Abstract
基于膜的横向流动免疫色谱条（ICSs）是低成本自我诊断的有用工具，已有效地应用于毒素、生理指标和临床生物标志物检测。在此协议中，我们提供了开发快速、敏感和定量横向流动免疫分析（使用 AuNPs 作为标记和 mAbs 作为探头）的步骤的详细描述。该过程描述了胶体黄金的制备和定性、AuNP-mAb结合体的合成、免疫色谱条的组装以及检测的方法学研究。结果表明，最终条带可进一步用于小分子的快速、方便的自我诊断，为快速、准确地分析生理和生物指标提供了替代工具。
Introduction
基于膜的横向流动免疫色谱条 （ICS） 是低成本和快速检测的有用工具。硝基纤维素膜作为载体，胶体金作为免疫色谱快速诊断试剂的标志，是最常用的POCT（护理点测试）方法，项目测试范围更广。从他们最初在怀孕期间监测的应用，他们的使用已扩大到监测血液凝固状态1，2，心肌损伤3，兽药4，农药残留5，传染病6和药物浓度。更多的样本类型可以评估，包括尿液，唾液，全血，血清和其他体液7，8，9。
近年来，在疾病诊断中，已经开发出许多用于检测生物标志物的新检测方法，包括 HPLC、UPLC、LC-MS 和 ELISA，它们敏感、准确、可信和具体。然而，这些方法需要复杂的仪器，复杂的预处理和耗时的治疗9。因此，制定一种更快速、更方便的护理点诊断策略，对药用活性化合物进行自我和实时检测，是当务之急。
ICS 的流行，特别是对于常见的测试，是由其易用性驱动的，因为它们不需要专业人员或精心设计的工具设置12。换句话说，没有接受过特殊训练的人可以操作条形或自考13。测试结果可在5分钟内获得，这意味着可用于现场检查14。此外，根据我们的计算，条的成本可能低于1元15，这意味着测试是便宜的推广16。因此，ICS 是一种相对准确、简单、廉价的一次性设备。基于胶体金17、18的ICS也应用于COVID-19的快速检测。
ICS 的原则可分为三明治 ICS 和具有竞争力的 ICS。 图1A 是三明治ICS的示意图，主要用于检测大分子物质，如蛋白质，包括肿瘤标记物、炎症因子和人类胆汁性腺激素（HCG，早孕抗原）。在这种方法中，使用针对抗原不同表位的配对抗体，并将捕获抗体作为测试线干燥在NC膜上。标记的抗体在结合垫上干燥，二级抗体用作控制线。
图1B 是竞争ICS的示意图，主要用于检测小分子物质（MWCO<2000 da）。涂层抗原固定在NC膜上作为测试线，标记的抗体在结合垫上干燥。在检测过程中，样品和标记的抗体在毛细管作用经检测线，涂层抗原在样品中具有竞争力地结合自由抗原，并在检测线上形成红色。
最近，我们描述了单克隆抗体生成对天然产品19的程序。在这项工作中，我们开发了一种新的横向流动免疫分析基于准备的抗SSD mA20 进行快速、现场检测。结果表明，免疫色谱检测是检测天然产品衍生化合物不可或缺的便捷工具。
图1 免疫色谱测定（A）三明治免疫色谱测试条的示意图图。（B） 间接竞争免疫色谱测试条。这个数字已经从张等人修改，2018年21日。请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
本研究的所有程序均获北京中医药大学伦理审查委员会批准（批准号2017BZYYL00120）。
1. 胶体黄金的制备和定性
注：用于胶体黄金合成， 由于胶体金容易吸附在容器内壁上，容易被杂质沉淀，因此应彻底清洗和浸泡在酸（40 mL蒸馏水、360mL浓缩硫酸、20克二色二铬钾）中，或进行表面钝化处理。使用柠檬酸还原法合成胶体金。
- 打开磁搅拌器，将烧瓶（250 mL）放在搅拌机上。
- 分别准备4%的氯化金酸溶液和1%的柠檬酸钠溶液。
- 将120mL蒸馏水加入圆形底烧瓶中，加热至恒温磁搅拌器上沸腾。
- 继续煮沸，并迅速加入 0.5 mL 的 4% 氯酸和 5 mL 的 1% 柠檬酸钠。
- 观察溶液的颜色。淡黄色的氯酸溶液在几分钟内将葡萄酒变红。
- 继续加热10分钟，直到溶液从无色变为透明葡萄酒红。
- 关闭恒温磁性搅拌机的功率，冷却至室温，并将混合物移到干净的瓶子中。将其存储在 4 °C 下。
- 通过紫外线光谱和 TEM 成像确定 AuNPs 的大小和形态。
注：通过改变柠檬酸钠和氯酸的比例，可以获得不同尺寸的胶体金颗粒，用于各种应用。
2. 合成奥恩普斯 - 马布结合
注：由于抗体通过静电吸附与胶体金结合，蛋白质和胶体金表面的电荷直接影响结合强度：因此，缓冲pH值是影响抗体-胶体黄金结合稳定性的重要因素。SSD 和防 SSD mAb 被用作本协议中示例。
- 耦合 pH 值评估
- 将 100 μL 的 NaCl 溶液（10% m/v）添加到 8 个管中。
- 调整在pH 5，6，7，8，9，10，11和12的AuNP解决方案与0.1M K2CO3。
- 在含有 NaCl 的 8 个管中加入 100 μL 胶体金溶液 （pH 调整后的 5-12）。
- 让解决方案在混合后站立几分钟。观察每个管溶液的颜色变化，并记录保持红色的管子。
- 选择 K2CO3 和稳定溶液颜色添加最少的 pH 值作为准备 AuNP-mAb 结合的最佳 pH 值。
注意：不要使用 pH 表，因为探头可能被 AuNPs 销毁。
- 抗体量评估
- 在 8 个管中加入 100 μL 的 NaCl 溶液（10% m/v）。
- 在每个管子中加入 100 μL 胶体金溶液，并加入最佳 pH 值。
- 将单克隆抗体溶液（蛋白质浓度 0.1 毫克/mL-3.2 毫克/毫克）添加到上述 8 个管中。
- 让解决方案在混合后站立几分钟。观察每个管溶液的颜色变化，并记录保持红色的管子。
- 选择 MAb 浓度最低且溶液颜色稳定的抗体量作为准备 AuNP-mAb 结合的最佳 mAb 量。
- 准备悬浮缓冲：添加 1 M Tris-HCl （pH 8.8）、1% （w/v） BSA、0.5% （v/v） Tween 20 和 1% （v/v） PEG 20000 并混合良好。
- AuNP-mAb 结合的合成
- 采用 10 mL 胶体金溶液，使用 0.1 M K2CO3 将溶液调整为最佳 pH 值。
- 在适当浓度下慢慢添加 SSD mAbs，并在室温下摇动 30 分钟。
- 在 83 x g（1，000 rpm）下将混合物离心 10 分钟，在 4 °C 下。 去除沉淀物，其中含有杂质或沉淀的胶体金。
- 在 8，330 x g（10，000 rpm）下将混合物离心 30 分钟，在 4 °C 下。 丢弃超高纳特，沉淀物是胶体金-mAb结合体。
- 添加悬浮缓冲器以分离降水。
3. 大道大会
注：对于以后的流动免疫分析，膜材料的选择和预处理将直接影响试验，应对此进行调查。免疫色谱条由样品垫、结合垫、硝基纤维素（NC）膜、吸水垫和PVC板（图1）组成。应通过立体显微镜检查和评估膜材料，以消除不均生性。
- 将 NC 膜粘贴在 PVC 板上，与板的吸附端边缘相距 2 厘米。
- 将 SSD-BSA （2 毫克/兆升） 滴入 NC 膜（与上缘相距 2 厘米）作为测试线（1 毫米宽），并在 NC 膜（2 厘米（与下边缘相距 2 厘米）上向下添加山羊抗鼠标 IgG（1.5 毫克/毫升）作为控制线（1 毫米宽）。控制添加的蛋白质量。
- 将吸水垫连接到 NC 膜上方的 PVC 板上，使其与 NC 膜重叠 2 mm。
- 将玻璃纤维膜浸入 AuNPs-mAb 结合溶液中。在 37 °C 下干燥孵化器中的湿膜。
- 将玻璃纤维膜修剪到 5 厘米长、2 厘米宽，并将其用作结合垫。
- 将经过预处理的结合垫粘贴在 NC 膜下。与 NC 膜重叠的长度应为 0.1 厘米。
注：玻璃纤维膜具有很强的结合和释放蛋白质的能力。 - 将融合 3 膜修剪到 1.8 厘米长、3.5 厘米宽，并将其用作示例垫。
- 将样品垫粘贴在 PVC 板上，并与结合垫重叠 2 mm。
- 使用切割机将组装好的纸板切成 3.5 毫米宽的条状，然后使用批量层压系统将其压缩。
- 最后，将测试条放入外壳中，密封在装有干燥剂的铝箔袋中，并存放在远离光线的地方。ICS 现已组装完毕。
注：以上是实验室程序。在生产中，黄金喷洒设备和跨膜仪器用于喷洒黄金和制造T和C线。
4. 定量检测
- 将 50 μL 的样品溶液滴入样品孔以观察色谱过程。
注：由于吸水垫驱动的毛细子作用，样品溶液迁移到条带的另一端。当样品溶液到达结合垫时，样品中的 SSD （抗原） 与预装在垫子上的 AuNPs-mAb 发生反应。当溶液迁移并到达 T 线时，没有 SSD 的 AuNPs-mAb 可被 SSD-BSA（抗原载体蛋白结合体）选择性捕获，在 T 线上显示为红色。然后，溶液迁移到 C 线，其中 AuNPs-mAb 被该地区的山羊反鼠标 IgG 捕获，从而在 C 线上显示为红色。 - 使用便携式脱衣舞阅读器分析条带。机器可以提供测试线与控制线 （T/C） 的比例。
- 评估 ICS 测试的特异性、灵敏度、可重复性和稳定性。
注：在定性检测下，一条红线表示正结果（控制线）。两条红线表示负结果（测试和控制线）。如果不存在控制线，则测试被视为无效。
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Representative Results
胶体黄金的特征
准备好的胶体黄金溶液是克拉雷特红色。TEM 分析用于确定 AuNPs 的形态和形状（图 2A-D）。图2A和图2B显示，粒子呈多面体形状，分布均匀。发现 AuNPs 的平均直径约为 14 nm（图 2C）。AuNPs 的高分辨率 TEM （HRTEM） 图像显示在图 2D和图 2E 中。从单个 AuNP 拍摄的 HRTEM 图像显示了间距为 0.117 nm 的连续边缘模式。五种金胶体溶液的紫外线吸收峰值为518纳米、521纳米、524纳米、534纳米和540纳米，表明颗粒大小随着柠檬酸钠的减少而略有增加（图2F）。
图2 胶体黄金的特征。（A） AUNPs的 TEM 图像（100，000× 放大）。（B） AUNPs 的 TEM 图像 （500，000× 放大）。（C） AuNPs 的大小分布。如 TEM 图像所示，AuNPs 的直径从 10 纳米到 18 纳米不等，平均直径约为 14 纳米。（D， E）AuNPs 的高分辨率 TEM （HRTEM） 图像。从单个 AuNP 拍摄的 HRTEM 图像显示了间距为 0.117 nm 的连续边缘模式。（F） 不同 AuNP 的紫外线吸收光谱，范围从 10 纳米到 18 纳米不等。这个数字已经从张等人修改，2018年21日。请单击此处查看此图的较大版本。
油尺评估
ICS 的敏感性
为了确定ICS的灵敏度，免疫色谱条用于检测各种不同浓度的SSD（150，000，60，000，12，000，2400，480和96 ng/mL）标准样品（图3A）。双蒸馏水用作控制。在定量实验中，条状物由 JY1502GS 便携式 ICS 读取器（图 3B-C）扫描。线性回归方程为 y = +0.113ln （x） = 1.5451，相关系数 （R2） 为 0.983 （图 3D）。它在 96 ng/mL 到 150 μg/mL 时表现出良好的线性。IC50 值为 10.39 μg/mL。在定量实验中，建议最佳测试时间为10分钟。
图3 SSD横向流动免疫分析的特征。 （A） 使用 ICS 检测含有不同浓度 SSD 的标准解决方案的结果照片。（B） 匹配胶体黄金扫描的照片 。 （C） 胶体黄金定量仪器扫描的测控线的强度模式。（D） 使用 ICS 进行 SSD 测定的 iceliSA 标准曲线。回归方程为 y = +0.113ln （x） = 1.5451，相关系数 （R2）为 0.983。这个数字已经从张 等人修改，2018年21日。 请单击此处查看此图的较大版本。
ICS 的特殊性
通过评估与 SSD 类似化合物的交叉反应性，测试了 ICS 的特异性。 表1 显示了ICS与SSD相关化合物的交叉反应。可以清楚地看到，ICS只与SSA的交叉反应率较低，与其他化合物（包括SSc、SSb1或SSb2（表1）没有交叉反应，这表明所准备的ICS具有很高的特异性。
| 样品 | 一个集成电路 | b伊塞利萨 |
| (%) | (%) | |
| SSD | 100 | 100 |
| 莎 | 4.30% | 4.97% |
| SSb1 | <0.09 | <0.09 |
| SSb2 | <0.09 | <0.09 |
| SSc | <0.09 | <0.09 |
表1。ICS 和 icELISA 测量的化合物的交叉反应。 ICS 的特异性由 ICS（a） 和 icELISA（b）进行评估。此表已从张 等人修改，2018年21月21日。
恢复率
如表2所示，平均回收率为102.05%（平均±SD，n = 3）。基于其准确性和一致性，此检测对于在生物样本中确定 SSD 非常可靠。
| SSd 浓度 | 测试系统（ng/mL）建立的SSd浓度 | 恢复 （%） |
| （ng/mL） | ||
| 100 | 135.72 ± 61.97 | 135.72 ± 61.97 |
| 1000 | 926.59 ± 114.24 | 92.66 ± 11.42 |
| 10000 | 11128.16 ± 745.75 | 111.28 ± 14.12 |
表2。SSD 的恢复率。 数据是 SSD 每个峰值浓度的三重样本中± SD 的平均值。恢复百分比计算如下：恢复 （%） = 测量金额/金额× 100%。此表已从张 等人修改，2018年21月21日。
ICS 检测的稳定性分析
为了评估 ICS 的稳定性，对存储了 8 周和 16 周的测试条进行了测试，并与新准备的条进行了比较。 表3 显示，存储和新准备的负样本和阳性样品条的结果基本没有变化，表明ICS可以在室温下存储至少几个月，并且适合大规模推广和应用。
| RSD % | |||
| SSD （ng/mL） | 1 天a | 4 周b | 8 周c |
| 125 | 2.41 | 3.11 | 3.51 |
| 250 | 2.52 | 4 | 3.52 |
| 500 | 2.44 | 3 | 5.2 |
| 1000 | 3.12 | 2.71 | 4.5 |
表3。用于分析 SSD 的 ICS 之间的变化。 a值表示制造后 1 天使用的 3 条不同条上的三重样品的方差系数。b值表示存储 4 周后使用的 3 条不同条上的三重样品的方差系数。c值表示存储 8 周后使用的 3 个不同条上的三重样品的方差系数。此表已从张等人修改，2018年21月21日。
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Discussion
在这项工作中，我们提出了针对天然产品衍生小分子制备 mAb 的协议。已经概述了程序中需要注意的基本步骤和事项，我们以小分子SSD为例证明了该协议的效用。代表性数据中显示了示例光谱、TEM 图像、定量结果和方法研究。因此，我们已经证明，在这里提出的胶体黄金生产、AuNP-mAb结合和脱衣装配策略，创造了一种可用于快速检测目标分子的新型免疫分析。
免疫色谱条易于操作，反应非常迅速。只需要 50 μL 的样品，检测在 5 分钟内完成。相比之下，ELISA 方法（也是免疫分析方法）需要几个小时，包括多次清洗和长期孵化。多次洗涤和长时间的潜伏期可以有效地去除样品基质的非特异性反应，通过增加信号值来提高信号与噪声比和灵敏度。这意味着断层印刷纸的抗干扰能力和优化技术是本研究需要解决的关键问题。技术优化可以通过多种方式实现。选择适合样品垫和结合垫的材料。适当增加样品垫的长度，以有效提高样品的预处理能力。材料预处理的高pH值、高离子强度和高缓冲能力可用于避免影响因素，如生物样品pH值的抗原抗体反应。由于"三高"的条件设置会干扰抗体的结合，应综合考虑。
此外，还必须注意，单克隆抗体 （mAb） 是条带上的探针。因此，此过程与 mAb 的灵敏度相关联。我们应用的 mAb 是在我们之前的工作17中准备的，mAb 的制作可以引用在我们以前的出版物19中。
胶体金基免疫色谱条被广泛使用，因为它们价格低廉，提供方便的检测。但是，这种方法有其自身的局限性和稳定性问题。AuNPs 的信号强度低于荧光染料、胶体碳和其他标记物的信号强度，这意味着灵敏度有限。当暴露在空气中时，AuNPs 从葡萄酒红色变为紫色，这将导致灰色值的变化，并影响定量检测。因此，各种改性免疫色谱条已经出现，我们还准备了量子点标记荧光条22 和IgY为基础的免疫色谱条23，具有类似的生产程序。
基于膜的免疫检测已广泛应用于临床指标、传染病、农药残留和药物浓度监测。在此协议中，我们专注于为小分子天然产品准备基于 AuNP 的方法。此过程作为开发各种目标免疫分析的模板，可有效地用作评估和质量控制的分析工具。
这项工作为基于免疫色谱条的横向流动免疫分析的发展提供了详细的协议，用于快速、敏感和定量检测小分子。此过程包括胶体黄金的制备、AuNP-mAb 结合的合成、条带的组装和方法学调查。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中央直属高等学校基础研究经费专项资金的支持。我们感谢北京中医药大学经典处方基础研究团队的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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