Summary
Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.
Abstract
Celvrije genexpressie biedt de kracht van biologie zonder de complicaties van een levend organisme. Hoewel er veel van dergelijke genexpressiesystemen bestaan, zijn de meeste vrij duur om te kopen en / of vereisen ze speciale apparatuur en fijnmazige expertise om effectief te produceren. Dit protocol beschrijft een methode om bacterieel celvrij lysaat te produceren dat hoge niveaus van genexpressie ondersteunt, waarbij alleen standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en minimale verwerking vereist is. De methode maakt gebruik van een Escherichia coli-stam die een endolysine produceert die de groei niet beïnvloedt, maar die een geoogste celkorrel efficiëntlyseert na een eenvoudige vries-dooicyclus. De enige verdere verwerking die nodig is, is een korte incubatie gevolgd door centrifugering om het autolysaat van cellulair puin te verwijderen. Dynamische gencircuits kunnen worden bereikt door heterologe expressie van het ClpX-protease in de cellen vóór het oogsten. Een E. coli-stam zonder het lacZ-gen kan worden gebruikt voor hooggevoelige, celvrije biosensingtoepassingen met behulp van een colorimetrische of fluorescerende uitlezing. Het hele protocol vereist slechts 8-9 uur, met slechts 1-2 uur hands-on arbeid van inenting tot voltooiing. Door de kosten en tijd te verminderen om celvrij lysaat te verkrijgen, moet deze methode de betaalbaarheid van celvrije genexpressie voor verschillende toepassingen vergroten.
Introduction
Genexpressie in celvrije lysaten heeft verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van levende cellen1,2,3,4. Lysaten kunnen gemakkelijk biochemisch worden gemodificeerd en worden gebruikt in omstandigheden die schadelijk of onmogelijk te bereiken zijn in levende cellen. Genexpressiecircuits hoeven niet te concurreren met biologische processen van de gastheer en het testen van nieuwe genetische circuits is net zo eenvoudig als het toevoegen van DNA. Om deze redenen heeft celvrije genexpressie verschillende toepassingen gevonden, van biosensoren5,6 tot het snel prototypen van synthetische gencircuits7,8 tot het ontwikkelen van kunstmatige cellen9. De meeste celvrije genexpressie maakt gebruik van cellulaire lysaten die sterk zijn verwerkt, wat over het algemeen lange en complexe protocollen, gespecialiseerde apparatuur en / of gevoelige stappen vereist die kunnen leiden tot aanzienlijke variatie tussen gebruikers en batches10,11.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige, efficiënte methode voor het produceren van celvrij lysaat dat minimale verwerking en expertise vereist(Figuur 1A)12. De methode is gebaseerd op E. coli-cellen die zijn ontworpen om te lyseren na een eenvoudige vries-dooicyclus. De cellen drukken een endolysine uit faag lambda die de celwand afbreekt. Terwijl de cellen groeien, blijft dit endolysine achter in het cytoplasma, gesekwestreerd uit de celwand. Een eenvoudige vries-dooicyclus verstoort echter het cytoplasmatische membraan, waardoor de endolysine vrijkomt in het periplasma, waar het de celwand afbreekt, wat resulteert in snelle cellysis. Het protocol kan worden voltooid met slechts een paar uur hands-on werk en vereist alleen een vriezer, een centrifuge van 30.000 × g (voor optimale resultaten; lagere snelheden kunnen met meer zorg worden gebruikt om de pellet niet te verstoren), een vortexmixer en een eenvoudige bufferoplossing. Functioneel lysaat kan zelfs worden geproduceerd door de cellen te vriesdrogen en ter plaatse opnieuw te hydrateren. Deze methode produceert echter lysaten met een lagere activiteit, vermoedelijk als gevolg van het resterende celafval.
De lysaten zijn zeer actief voor celvrije genexpressie en ze kunnen op verschillende manieren worden verbeterd, afhankelijk van het eindgebruik. De snelheid van eiwitsynthese kan verder worden verhoogd door het lysaat te concentreren met behulp van standaard spinconcentrators. Lineair DNA kan worden beschermd tegen afbraak door het toevoegen van gezuiverd GamS-eiwit. Eiwitdegradatie, noodzakelijk voor complexere circuitdynamica zoals oscillatie, kan worden bereikt door een ClpX-hexameer in de autolysaatproducerende stamco-expressie te geven 13. Ten slotte worden op LacZ gebaseerde visuele uitlezingen mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een autolysaatbelasting zonder lacZ. Over het algemeen produceert deze methode zeer actief celvrij lysaat dat geschikt is voor een breed scala aan toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid media en buffers voor.
- Bereid 2xYTPG medium voor.
- Meng 62 g 2xYT poeder, 5,99 g kaliumfosfaat monobasisch, 13,93 g kaliumfosfaat dibasisch en gedeïoniseerd water tot 2 L.
- Autoclaaf op vloeistofcyclus met een belichtingstijd van 30 min14.
- Voeg aan 400 ml 2xYTP-media van 1.1.2 7,2 g D-glucose (dextrose) toe en meng tot het is opgelost.
- Filter-steriliseer door een filter van 0,2 μm.
- Bereid S30A-buffer voor.
- Meng Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM eindconcentratie), kaliumglutamaat (60 mM finale) en magnesiumglutamaat (14 mM finale).
- Stel de pH in op 7,7 met 10 M KOH.
- Oplossing 1 voorbereiden (zie tabel 1).
- Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonzuur (HEPES) in 2 ml water.
- Stel de pH in op 8,0 met KOH.
- Voeg alle andere componenten uit tabel 1toe.
- Stel de pH in op 7,6 met 10 M KOH. Filter-steriliseren.
- Bereid 2,5x premixoplossing (zie tabel 2).
- Meng alle componenten in tabel 2.
- Stel de pH in op 7,5 met KOH.
- Aliquot en invriezen bij -80 °C.
OPMERKING: Een reactie van 20 μL gebruikt 8,9 μL premix.
2. Bereid cellen voor.
- Strijk de autolysaatcellen op LB-agarplaten met 50 μg/ml ampicilline met behulp van een entingslus en groei bij 37 °C (zie noot 1).
- Kies een enkele kolonie in een startercultuur van LB /ampicillinemedium met behulp van een pipetpunt en kweek 's nachts bij 37 ° C.
- Ent 400 ml 2xYTPG-medium met 50 μg/ml ampicilline met 400 μL startcultuur en kweek bij 37 °C in een Erlenmeyer van 1 L, schuddend bij 300 tpm.
- Meet periodiek de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm (OD600) met behulp van een spectrofotometer om een optische cuvette met een padlengte van 1 cm af te lezen. Wanneer de OD600 groter is dan 1, begint u de cultuur 5-voudig te verdunnen vóór de metingen om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire bereik van een typische laboratoriumspectrofotometer blijven. Blijf de cellen kweken totdat de 5-voudig verdunde cultuur OD600 van 0,3 bereikt (overeenkomend met een cultuur OD600 van 1,5).
3. Bereid het lysaat voor.
- Bereid S30A-buffer aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT). Meng 3 ml S30A-buffer met 6 μL DTT-stamoplossing op 1 M. Plaats op ijs voor gebruik in stap 3.7.
- Oogst de cellen door 15 min bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 1800 × g.
- Gooi het supernatant weg door het af te gieten en een pipet te gebruiken om de resterende vloeistof te verwijderen.
- Resuspend de pellet in 45 ml koude (4-10 °C) S30A buffer met behulp van een vortex mixer.
- Weeg een lege centrifugebuis van 50 ml, breng de cellen erin over en herhaal stap 3.2-3.3 om de cellen te wassen.
- Weeg de pellet en trek het gewicht van een lege buis van 50 ml af. Zorg ervoor dat u het resterende supernatant zorgvuldig opademt om een nauwkeurige meting van het pelletgewicht te garanderen.
OPMERKING: Een typische opbrengst is ~ 1,3 g celkorrel uit 400 ml productiecultuur. - Voeg 2 volumes koude S30A-buffer toe aangevuld met 2 mM dithiothreitol, d.w.z. 2 ml buffer voor elke 1 g celkorrel, en resuspend de cellen door krachtig vortexmenging.
- Vries de cellen in. Plaats de buis van 50 ml met de cellen in een vriezer van -20 °C of -80 °C totdat de pellet goed bevroren is.
OPMERKING: De vriesstap is een goed stoppunt voor de dag. - Ontdooi de cellen in een waterbad op kamertemperatuur.
- Vortex krachtig gedurende 2-3 min.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten met schudden bij 300 tpm.
- Ruim het monster van zwaar celafval door het gedurende 45 minuten bij 45 minuten bij 4 °C in transparante centrifugebuizen bij 30.000 × g te centrifugeren.
OPMERKING: Als er geen centrifuge van 30.000 x g beschikbaar is, centrifugeer dan gedurende 45 minuten bij 21.000 × gen wees extra voorzichtig in stap 3.13, omdat de pellet minder compact zal zijn. - Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe buis met een pipet, zodat de pellet zoveel mogelijk wordt verstoord. Als het overgedragen supernatant verontreinigd is met materiaal uit de pellet, herhaalt u de vorige stap.
- Breng het supernatant over in 1,5 ml centrifugebuizen en centrifugeer nogmaals bij 21.000 × g (of de maximale snelheid van een tafelcentrifuge) gedurende 5 minuten.
- Vul het geklaarde autolysaat in de gewenste volumes, vermijd zorgvuldig resterende pellets en vries in bij -80 °C of gebruik het onmiddellijk.
OPMERKING: Een enkele reactie van 20 μL gebruikt 8 μL autolysaat.
4. Celvrije genexpressie
OPMERKING: Het autolysaat is nu klaar voor elk gewenst eindgebruik. Het volgende is een voorbeeld van een standaardprotocol voor celvrije genexpressie.
- Voor een reactie van 20 μL mengt u op ijs 8 μL autolysaat en 8,9 μL premix. Zie OPMERKING aan het einde van het protocolgedeelte met betrekking tot de optimalisatie van magnesiumglutamaat- en PEG 8000-concentraties.
- Voeg DNA (bijv. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 toe aan een eindconcentratie van 8 nM), eventuele andere reagentia en water aan 20 μL.
- Plaats de reactie in een 384-well microplaat en meet het fluorescentietijdverloop en/of eindpunten met behulp van een plaatlezer. Gebruik voor groen fluorescerend eiwit (GFP) een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.
5. Wijzigingen van het protocol
OPMERKING: De volgende wijzigingen van het protocol maken het mogelijk om andere toepassingen te bedienen.
- Celvrije genexpressie met behulp van lineaire DNA-sjablonen
- Voer de stappen in rubriek 4 uit en vul de reactie aan met 2,2 μM gezuiverd GamS-eiwit (uitgedrukt en gezuiverd zoals beschreven12) vóór de toevoeging van het lineaire DNA.
- Celvrije genexpressie met eiwitafbraak
- Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die het plasmide pACYC-FLAG-dN6-His bevatten (zie de tabel met materialen). Neem in alle groeimedia bovendien 34 μg / ml chlooramfenicol op.
- Neem in stap 2.3 40 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) op in het groeimedium om expressie uit het plasmide te induceren.
- Herhaal stap 3.2-3.4 (wassen) nog twee keer (voor een totaal van drie wasbeurten) om de volledige verwijdering van chlooramfenicol, een translatieremmer, te garanderen. Vervang voor de eerste twee wasbeurten (stap 3.4) de S30A-buffer door een fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4).
- Vul in stap 4.2 aan met een extra 3 mM ATP (toegevoegd uit een voorraadoplossing van 100 mM ATP in water, pH 7,2) en 4,5 mM magnesiumglutamaat (met behulp van een 1 M stockoplossing in water) (eindconcentraties) om het hoge ATP-gebruik door ClpXP te compenseren, evenals chelatie van magnesium door de extra ATP.
- Celvrije genexpressie met behulp van lacZ-gebaseerde uitlezingen (inclusief colorimetrisch)
- Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die lacz niet native tot expressie brengen (zie de tabel met materialen).
- Als alternatief kunt u het lysaat rechtstreeks uit gevriesdroogde cellen bereiden.
- Voer alle stappen van 1.1 tot 3.7 uit.
- Meng 8 μL celsuspensie met 8,9 μL premix.
- Voeg plasmide-DNA (indien gewenst), andere aangepaste reagentia en water toe om een eindvolume van 20 μL te bereiken.
- Breng de reactie over op een 384-well microplaat en vries deze te vriesdrogen.
OPMERKING: Gevriesdroogde monsters kunnen tot een week en mogelijk langer worden bewaard. - Om de reactie te beginnen, rehydrateert u het met 18 μL gedeïoniseerd water aangevuld met gewenst DNA of andere reagentia.
- Volg de fluorescentiedynamiek in een plaatlezer.
OPMERKING 1: Autolysaatcellen zijn ontworpen om te lyseren op een vries-dooicyclus, dus het is bijzonder belangrijk om cryoprotectant te gebruiken bij het maken van bevroren voorraden. We bevroren voorraden in 24% wt/vol glycerol en bewaarden ze bij -80 °C.
OPMERKING 2: Magnesiumionen en PEG 8000 zijn van cruciaal belang voor de prestaties van lysaat. Het basis 2,5x premix, gebaseerd op eerder gepubliceerde gegevens, bevat 6 mM magnesiumglutamaat en 4,8% wt/vol PEG 8000, die in de uiteindelijke reactie respectievelijk 2,4 mM en 1,9% worden. Het autolysaat dat hier met het protocol is bereid, presteert meestal het beste met een extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 in de uiteindelijke reactie. Dit kan echter worden geoptimaliseerd in het bereik van een extra 0-10 mM Mg glutamaat en een extra 0-3% PEG 8000 (vergeleken met de basis premix). Om het premix te bereiden met de aanbevolen extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 (eindconcentraties), mengt u 380 μL premix met 4,75 μL magnesiumglutamaat bij 1 M en 36,1 μL PEG 8000 bij 40% gewicht/volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten kunnen worden waargenomen door autolysaat te gebruiken om GFP uit te drukken uit een constitutief tot expressie brengend plasmide, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, en een tijdsverloop van GFP-fluorescentie in een plaatlezer te registreren (Figuur 1B). Een verdunningsreeks van plasmide-DNA vond sterke expressie, zelfs bij 1 nM DNA. In vergelijking met een in de handel verkrijgbaar lysaat kan het autolysaat een grotere totale opbrengst produceren en een grotere maximale productiesnelheid bereiken, berekend als de tijdderivaat van het GFP-tijdsverloop (Figuur 1C,D). Voor aanvullende resultaten met behulp van deze methode, zie Didovyk et al.12. Dit protocol heeft relatief weinig faalpunten; suboptimale resultaten kunnen echter worden verkregen als het autolysaat niet voldoende is opgeruimd van celresten. Optimale resultaten kunnen ook het optimaliseren van de concentraties PEG-8000 en Mg2+ voor elke batch lysaat vereisen (zie noot 2).
Figuur 1: Representatieve resultaten. (A) Visuele weergave van het protocol. (B) Voorbeeld tijdsverloop van GFP-expressie van pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 in een freeze-thaw autolysaat. Maximale GFP-productie(C)en maximale productiesnelheid(D)van autolysaat bereid in 2 verschillende laboratoria door 2 verschillende onderzoekers, met behulp van een centrifuge van 30.000 x g (blauw en oranje) of een centrifuge van 20.000 x g (paars), in vergelijking met een commercieel referentielysaat (oranje, MYtxtl-70-960M van MYcroarray). Alle foutbalken zijn gemiddelde absolute fout van twee technische replicaties. Dit cijfer is gewijzigd van 12. Copyright 2017 Amerikaanse Chemische Vereniging. Afkorting: GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing 1: Voeg water toe aan 4 ml totaal | |
| Naam | Gewicht (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| kamp | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Folinezuur | 1.9 |
| Gtp | 47.6 |
| Hepes | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidine | 8.1 |
| tRNA's | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabel 1: Oplossing 1. Componenten van oplossing 1.
| 2,5x voormengsel | |
| Reagens | Volume (μL) |
| Aminozuurmengsel met elk 24 mM, met uitzondering van leucine dat 20 mM bedraagt | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) op 100 mM | 100 |
| Magnesiumglutamaat op 1 M | 25 |
| PEG-8000 bij 40% wt/vol | 500 |
| Kaliumglutamaat op 2 M | 303 |
| Oplossing 1 (zie tabel 1) | 714.3 |
Tabel 2: Premix. Componenten van de premixoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol levert zeer actief bacterieel lysaat op voor celvrije genexpressie. De sleutel is om cellen te gebruiken die het plasmide pAD-LyseR dragen, dat de lambdafaag endolysine cytosolisch tot expressie brengt. Deze cellen worden gepotentieerd om zichzelf te lyseren bij permeabilisatie van het binnenmembraan, waardoor de endolysine toegang krijgt tot de celwand, wat de methode bereikt door een eenvoudige vries-dooicyclus. Omdat de cellen zichzelf effectief lyseren, wordt het product autolysaat genoemd. Nadat de cellen zijn gelyseerd, zijn de enige resterende stappen incubatie en centrifugering om het autolysaat van cellulair puin te verwijderen.
In vergelijking met andere methoden voor het produceren van bacterieel lysaat is deze aanpak opmerkelijk eenvoudig en snel, maar het offert de kwaliteit van het lysaat niet op. Het protocol kan worden voltooid in 8-9 uur na het inenten van de productiecultuur, met slechts 1-2 uur hands-on arbeid. Het enige aanbevolen apparaat dat niet helemaal standaard is voor laboratoria voor moleculaire biologie is een centrifuge die 30.000 × gkan bereiken. Autolysaat van vergelijkbare kwaliteit kan echter zelfs met een centrifuge met een lagere snelheid worden geproduceerd(figuur 1C,D); de gebruiker zou gewoon voorzichtiger moeten zijn met het verwijderen van het lysaat uit de pellet, misschien iets meer vloeistof achterlatend om schone monsters te garanderen. Deze eenvoud is niet alleen een kwestie van gemak; minder gecompliceerde protocollen hebben de neiging om meer reproduceerbare resultaten te leveren, met minder variatie wanneer ze met verschillende handen worden uitgevoerd. De modificatie in stap 5.4, waarbij cellen samen met alle andere reagentia worden gevriesdroogd, presenteert een nog eenvoudiger protocol, hoewel met verminderde eiwitproductieopbrengsten. Met name in deze modificatie worden de centrifugatiestappen om het lysaat van cellulair puin te verwijderen overgeslagen, wat de verwerkingsarbeid verder vermindert; het resterende puin vermindert echter de expressie van het lysaat12.
In de afgelopen jaren zijn veel benaderingen voor het produceren van celvrij lysaat gepubliceerd, onlangs samengevat door Cole et al.15. Deze studies hebben verschillende strategieën onderzocht voor celtype, groeiomstandigheden, lysismethoden en nabewerking. De meeste andere methoden voor lysis vereisen gespecialiseerde apparatuur zoals een Franse pers, homogenisator, kralenklopper of sonicator. Fujiwara en Doi hebben deze apparatuur weggelaten ten gunste van een vries-dooicyclus vergelijkbaar met de hier beschreven cyclus, behalve dat ze de cellen vatbaar maakten voor lysis door ze te behandelen met lysozym in plaats van een endolysine uit te drukken16. Hoewel dit ongeveer net zo'n eenvoudig protocol is als het hier beschreven protocol, moeten de met lysozymen behandelde cellen worden gewassen terwijl ze zich in hun fragiele toestand bevinden zonder ze voortijdig te verstoren, wat experimentele finesse kan vereisen en een bron van variabiliteit kan introduceren.
Naast lysaat vereist celvrije genexpressie een premixoplossing met energiebronnen, RNA- en eiwitmonomeren en andere kleine moleculen. Het premix recept werd eerder beschreven en geoptimaliseerd17, met een paar aanpassingen. Het hier gebruikte premix bevatte ongeveer 4 keer hogere concentraties aminozuren, evenals extra magnesiumglutamaat en PEG 8000, overeenkomend met eindreactieconcentraties van respectievelijk 7,5 mM en 3,5% gewicht/volume. Optimale resultaten kunnen het mogelijk vereisen dat de aanvullende magnesiumglutamaat- en PEG 8000-concentraties voor elke nieuwe partij lysaat worden aangepast, hoewel de bovenstaande concentraties consequent goede resultaten hebben opgeleverd (zie opmerking 2). Unieke toepassingen kunnen vereisen dat deze concentraties opnieuw worden geoptimaliseerd, bijvoorbeeld bij het gebruik van ClpX-aangevuld lysaat13.
Een standaard E. coli stam voor de productie van celvrij lysaat is BL21-Gold (DE3). Een derivaat van deze cellen dat het autolyseplasmide pAD-LyseR bevat, is gedeponeerd in een stam- en plasmidenrepository (zie de Tabel met Materialen). Ook beschikbaar zijn een derivaat zonder genomisch lacZ om de achtergrond drastisch te verminderen voor circuits die lacz-gebaseerde output gebruiken en een expressieplasmide pAD-GamS om te worden gebruikt voor de zuivering van het GamS-eiwit dat lineair DNA kan beschermen tegen degradatie. Deze celstammen en plasmiden zouden nuttig moeten zijn voor een verscheidenheid aan toepassingen in celvrije genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H. is mede-oprichter van GenCirq Inc, dat zich richt op kankertherapieën. Hij zit in de Raad van Bestuur en heeft aandelen in GenCirq.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Zachary Sun en Richard Murray (California Institute of Technology) voor het leveren van het plasmide P_araBAD-gamS, en Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) voor het vriendelijk leveren van een snelle koelcentrifuge. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en van het ARO MURI-programma en werd gedeeltelijk ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
