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Biochemistry

छोटे अणु यौगिकों के त्वरित और मात्रात्मक पता लगाने के लिए पार्श्व प्रवाह इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप का विकास

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62754
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 4
1School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3National Institute of TCM Constitution and Preventive Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 4Center of Scientific Experiment, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

झिल्ली आधारित पार्श्व प्रवाह इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स (आईसीएसएस) कम लागत वाले आत्म-निदान के लिए उपयोगी उपकरण हैं और इसे टॉक्सिन, शारीरिक सूचकांक और नैदानिक बायोमार्कर डिटेक्शन पर कुशलतापूर्वक लागू किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे (एक मार्कर और एक जांच के रूप में mAbs के रूप में AuNPs का उपयोग कर) विकसित करने के लिए कदम का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । प्रक्रिया कोलाइडियल सोने की तैयारी और लक्षण वर्णन, AuNP-mAb conjugate के संश्लेषण, इम्यूनोक्रोमेग्राफिक पट्टी की विधानसभा, और परख की पद्धति जांच का वर्णन करता है। परिणामों से पता चला है कि अंतिम स्ट्रिप्स को एक छोटे अणु के तेजी से और सुविधाजनक आत्म-निदान के लिए आगे उपयोग किया जा सकता है, जो शारीरिक और जैविक सूचकांकों के तेजी से और सटीक विश्लेषण में एक वैकल्पिक उपकरण प्रदान कर सकता है।

Introduction

झिल्ली आधारित पार्श्व प्रवाह इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स (आईसीएसएस) कम लागत और तेजी से पता लगाने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। रोगी क्रोमेटोग्राफी रैपिड डायग्नोस्टिक रिएजेंट्स के मार्कर के रूप में वाहक और कोलॉयडल गोल्ड के रूप में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली पॉक्सोटी (देखभाल परीक्षण का बिंदु) विधि है, और परियोजना का परीक्षण दायरा व्यापक है। गर्भावस्था के दौरान निगरानी में उनके मूल आवेदन से, उनके उपयोग को रक्त जमावट राज्य1,2,मायोकार्डियल चोट3,पशु चिकित्सा4,कीटनाशक अवशेष5,संक्रामक रोग6 और नशीली दवाओं की सांद्रता की निगरानी के लिए बढ़ाया गया है। अधिक प्रकार के नमूनों का आकलन किया जा सकता है, जिसमें मूत्र, लार, पूरे रक्त, सीरम और शरीर के अन्य तरल पदार्थ7,8,9शामिल हैं।

हाल के वर्षों में, एचपीएलसी, यूपीएलसी, एलसी-एमएस और एलिसा सहित विकारों के निदान में बायोमार्कर का पता लगाने के लिए कई उपन्यास परख विकसित की गई हैं, जो संवेदनशील और सटीक, विश्वसनीय और विशिष्ट हैं। हालांकि, इन तरीकों के लिए परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन, जटिल प्रीप्रोसेसिंग और समय लेने वाले उपचार9की आवश्यकता होती है। इसलिए, औषधीय सक्रिय यौगिकों का आत्म-और वास्तविक समय का पता लगाने के लिए अधिक तेजी से और सुविधाजनक बिंदु-देखभाल नैदानिक रणनीति विकसित करना अत्यावश्यक10,11है।

आईसीएसएस की लोकप्रियता, विशेष रूप से सामान्य परीक्षणों के लिए, उनके उपयोग में आसानी से प्रेरित है, क्योंकि उन्हें पेशेवरों या विस्तृत वाद्य सेटअप12की आवश्यकता नहीं है। दूसरे शब्दों में, जिन लोगों के पास विशेष प्रशिक्षण नहीं है, वे स्ट्रिप्स या सेल्फ-टेस्ट13संचालित कर सकते हैं । परीक्षण के परिणाम 5 मिनट में प्राप्त किए जा सकते हैं, जिसका अर्थ है कि इसका उपयोग साइट निरीक्षण14के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हमारी गणना के अनुसार, स्ट्रिप्स की लागत 1 आरएमबी15से कम हो सकती है, जिसका अर्थ है कि परीक्षण16को बढ़ावा देने के लिए सस्ती हैं। इसलिए, आईसीएस एक अपेक्षाकृत सटीक, सरल और सस्ती डिस्पोजेबल डिवाइस है। कोलाइडियल गोल्ड17, 18पर आधारित आईसीएसएस भी रैपिड कोवीड-19 डिटेक्शन में लागू किया जाता है।

आईसीएस के सिद्धांत को सैंडविच आईसीएस और प्रतिस्पर्धी आईसीएस में बांटा जा सकता है। चित्रा 1A सैंडविच आईसीएस का एक योजनाबद्ध आरेख है, जिसका उपयोग मुख्य रूप से प्रोटीन जैसे मैक्रोमॉलिकुलर पदार्थों का पता लगाने के लिए किया जाता है, जिसमें ट्यूमर मार्कर, भड़काऊ कारक और मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन (एचसीजी, अर्ली प्रेगनेंसी एंटीजन) शामिल हैं। इस विधि में, एंटीजन के विभिन्न एपिटोप पर लक्षित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, और कैप्चर एंटीबॉडी को परीक्षण लाइन के रूप में एनसी झिल्ली पर सुखाया जाता है। लेबल एंटीबॉडी को कंजूगेट पैड पर सुखाया जाता है, और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग नियंत्रण रेखा के रूप में किया जाता है।

चित्रा 1B प्रतिस्पर्धी आईसीएस का एक योजनाबद्ध आरेख है, जिसका उपयोग मुख्य रूप से छोटे अणु पदार्थों (MWCO < 2000 डीए) का पता लगाने के लिए किया जाता है। कोटिंग एंटीजन एक परीक्षण लाइन के रूप में नेकां झिल्ली पर तय किया जाता है, और लेबल एंटीबॉडी conjugate पैड पर सूख जाता है । पता लगाने के दौरान, नमूना और लेबल एंटीबॉडी प्रवाह केशिका कार्रवाई के तहत पता लगाने लाइन के माध्यम से, और लेपित एंटीजन प्रतिस्पर्धी नमूने में मुफ्त एंटीजन बांधता है और पता लगाने की रेखा पर एक लाल रंग विकसित करता है ।

हाल ही में, हमने प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन की प्रक्रिया19वर्णित की है। इस काम में, हमने तेजी से, साइट पर पता लगाने के लिए तैयार एंटी-एसएसडी एमए20 के आधार पर एक उपन्यास पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे विकसित किया। परिणामों से संकेत मिलता है कि इम्यूनोक्रोमेटोग्राफी परख प्राकृतिक उत्पाद-व्युत्पन्न यौगिकों का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य और सुविधाजनक उपकरण है।

Figure 1
इम्यूनोक्रोमेटोग्राफी परख का चित्र 1 योजनाबद्ध आरेख(ए)सैंडविच इम्यूनोक्रोमेटोग्राफिक टेस्ट स्ट्रिप्स। (ख)अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी प्रतिरक्षा क्रोमेग्राफिक टेस्ट स्ट्रिप्स। इस आंकड़े को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है . , २०१८21। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

इस अध्ययन में किए गए सभी प्रक्रियाओं को बीजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन (अनुमोदन संख्या 2017BZYYL00120) में एथिक्स रिव्यू कमेटी द्वारा मंजूरी दी गई थी ।

1. कोलाइडियल गोल्ड की तैयारी और लक्षण वर्णन

नोट: कोलॉयडल गोल्ड संश्लेषण के लिए, के रूप में कोलॉयडल सोना आसानी से पोत की भीतरी दीवार पर सोख जाता है और अशुद्धियों द्वारा वर्षा का खतरा होता है, संश्लेषण और कोलॉयडल सोने के भंडारण के लिए पोत को अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए और एसिड में भिगोया जाना चाहिए (40 मिलीएल आसुत पानी, केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड का 360 एमएल, 20 ग्राम पोटेशियम डिक्रोमेट) या सतह पासिवेशन उपचार के अधीन। कोलाइडियल सोने को संश्लेषित करने के लिए एक साइट्रिक एसिड रिडक्शन विधि का उपयोग किया गया था।

  1. चुंबकीय उभारक चालू करें और फ्लास्क (250 एमएल) को मिक्सर पर रखें।
  2. क्रमशः 4% गोल्ड क्लोराइड एसिड सॉल्यूशन और 1% सोडियम साइट्रेट सॉल्यूशन तैयार करें।
  3. एक गोल नीचे फ्लास्क में आसुत पानी के 120 एमएल जोड़ें और इसे थर्मोस्टैटिक मैग्नेटिक स्टरर पर उबलने के लिए गर्म करें।
  4. उबलते रहें, और जल्दी से 4% क्लोरोएरिक एसिड के 0.5 एमएल और 1% सोडियम साइट्रेट के 5 एमएल जोड़ें।
  5. समाधान के रंग का निरीक्षण करें। पीला पीला क्लोरोएरिक एसिड समाधान कुछ ही मिनटों के भीतर शराब लाल हो जाता है।
  6. 10 मिनट के लिए हीटिंग जारी रखें, जब तक समाधान रंगहीन से पारदर्शी शराब लाल रंग में बदलता है।
  7. थर्मोस्टैटिक मैग्नेटिक मिक्सर की शक्ति को बंद करें, कमरे के तापमान में ठंडा करें, और मिश्रण को एक साफ बोतल में ले जाएं। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी और TEM इमेजिंग द्वारा AuNPs के आकार और आकृति विज्ञान का निर्धारण करें।
    नोट: विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए कोलॉयड सोने के कणों के विभिन्न आकारों को साइट्रेट सोडियम और क्लोरोरिक एसिड के अनुपात को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है।

2. AuNPs-mAb Conjugate के संश्लेषण

नोट: चूंकि एंटीबॉडी इलेक्ट्रोस्टैटिक सोखने द्वारा कोलॉयडल गोल्ड से बांधते हैं, इसलिए प्रोटीन और कोलॉयडल गोल्ड की सतह पर शुल्क सीधे बाध्यकारी तीव्रता को प्रभावित करते हैं; इसलिए, बफर पीएच मूल्य एंटीबॉडी-कोलॉयडल गोल्ड कंजूगेट की स्थिरता को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक है। एसएसडी और एंटी-एसएसडी एमएबी का उपयोग इस प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में किया जाता है।

  1. युग्मन पीएच का मूल्यांकन
    1. आठ ट्यूबों में एनएसीएल समाधान (10% m/v) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    2. 0.1 एम के2सीओ3के साथ पीएच 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 और 12 पर AuNP समाधान समायोजित करें।
    3. एनएसीएल युक्त आठ ट्यूबों में कोलाइडियल गोल्ड सॉल्यूशन (पीएच समायोजित 5-12) के 100 माइक्रोल जोड़ें।
    4. सम्मिश्रण के बाद समाधानों को कई मिनट तक खड़े होने दें। प्रत्येक ट्यूब समाधान के रंग परिवर्तन का निरीक्षण करें, और लाल रहता है कि ट्यूब रिकॉर्ड।
    5. AuNP-mAb conjugates तैयार करने के लिए इष्टतम पीएच मूल्य के रूप में K2CO3 और स्थिर समाधान रंग के कम से कम अतिरिक्त के साथ पीएच मूल्य चुनें।
      नोट: पीएच मीटर का उपयोग न करें क्योंकि जांच को AuNPs द्वारा नष्ट किया जा सकता है।
  2. एंटीबॉडी राशि का मूल्यांकन
    1. आठ ट्यूबों में एनएसीएल समाधान (10% m/v) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    2. प्रत्येक ट्यूब में इष्टतम पीएच के साथ कोलाइडल गोल्ड सॉल्यूशन का 100 माइक्रोल जोड़ें।
    3. ऊपर की आठ ट्यूबों में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सॉल्यूशंस (प्रोटीन कंसंट्रेशन 0.1 मिलीग्राम/एमएल-3.2 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें।
    4. सम्मिश्रण के बाद समाधानों को कई मिनट तक खड़े होने दें। प्रत्येक ट्यूब समाधान के रंग परिवर्तन का निरीक्षण करें, और लाल रहता है कि ट्यूब रिकॉर्ड।
    5. AuNP-mAb conjugates तैयार करने के लिए इष्टतम mAb राशि के रूप में एमएबी और स्थिर समाधान रंग की सबसे कम एकाग्रता के साथ एंटीबॉडी राशि चुनें।
  3. रिस्पेजन बफर तैयार करें: 1 एम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.8), 1% (w/v) बीएसए, 0.5% (v/v) ट्वीन 20 और 1% (v/v) खूंटी 20000 जोड़ें और अच्छी तरह से ब्लेंड करें।
  4. AuNP-mAb संजूगेट का संश्लेषण
    1. कोलाइडियल गोल्ड सॉल्यूशन के 10 एमएल लें और इष्टतम पीएच वैल्यू के समाधान को समायोजित करने के लिए0.1 एम के2सीओ 3 का उपयोग करें।
    2. धीरे-धीरे उचित सांद्रता पर एसएसडी एमएबी जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 83 x ग्राम (1,000 आरपीएम) पर मिश्रण को सेंट्रलाइज करें। उस उपजी को हटा दें, जिसमें अशुद्धियां या उपजी कोलाइडियल सोना होता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 8,330 x ग्राम (10,000 आरपीएम) पर मिश्रण को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्यागें, और वर्षा कोलॉयडल गोल्ड-माब संजूगेट है।
    5. वर्षा को अलग करने के लिए पुनः निलंबन बफर जोड़ें।

3. पट्टी की विधानसभा

नोट: बाद में प्रवाह इम्यूनोस कहते हैं, झिल्ली सामग्री का चयन और पूर्व उपचार सीधे परीक्षण को प्रभावित करेगा, जिसकी जांच की जानी चाहिए। इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप में एक नमूना पैड, एक कंजूगेट पैड, एक नाइट्रोसेल्यूलोस (एनसी) झिल्ली, एक शोषक पैड और एक पीवीसी बोर्ड(चित्रा 1) होते हैं। झिल्ली सामग्री की जांच की जानी चाहिए और स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए ताकि इनोजेनिटी को खत्म किया जा सके।

  1. बोर्ड के सक्शन एंड के किनारे के अलावा एक पीवीसी बोर्ड 2 सेमी पर एनसी झिल्ली चिपकाएं।
  2. एक परीक्षण लाइन (1 मिमी चौड़ी) के रूप में एनसी झिल्ली (ऊपरी किनारे से 2 सेमी) में एसएसडी-बीएसए (2 मिलीग्राम/एमएल) ड्रॉपवाइज जोड़ें, और एक नियंत्रण रेखा (1 मिमी चौड़ी) के रूप में एनसी झिल्ली (2 सेमी के अलावा निचले किनारे) पर बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1.5 मिलीग्राम/एमएल) ड्रॉपवाइज जोड़ें। प्रोटीन की मात्रा को नियंत्रित करें।
  3. नेकां झिल्ली के ऊपर पीवीसी शीट के लिए शोषक पैड संलग्न करें और 2 मिमी द्वारा नेकां झिल्ली के साथ ओवरलैप करें।
  4. ग्लास फाइबर झिल्ली को AuNPs-mAb संजूगेट समाधान में जलमग्न करें। एक इनक्यूबेटर में गीली झिल्ली को 37 डिग्री सेल्सियस पर सुखा लें।
  5. कांच फाइबर झिल्ली को 5 सेमी लंबा और 2 सेमी चौड़ा करने के लिए ट्रिम करें और इसे एक संजूगेट पैड के रूप में उपयोग करें।
  6. नेकां झिल्ली के नीचे पूर्वस्पित संजूगेट पैड चिपकादें। नेकां झिल्ली के साथ ओवरलैप की लंबाई 0.1 सेमी होनी चाहिए।
    नोट: ग्लास फाइबर झिल्ली में प्रोटीन को बांधने और छोड़ने की प्रबल क्षमता होती है।
  7. फ्यूजन 3 झिल्ली को 1.8 सेमी लंबा और 3.5 सेमी चौड़ा ट्रिम करें और इसे नमूना पैड के रूप में उपयोग करें।
  8. पीवीसी बोर्ड पर नमूना पैड पेस्ट करें और इसे 2 मिमी तक संजूगेट पैड के साथ ओवरलैप करें।
  9. एक कटिंग मशीन का उपयोग करके इकट्ठे हुए पेपर बोर्ड को 3.5-मिमी-चौड़ी स्ट्रिप्स में काटें और बैच लेमिनेशन सिस्टम का उपयोग करके इसे कॉम्पैक्ट करें।
  10. अंत में, परीक्षण स्ट्रिप्स को खोल में रखें, उन्हें एक एल्यूमीनियम फॉइल बैग में सील करें जिसमें डेसिकेंट होता है, और उन्हें प्रकाश से दूर स्टोर करें। आईसीएसएस अब इकट्ठे हो गए हैं ।
    नोट: उपरोक्त प्रयोगशाला प्रक्रिया है। उत्पादन में सोने के छिड़काव उपकरण और क्रॉस-झिल्ली उपकरणों का उपयोग सोने का छिड़काव करने और टी और सी लाइनबनाने के लिए किया जाता है।

4. मात्रात्मक पहचान

  1. क्रोमेटोग्राफी प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए नमूना छेद पर नमूना समाधान के 50 माइक्रोन ड्रॉप करें।
    नोट: शोषक पैड द्वारा संचालित केशिका कार्रवाई के परिणामस्वरूप, नमूना समाधान पट्टी के दूसरे छोर पर स्थानांतरित हो जाता है। जब नमूना समाधान संजूगेट पैड तक पहुंचता है, तो नमूने में एसएसडी (एंटीजन) पैड पर पूर्वलोडेड AuNPs-mAb के साथ प्रतिक्रिया करता है। जब समाधान माइग्रेट हो जाता है और टी-लाइन तक पहुंचता है, तो एसएसडी के बिना AuNPs-mAb को चुनिंदा एसएसडी-बीएसए (एंटीजन-कैरियर प्रोटीन संजूगेट) द्वारा कैप्चर किया जा सकता है, जो टी-लाइन पर लाल रंग के रूप में दिखाता है। फिर, समाधान सी लाइन में स्थानांतरित हो जाता है, जहां इस क्षेत्र में बकरी विरोधी माउस आईजीजी द्वारा औनिप्स-एमबी को पकड़ लिया जाता है, इस प्रकार सी लाइन पर लाल रंग के रूप में दिखाई देता है।
  2. एक पोर्टेबल स्ट्रिप रीडर के साथ स्ट्रिप्स का विश्लेषण करें। मशीन कंट्रोल लाइन (टी/सी) को टेस्ट लाइन का अनुपात प्रदान कर सकती है ।
  3. आईसीएस परीक्षण की विशिष्टता, संवेदनशीलता, पुनरावृत्ति और स्थिरता का मूल्यांकन करें।
    नोट: गुणात्मक पता लगाने के तहत, एक लाल रेखा एक सकारात्मक परिणाम (नियंत्रण रेखा) इंगित करती है। दो लाल रेखाएं नकारात्मक परिणाम (परीक्षण और नियंत्रण रेखाएं) का संकेत देती हैं। यदि कंट्रोल लाइन मौजूद नहीं है तो परीक्षा को अमान्य माना जाता है।

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Representative Results

कोलाइडियल गोल्ड का लक्षण वर्णन
तैयार कोलॉयडल गोल्ड सॉल्यूशंस क्लैरेट रेड थे। TEM विश्लेषण का उपयोग AuNPs(चित्रा 2A-D)के आकृति विज्ञान और आकार का निर्धारण करने के लिए किया गया था। चित्रा 2A और चित्रा 2B से पता चलता है कि कणों के आकार में पॉलीहेड्रल और समान रूप से वितरित कर रहे हैं । AuNPs का औसत व्यास लगभग 14 एनएम(चित्रा 2C) पायागया । AuNPs की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन TEM (HRTEM) छवि चित्रा 2D और चित्रा 2Eमें दिखाया गया है । एक व्यक्ति AuNP से ली गई एचआरटेम छवि 0.117 एनएम की रिक्ति के साथ एक निरंतर फ्रिंज पैटर्न दिखाती है। पांच गोल्ड कोलॉयडल सॉल्यूशंस की यूवी-विस अवशोषण चोटियां 518 एनएम, 521 एनएम, 524 एनएम, 534 एनएम और 540 एनएम थीं, जिससे पता चला कि सोडियम साइट्रेट(चित्रा 2F)कम होने के साथ कण का आकार थोड़ा बढ़ गया।

Figure 2
कोलॉयडल गोल्ड का चित्रा 2 लक्षण वर्णन। (A)AuNPs की TEM छवि (१००,०००× आवर्धन) । (ख)AuNPs की TEM छवि (500,000× आवर्धन)। (ग)औनिपों का आकार वितरण । जैसा कि TEM छवि में देखा गया है, AuNPs का व्यास 10 एनएम से लेकर 18 एनएम तक था, जिसमें लगभग 14 एनएम का औसत व्यास था। (D, ई) उच्च संकल्प TEM (HRTEM) AuNPs की छवि । एक व्यक्ति AuNP से ली गई एचआरटेम छवि 0.117 एनएम की रिक्ति के साथ एक निरंतर फ्रिंज पैटर्न दिखाती है। (एफ)10 एनएम से लेकर 18 एनएम तक के विभिन्न औने-प्स के अवशोषण स्पेक्ट्रा की यूवी-विस स्पेक्ट्रा। इस आंकड़े को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है . , २०१८21। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिपस्टिक्स का मूल्यांकन
आईसीएस की संवेदनशीलता
आईसीएस की संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए, इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स का उपयोग एसएसडी (150,000, 60,000, 12,000, 2400, 480, और 96 एनजी/एमएल) मानक नमूनों(चित्रा 3 ए)की विभिन्न सांद्रता का पता लगाने के लिए किया गया था। डबल-डिस्टिल्ड पानी को कंट्रोल के रूप में इस्तेमाल किया गया । मात्रात्मक प्रयोग में, स्ट्रिप्स को एक JY1502GS पोर्टेबल आईसीएस रीडर(चित्रा 3B-C)द्वारा स्कैन किया गया था। रैखिक प्रतिगमन समीकरण y = −0.113ln (x) + 1.5451 था, जिसमें 0.983(चित्रा 3 डी)के सहसंबंध गुणांक (R2) था। इसमें 96 एनजी/एमएल से 150 μg/mL तक अच्छी रैखिकता प्रदर्शित की गई। IC50 मूल्य 10.39 μg/mL था। मात्रात्मक प्रयोग में इष्टतम परीक्षण का समय 10 मिनट रहने का सुझाव दिया गया था ।

Figure 3
एसएसडी के लिए पार्श्व-प्रवाह इम्यूनोसे का चित्र 3 लक्षण वर्णन। (A)एसएसडी की विभिन्न सांद्रता वाले मानक समाधानों के लिए परिणामों की तस्वीरें आईसीएस का उपयोग करके परख ली गईं । (ख)मिलान कोलॉयडल गोल्ड स्कैन की तस्वीर ।(ग)कोलॉयडल गोल्ड क्वांटिटेटिव इंस्ट्रूमेंट द्वारा स्कैन की गई टेस्ट और कंट्रोल लाइन्स की तीव्रता पैटर्न । (घ)आईसीएस का उपयोग कर एसएसडी निर्धारण के लिए icELISA के मानक वक्र । प्रतिगमन समीकरण y =−0.113ln (x) + 1.5451 है, जिसमें सहसंबंध गुणांक (आर2)0.983 है। इस आंकड़े को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है . , २०१८21। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आईसीएस की विशिष्टता
एसएसडी-समान यौगिकों के साथ क्रॉस-रिएक्टिविटी का मूल्यांकन करके आईसीएस की विशिष्टता का परीक्षण किया गया था। तालिका 1 एसएसडी से संबंधित यौगिकों के साथ आईसीएस की क्रॉस-रिएक्टिविटी को दर्शाता है। यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि आईसीएस में केवल एसएसए के साथ कम क्रॉस-रिएक्टिविटी थी और एसएससी, एसएसबी1 या एसएसबी2 (टेबल 1)सहित अन्य यौगिकों के साथ कोई क्रॉस-रिएक्शन नहीं था, यह दर्शाता है कि तैयार आईसीएस में उच्च विशिष्टता है ।

नमूने एक आईसीएस bicelISA
(%) (%)
एसएसडी 100 100
एसएसए 4.30% 4.97%
एसएसबी1 <0.09 <0.09
एसएसबी2 <0.09 <0.09
एसएससी <0.09 <0.09

तालिका 1. आईसीएस और आईसीईएलसा द्वारा मापा गया यौगिकों की क्रॉस-रिएक्टिविटी।  आईसीएस की विशिष्टता का मूल्यांकन आईसीएस(ए)और आईसेलिसा(बी)द्वारा किया गया था। इस तालिका को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है ।

वसूली दर
जैसा कि तालिका 2में दिखाया गया है, औसत वसूली दर 102.05% थी (इसका मतलब एसडी, एन = 3 ±) था। इसकी सटीकता और स्थिरता के आधार पर, यह परख जैविक नमूनों में एसएसडी के निर्धारण के लिए पर्याप्त रूप से विश्वसनीय थी।

एसएसडी एकाग्रता परीक्षण प्रणाली द्वारा स्थापित एसएसडी एकाग्रता (एनजी/एमएल) रिकवरी (%)
(एनजी/एमएल)
100 135.72 ± 61.97 135.72 ± 61.97
1000 926.59 ± 114.24 92.66 ± 11.42
10000 11128.16 ± 745.75 111.28 ± 14.12

तालिका 2. एसएसडी की वसूली दर।   डेटा एसएसडी के प्रत्येक नुकीला एकाग्रता पर ट्रिपलिकेट नमूनों से एसडी ± मतलब है । वसूली का प्रतिशत इस प्रकार गणना की गई: वसूली (%) = मापी गई राशि/राशि × १००% । इस तालिका को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है ।

आईसीएस परख की स्थिरता विश्लेषण
आईसीएस की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, 8 और 16 सप्ताह के लिए संग्रहीत परीक्षण स्ट्रिप्स का परीक्षण किया गया और नए तैयार स्ट्रिप्स के साथ तुलना की गई। तालिका 3 से पता चलता है कि नकारात्मक और सकारात्मक नमूनों के लिए संग्रहीत और नए तैयार स्ट्रिप्स के परिणाम अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित थे, यह दर्शाता है कि आईसीएस को कम से कम कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और यह बड़े पैमाने पर पदोन्नति और आवेदन के लिए उपयुक्त है।

आरएसडी %
एसएसडी (एनजी/एमएल) 1 दिनएक 4 सप्ताहख 8 सप्ताहसी
125 2.41 3.11 3.51
250 2.52 4 3.52
500 2.44 3 5.2
1000 3.12 2.71 4.5

तालिका 3. एसएसडी के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले आईसीएस के बीच भिन्नताएं।   एकमान निर्माण के 1 दिन बाद उपयोग किए जाने वाले 3 विभिन्न स्ट्रिप्स पर त्रिपालेट नमूनों के लिए विचरण के गुणांक का संकेत देते हैं। ख मान 4 सप्ताह के लिए संग्रहीत होने के बाद उपयोग किए जाने वाले 3 विभिन्न स्ट्रिप्स पर त्रिपालेट नमूनों के लिए विचरण के गुणांक का संकेत देते हैं। ग मान 8 सप्ताह के लिए संग्रहीत होने के बाद उपयोग किए जाने वाले 3 विभिन्न स्ट्रिप्स पर त्रिपालेट नमूनों के लिए विचरण के गुणांक का संकेत देते हैं। इस तालिका को झांग एट अलसे संशोधित किया गया है ।

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Discussion

इस काम में, हम प्राकृतिक उत्पाद-व्युत्पन्न छोटे अणुओं के खिलाफ एमएबी की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। आवश्यक कदम और प्रक्रिया में ध्यान देने की जरूरत मामलों को रेखांकित किया गया है, और हम एक उदाहरण के रूप में छोटे अणु एसएसडी का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है । उदाहरण स्पेक्ट्रा, TEM छवियां, मात्रात्मक परिणाम और पद्धतित्मक जांच प्रतिनिधि डेटा में दिखाए जाते हैं। इसलिए, हमने दिखा दिया है कि कोलॉयडल गोल्ड प्रोडक्शन, AuNP-mAb conjugation और स्ट्रिप असेंबली रणनीति यहां प्रस्तुत एक उपन्यास इम्यूनोसे के निर्माण में परिणाम है जिसका उपयोग लक्ष्य अणु का तेजी से पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स को संचालित करना आसान है, और प्रतिक्रिया बहुत तेजी से है। केवल 50 μL नमूने की जरूरत है, और पता लगाने 5 मिनट के भीतर पूरा हो गया है। इसके विपरीत, एलिसा विधि, जो एक इम्यूनोसे भी है, को कई घंटों की आवश्यकता होती है, जिसमें कई वॉश और लंबे ऊष्मायन शामिल हैं। सिग्नल-टू-शोर अनुपात और सिग्नल मूल्य में वृद्धि करके संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए कई वॉश और लंबी इनक्यूबेशन अवधि प्रभावी रूप से नमूना मैट्रिक्स की गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया को हटा सकती है। इसका मतलब यह है कि इस अध्ययन में टोमोग्राफिक पेपर की हस्तक्षेप विरोधी क्षमता और अनुकूलन तकनीक प्रमुख समस्याएं हैं। तकनीकी अनुकूलन कई तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। नमूना पैड और संजूगेट पैड के लिए उपयुक्त सामग्री का चयन करें। नमूना पैड की लंबाई को प्रभावी ढंग से नमूने की पूर्व उपचार क्षमता में सुधार करने के लिए उचित रूप से बढ़ाया गया था। उच्च पीएच, उच्च आयनिक शक्ति और सामग्री पूर्व उपचार की उच्च बफरिंग क्षमता का उपयोग जैविक नमूने के पीएच मूल्य के एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया जैसे कारकों को प्रभावित करने से बचने के लिए किया जा सकता है। चूंकि "तीन उच्च" की सशर्त सेटिंग एंटीबॉडी के बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप कर सकती है, इसलिए इसे व्यापक रूप से माना जाना चाहिए।

इसके अलावा, यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) पट्टी पर जांच है। इसलिए, यह प्रक्रिया एमएबी की संवेदनशीलता से जुड़ी हुई है। हमने जो एमएबी लागू किया था , वह हमारे पिछले कार्य17में तैयार किया गया था और हमारे पिछले प्रकाशन19में एमएबी उत्पादन का उल्लेख किया जा सकता है ।

कोलॉयडल गोल्ड-आधारित इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि वे सस्ती होती हैं और सुविधाजनक पहचान प्रदान करती हैं। हालांकि, इस विधि की अपनी सीमाएं और स्थिरता के मुद्दे हैं। AuNPs की सिग्नल ताकत फ्लोरोसेंट रंगों, कोलाइडियल कार्बन और अन्य मार्कर की तुलना में कम है, जिसका अर्थ है कि संवेदनशीलता सीमित है। जब हवा के संपर्क में, AuNPs शराब लाल से बैंगनी करने के लिए बदल जाते हैं, जो ग्रे मूल्य में परिवर्तन का कारण होगा और मात्रात्मक पता लगाने को प्रभावित करते हैं । इसलिए, विभिन्न संशोधित इम्यूनोक्रोमेटोग्राफिक स्ट्रिप्स उभरे हैं, और हमने क्वांटम डॉट-लेबल फ्लोरोसेंट स्ट्रिप्स22 और आईजीवाई-आधारित इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप्स23भी तैयार किए हैं, जिनके उत्पादन के लिए समान प्रक्रियाएं हैं।

झिल्ली आधारित इम्यूनोसैसे का व्यापक रूप से नैदानिक संकेतकों, संक्रामक रोगों, कीटनाशक अवशेषों और दवा एकाग्रता निगरानी में उपयोग किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने छोटे अणु प्राकृतिक उत्पादों के लिए एक AuNP-आधारित विधि तैयार करने पर ध्यान केंद्रित किया। यह प्रक्रिया विभिन्न लक्ष्य इम्यूनोसैसे के विकास के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करती है जिसे प्राकृतिक उत्पादों के मूल्यांकन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में प्रभावी रूप से उपयोग किया जा सकता है।

यह काम छोटे अणुओं के तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने में उपयोग के लिए प्रतिरक्षा क्रोमेटोग्राफिक स्ट्रिप्स के आधार पर पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे के विकास के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में कोलॉयडल गोल्ड की तैयारी, AuNP-mAb conjugates के संश्लेषण, पट्टी की विधानसभा, और पद्धति जांच शामिल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को केंद्रीय विभागों से संबद्ध उच्च शिक्षा संस्थानों के मौलिक अनुसंधान कोषों के लिए विशेष कोष द्वारा समर्थित किया गया था । हम चीनी चिकित्सा के बीजिंग विश्वविद्यालय के शास्त्रीय पर्चे बुनियादी अनुसंधान टीम के समर्थन की सराहना करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroauric acid solution (HAuCl4) Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory JY-SJ102
bovine serum albumin AMRESCO 332
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
Filter paper Sinopharm H5072
Glass fibre membranes Jieyi XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
Nitrocellulose membranes Millipore millipore 180
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG20000 Sigma Aldrich RNBC6325
Pipette 10mL COSTAR 4488
Pipette 25mL FALCON 357525
semi-rigid PVC sheets Jieyi JY-C104
Sodium citrate Beijing Chemical Works C1034
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Tris-HCl Solarbio 77-86-1
TWEEN 20 Solarbio 9005-64-5

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 177 पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे कोलाइडियल गोल्ड मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कृत्रिम एंटीजन छोटे आणविक यौगिक पट्टी
छोटे अणु यौगिकों के त्वरित और मात्रात्मक पता लगाने के लिए पार्श्व प्रवाह इम्यूनोक्रोमेग्राफिक स्ट्रिप का विकास
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Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Cheng, J., Qu, H. Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds. J. Vis. Exp. (177), e62754, doi:10.3791/62754 (2021).

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