seu estado frágil sem interrompê-las prematuramente, o que poderia exigir finesse experimental e introduzir uma fonte de variabilidade.
Além do liseto, a expressão genética livre de células requer uma solução de pré-celulose contendo fontes de energia, RNA e monômeros proteicos, e outras pequenas moléculas. A receita de pré-mistura foi descrita e otimizada anteriormente17,com algumas modificações. A precex aqui utilizada continha concentrações aproximadamente 4 vezes maiores de aminoácidos, bem como glutamato de magnésio adicional e PEG 8000 correspondentes às concentrações de reação final de 7,5 mM e 3,5% de peso/volume, respectivamente. Os resultados ideais podem exigir o ajuste do glutamato de magnésio suplementar e das concentrações PEG 8000 para cada novo lote de lise, embora as concentrações acima tenham consistentemente produzido bons resultados (ver Nota 2). Aplicações exclusivas podem exigir a reotimização dessas concentrações, por exemplo, ao usar o lysate complementado pelo ClpX13.
Uma cepa padrão de E. coli para a produção de lise sem células é BL21-Gold (DE3). Um derivado dessas células contendo o plasmídeo automático pAD-LyseR foi depositado em uma cepa e repositório plasmídeo (ver a Tabela de Materiais). Também estão disponíveis um derivado sem lacZ genômico para reduzir drasticamente o fundo para circuitos que usam saída à base de LacZ e uma expressão plasmid pAD-GamS para ser usado para a purificação da proteína GamS que pode proteger o DNA linear da degradação. Essas cepas celulares e plasmídeos devem ser úteis para uma variedade de aplicações na expressão genética livre de células.
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Disclosures
J.H. é um co-fundador da GenCirq Inc, que se concentra na terapêutica do câncer. Ele faz parte do Conselho de Administração e tem participação na GenCirq.
Acknowledgments
Os autores agradecem zachary Sun e Richard Murray (Instituto de Tecnologia da Califórnia) por fornecer gentilmente o plasmídeo P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Instituto de Tecnologia de Kyoto) por gentilmente fornecer uma centrífuga de resfriamento de alta velocidade. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde e do programa ARO MURI e foi parcialmente apoiado pela Iniciativa Líder para Excelentes Jovens Pesquisadores, MEXT, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
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