Summary
Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att producera bakteriell lysate för cellfria genuttryck, med hjälp av en konstruerad stam av Escherichia coli och kräver endast standard laboratorieutrustning.
Abstract
Cellfritt genuttryck erbjuder biologins kraft utan komplikationer av en levande organism. Även om många sådana genuttryckssystem finns, är de flesta ganska dyra att köpa och / eller kräver speciell utrustning och finslipad expertis för att producera effektivt. Detta protokoll beskriver en metod för att producera bakteriell cellfri lysate som stöder höga nivåer av genuttryck, använder endast standard laboratorieutrustning och kräver minimal bearbetning. Metoden använder en Escherichia coli-stam som producerar en endolysin som inte påverkar tillväxten, men som effektivt lyser en skördad cellpellet efter en enkel frys-tina cykel. Den enda ytterligare bearbetningen som krävs är en kort inkubation följt av centrifugering för att rensa autolysatet av cellulära skräp. Dynamiska genkretsar kan uppnås genom heterologt uttryck av ClpX-proteasen i cellerna före skörd. En E. coli-stam som saknar lacZ-genen kan användas för högkänsliga, cellfria bioseneringsapplikationer med hjälp av en koloretrik eller fluorescerande avläsning. Hela protokollet kräver så få som 8-9 timmar, med endast 1-2 timmars praktiskt arbete från inokulering till slutförande. Genom att minska kostnaden och tiden för att få cellfri lysat bör denna metod öka överkomliga priser på cellfria genuttryck för olika tillämpningar.
Introduction
Genuttryck i cellfria lysater har flera fördelar jämfört med att använda levande celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifieras biokemiskt och användas under förhållanden som kan vara skadliga för eller omöjliga att uppnå i levande celler. Genuttryckskretsar behöver inte kämpa eller konkurrera med värdbiologiska processer, och att testa nya genetiska kretsar är lika enkelt som att lägga till DNA. Av dessa skäl har cellfritt genuttryck hittat olika tillämpningar, från biosensorer5,6 till snabbt prototyping syntetiska genkretsar7,8 till att utveckla konstgjorda celler9. De flesta cellfria genuttryck använder cellulära lysater som har bearbetats mycket, vilket i allmänhet kräver långa och komplexa protokoll, specialiserad utrustning och / eller känsliga steg som kan leda till betydande variation mellan användare och partier10,11.
Detta dokument beskriver en enkel och effektiv metod för att producera cellfri lysat som kräver minimal bearbetning och expertis (figur 1A)12. Metoden bygger på E. coli-celler som är konstruerade för att lysa efter en enkel frys-tina cykel. Cellerna uttrycker en endolysin från faglamda som försämrar cellväggen. När cellerna växer förblir denna endolysin i cytoplasman, separerad från cellväggen. En enkel frys-tina cykel stör dock cytoplasmamembranet, släpper endolysin i periplasman, där det försämrar cellväggen, vilket resulterar i snabb celllys. Protokollet kan slutföras med endast några timmars praktiskt arbete och kräver endast en frys, en centrifug som kan 30 000 × g (för optimalt resultat; lägre hastigheter kan användas med större omsorg för att inte störa pelleten), en virvelblandare och en enkel buffertlösning. Funktionell lysat kan till och med produceras genom att frysa cellerna och rehydrera dem på plats. Denna metod producerar dock lysater med lägre aktivitet, förmodligen på grund av de återstående cellresterna.
Lysaterna är mycket aktiva för cellfria genuttryck, och de kan förbättras på olika sätt beroende på slutanvändningen. Proteinsyntesen kan ökas ytterligare genom att lysate koncentreras med hjälp av vanliga spinnkoncentratorer. Linjärt DNA kan skyddas från nedbrytning genom att tillsätta renat GamS-protein. Proteinnedbrytning, som är nödvändig för mer komplex kretsdynamik som svängning, kan uppnås genom att uttrycka en ClpX-hexamer i den autolysatproducerande stammen13. Slutligen aktiveras LacZ-baserade visuella avläsningar genom att använda en automatiskt använd stam som saknar lacZ. Sammantaget producerar denna metod mycket aktiv cellfri lysate som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered media och buffertar.
- Förbered 2xYTPG medium.
- Blanda 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumfosfat monobasiskt, 13,93 g kaliumfosfatdibasiskt och avjoniserat vatten till 2 L.
- Autoklav på vätskecykel med en exponeringstid på 30 min14.
- Tillsätt 7,2 g D-glukos (dextros) till 400 ml 2xYTP-media från 1.1.2 och blanda tills det är upplöst.
- Filtersterilisera genom ett 0,2 μm-filter.
- Förbered S30A-bufferten.
- Blanda Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM slutlig koncentration), kaliumgl glutamat (60 mM slutlig) och magnesiumglutamat (14 mM slutlig).
- Justera pH-värdet till 7,7 med 10 M KOH.
- Förbered lösning 1 (se tabell 1).
- Resuspend 4-(2-hydroxyetyl)-1- piperazineetanesulfonsyra (HEPES) i 2 ml vatten.
- Justera pH-värdet till 8,0 med KOH.
- Lägg till alla andra komponenter från tabell 1.
- Justera pH-värdet till 7,6 med 10 M KOH. Filtrera-sterilisera.
- Förbered 2,5x förblandningslösning (se tabell 2).
- Blanda alla komponenter i tabell 2.
- Justera pH-värdet till 7,5 med KOH.
- Aliquot och frys vid -80 °C.
OBS: En 20 μL-reaktion använder 8,9 μL förblandning.
2. Förbered celler.
- Strila autolysatcellerna på LB agarplattor som innehåller 50 μg/ml ampicillin med hjälp av en inokulerande slinga och växa vid 37 °C (se anmärkning 1).
- Välj en enda koloni i en startkultur av LB/ampicillin medium med hjälp av en pipspets och växa vid 37 °C över natten.
- Inokulera 400 ml 2xYTPG-medium som innehåller 50 μg/ml ampicillin med 400 μL startkultur och växa vid 37 °C i en 1 L Erlenmeyerkolv och skaka vid 300 varv/min.
- Mät regelbundet kulturens optiska densitet vid 600 nm (OD600)med hjälp av en spektrofotometer för att läsa av en optisk cuvette med en 1 cm banlängd. När OD600 överstiger 1, börja späda ut kulturen 5 gånger före mätningar för att säkerställa att mätningarna förblir inom det linjära intervallet för en typisk laboratoriespektrofotometer. Fortsätt att odla cellerna tills den 5-faldiga utspädda kulturen når OD600 av 0,3 (motsvarande en kultur OD600 av 1,5).
3. Förbered lysat.
- Förbered S30A buffert kompletterad med 2 mM dithiothreitol (DTT). Blanda 3 ml S30A-buffert med 6 μL DTT-stamlösning vid 1 M. Placera på is för användning i steg 3.7.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 1800 × g i 15 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten genom att hälla av den och använda en pipet för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska.
- Återanvänd pelleten i 45 ml kall (4-10 °C) S30A-buffert med hjälp av en virvelblandare.
- Väg ett tomt 50 ml centrifugrör, överför cellerna till det och upprepa steg 3.2-3.3 för att tvätta cellerna.
- Väg pelleten och subtrahera vikten på ett tomt 50 ml-rör. Var noga med att noggrant aspirera eventuella återstående supernatant för att säkerställa en korrekt mätning av pelletsvikten.
OBS: Ett typiskt utbyte är ~ 1,3 g cellpellet från 400 ml produktionskultur. - Tillsätt 2 volymer kall S30A-buffert kompletterad med 2 mM dithiothreitol, dvs. 2 ml buffert för varje 1 g cellpellet, och återanvänd cellerna genom kraftig virvelblandning.
- Frys cellerna. Placera 50 ml-röret som innehåller cellerna i en frys på -20 °C eller -80 °C tills pelleten är ordentligt frusen.
OBS: Fryssteget är en bra stopppunkt för dagen. - Tina cellerna i ett vattenbad i rumstemperatur.
- Virvel kraftigt i 2-3 min.
- Inkubera vid 37 °C i 45 minuter med skakningar vid 300 varv/min.
- Rensa provet av tungt cellulärt skräp genom centrifugering i genomskinliga centrifugrör vid 30 000 × g i 45 minuter vid 4 °C.
OBS: Om en centrifug som kan 30 000 x g inte finns tillgänglig, centrifugera i 45 min vid 21 000 × g, och var försiktig ytterligare i steg 3.13, eftersom pelleten blir mindre kompakt. - Överför försiktigt supernatanten till ett nytt rör med en pipet, undvik att störa pelleten så mycket som möjligt. Om det överförda supernatanten är förorenat med material från pelleten, upprepa föregående steg.
- Överför supernatanten till 1,5 ml centrifugrör och centrifugera en gång till vid 21 000 × g (eller den maximala hastigheten för en bordscentrifug) i 5 minuter.
- Aliquot den rensade autolysate i önskade volymer, försiktigt undvika återstående pellet, och frysa vid -80 °C eller använd omedelbart.
OBS: En enda 20 μL-reaktion använder 8 μL autolysat.
4. Cellfritt genuttryck
Obs: Autolysatet är nu redo för önskad slutanvändning. Följande är ett exempel standardprotokoll för cellfritt genuttryck.
- För en reaktion på 20 μL, blanda på is 8 μL autolysat och 8,9 μL förblandning. Se OBS i slutet av protokollavsnittet om optimering av magnesiumlimtamat och PEG 8000-koncentrationer.
- Tillsätt DNA (t.ex. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 till en slutlig koncentration av 8 nM), andra reagenser och vatten till 20 μL.
- Placera reaktionen i en 384-väl mikroplatta och mät fluorescenstidskursen och/eller slutpunkterna med hjälp av en plattläsare. För grönt fluorescerande protein (GFP), använd en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 520 nm.
5. Ändringar av protokollet
Obs: Följande ändringar av protokollet gör det möjligt att betjäna andra program.
- Cellfritt genuttryck med linjära DNA-mallar
- Utför stegen i avsnitt 4 och komplettera reaktionen med 2,2 μM renat GamS-protein (uttryckt och renat enligt beskrivningen12) före tillsats av linjärt DNA.
- Cellfritt genuttryck som innehåller proteinnedbrytning
- I steg 2.1 använder du automatiskt celler som innehåller plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (se tabellen över material). I alla tillväxtmedier omfattar dessutom 34 μg/ml kloramfenicol.
- I steg 2.3, inkludera 40 μM isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) i tillväxtmediet för att inducera uttryck från plasmiden.
- Upprepa steg 3,2-3,4 (tvätt) ytterligare två gånger (för totalt tre tvättar) för att säkerställa fullständigt avlägsnande av kloramfenicol, som är en översättningshämmare. För de två första tvättarna (steg 3.4), ersätt S30A-bufferten med fosfatbuffrad saltlösning (pH 7.4).
- I steg 4.2, komplettera med ytterligare 3 mM ATP (tillsatt från en lagerlösning på 100 mM ATP i vatten, pH 7.2) och 4,5 mM magnesium glutamat (med en 1 M lagerlösning i vatten) (slutliga koncentrationer) för att kompensera för hög ATP-användning av ClpXP, samt chelation av magnesium av ytterligare ATP.
- Cellfritt genuttryck med Hjälp av LacZ-baserade avläsningar (inklusive kolorimetrisk)
- I steg 2.1 använder du automatiskt celler som inte uttrycker LacZ (se tabellen över material).
- Alternativt kan du förbereda lysat direkt från frystorkade celler.
- Utför alla steg från 1.1 till 3.7.
- Blanda 8 μL cellfjädring med 8,9 μL förblandning.
- Tillsätt plasmid-DNA (om så önskas), andra anpassade reagenser och vatten för att nå en slutlig volym på 20 μL.
- Överför reaktionen till en 384-brunns mikroplatta och frystorka den.
OBS: Frystorkade prover kan förvaras i upp till en vecka och eventuellt längre. - För att påbörja reaktionen, rehydrera den med 18 μL avjoniserat vatten kompletterat med önskat DNA eller andra reagenser.
- Följ fluorescensdynamiken i en plattläsare.
ANMÄRKNING 1: Autolysate celler är utformade för att lysa vid en frys-tina cykel, så det är särskilt viktigt att använda kryoskyddsmedel när du gör frysta lager. Vi frös lager i 24% wt/vol glycerol och lagrade dem vid -80 °C.
OBS 2: Magnesiumjoner och PEG 8000 är avgörande för lysats prestanda. Basen 2,5x förblandning, baserad på tidigare publicerade data, innehåller 6 mM magnesium glutamat och 4,8% wt/vol PEG 8000, som blir 2,4 mM respektive 1,9%, i den slutliga reaktionen. Autolysate som är förberedda med protokollet här fungerar vanligtvis bäst med ytterligare 5 mM Mg-glutamat och 1,5% PEG 8000 i den slutliga reaktionen. Detta kan dock optimeras i intervallet för ytterligare 0-10 mM Mg glutamat och ytterligare 0-3% PEG 8000 (jämfört med basförblandningen). För att förbereda förblandningen med den rekommenderade ytterligare 5 mM Mg-glutamat och 1,5% PEG 8000 (slutliga koncentrationer), blanda 380 μL förblandning med 4,75 μL magnesiumglutamat vid 1 M och 36,1 μL PEG 8000 vid 40% vikt/volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat kan observeras genom att använda autolysera för att uttrycka GFP från en konstituerande uttrycksplasmid, här pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, och registrera en tidsförlopp av GFP fluorescens i en plattläsare (figur 1B). En utspädningsserie av plasmid-DNA fann starka uttryck även vid 1 nM DNA. Jämfört med en kommersiellt tillgänglig lysat kan autolysatet ge en större total avkastning och uppnå en högre maximal produktionstakt, beräknad som tidsderivatet för GFP-tidskursen (figur 1C,D). För ytterligare resultat med denna metod, se Didovyk et al.12. Detta protokoll har relativt få felpunkter; Suboptimala resultat kan dock erhållas om autolysatet inte är tillräckligt rensat från cellskräp. Optimala resultat kan också kräva att koncentrationerna av PEG-8000 och Mg2+ optimeras för varje sats lysate (se anmärkning 2).
Bild 1: Representativa resultat. (A) Visuell representation av protokollet. (B) Exempeltid för GFP-uttryck från pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 i ett frys-tina autolysat. Maximal GFP-produktion(C)och maximal produktionstakt (D) av autolysat som beretts i 2 olika laboratorier av 2 olika forskare, med hjälp av en 30 000 x g centrifug (blå och orange) eller en 20 000 x g centrifug (lila), jämfört med en kommersiell referens lysate (orange, MYtxtl-70-960M från MYcroarray). Alla felstaplar är medelvärdet för absoluta fel i två tekniska replikat. Denna siffra har ändrats från 12. Copyright 2017 American Chemical Society. Förkortning: GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Lösning 1: Tillsätt vatten till 4 ml totalt | |
| Namn | Vikt (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| läger | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Folsyra | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidin | 8.1 |
| tRNAs | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabell 1: Lösning 1. Komponenter i lösning 1.
| 2,5x förblandning | |
| Reagens | Volym (μL) |
| Aminosyrablandning innehållande 24 mM vardera, med undantag för leucin som är på 20 mM | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) vid 100 mM | 100 |
| Magnesium glutamat vid 1 M | 25 |
| PEG-8000 vid 40% wt/vol | 500 |
| Kaliumgl glutamat vid 2 M | 303 |
| Lösning 1 (se tabell 1) | 714.3 |
Tabell 2: Förblandning. Komponenter i förblandningslösningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger mycket aktiv bakteriell lysate för cell-free genuttryck. Nyckeln är att använda celler som bär plasmid pAD-LyseR, som uttrycker lambda phage endolysin cytosolically. Dessa celler förstärks för att lysa sig vid permeabilisering av det inre membranet, vilket ger endolysin tillgång till cellväggen, vilket metoden uppnår genom en enkel frys-tina cykel. Eftersom cellerna effektivt lyses sig, kallas produkten autolysate. Efter att cellerna har lyst är de enda återstående stegen inkubation och centrifugering för att rensa autolysatet av cellulärt skräp.
Jämfört med andra metoder för att producera bakteriell lysate är detta tillvägagångssätt särskilt enkelt och snabbt, men det offrar inte kvaliteten på lysat. Protokollet kan slutföras i 8-9 h efter att ha vaccinerat produktionskulturen, med endast 1-2 timmars praktiskt arbete. Den enda rekommenderade utrustningen som inte är helt standard för molekylärbiologiska laboratorier är en centrifug som kan uppnå 30 000 × g. Autolysat av jämförbar kvalitet kan dock framställas även med en centrifug med lägre hastighet(figur 1C,D); användaren skulle bara behöva vara mer försiktig med att ta bort lysat från pelleten, kanske lämna efter sig lite mer vätska för att säkerställa rena prover. Denna enkelhet är inte bara en fråga om bekvämlighet; mindre komplicerade protokoll tenderar att ge mer reproducerbara resultat, med mindre variation när de utförs med olika händer. Den modifiering som presenteras i steg 5.4, där celler frystorkas tillsammans med alla andra reagenser, presenterar ett ännu enklare protokoll, men med minskad proteinproduktionsavkastning. I synnerhet, i denna modifiering hoppas centrifugeringsstegen för att rensa lysat av cellulärt skräp, vilket ytterligare minskar bearbetningsarbetet; Det återstående skräpet minskar dock uttrycket från lysate12.
Under de senaste åren har många metoder för att producera cellfri lysat publicerats, sammanfattade nyligen av Cole et al.15. Dessa studier har undersökt olika strategier för celltyp, tillväxtförhållanden, lysmetoder och efterbehandling. De flesta andra metoder för lys har krävt specialiserad utrustning som en fransk press, homogenisator, pärlvisp eller sonicator. Fujiwara och Doi utelämnade denna utrustning till förmån för en frys-tina cykel som liknar den som beskrivs här, förutom att de gjorde cellerna mottagliga för lys genom att behandla dem med lysozzym snarare än att uttrycka en endolysin16. Även om detta är ungefär lika enkelt ett protokoll som det som beskrivs här, måste de lysozzymbehandlade cellerna tvättas medan de är i sitt bräckliga tillstånd utan att störa dem i förtid, vilket kan kräva experimentell finess och införa en källa till variabilitet.
Förutom lysat kräver cellfritt genuttryck en förblandningslösning som innehåller energikällor, RNA- och proteinmonomerer och andra små molekyler. Förblandningsreceptet beskrevs och optimerades tidigare17, med några modifieringar. Den förblandning som användes här innehöll cirka 4 gånger högre koncentrationer av aminosyror, samt ytterligare magnesiumlimtamat och PEG 8000 motsvarande slutliga reaktionskoncentrationer på 7, 5 mM respektive 3, 5% vikt/volym. Optimala resultat kan kräva justering av de kompletterande magnesiumglutamat- och PEG 8000-koncentrationerna för varje ny sats lysate, även om ovanstående koncentrationer konsekvent gav goda resultat (se anmärkning 2). Unika tillämpningar kan kräva att dessa koncentrationer återupplivas, till exempel när du använder ClpX-kompletterad lysate13.
En standard E. coli stam för produktion av cellfri lysat är BL21-Gold (DE3). Ett derivat av dessa celler som innehåller autolysplasmid pAD-LyseR har deponerats i ett stam- och plasmidlager (se materialförteckningen). Det finns också ett derivat som saknar genomisk lacZ för att dramatiskt minska bakgrunden för kretsar som använder LacZ-baserad utgång och ett uttryck plasmid pAD-GamS som ska användas för rening av GamS-proteinet som kan skydda linjärt DNA från nedbrytning. Dessa cellstammar och plasmider bör vara användbara för en mängd olika tillämpningar i cellfria genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H. är en av grundarna av GenCirq Inc, som fokuserar på cancerterapier. Han sitter i styrelsen och har eget kapital i GenCirq.
Acknowledgments
Författarna tackar Zachary Sun och Richard Murray (California Institute of Technology) för att de vänligt tillhandahåller plasmiden P_araBAD-gamS, och Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) för att vänligt ha tillhandahållit en höghastighetskylningscentrug. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health och från ARO MURI-programmet och stöddes delvis av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
