Abstract
רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לאבחון עצמי בעלות נמוכה ויושמו ביעילות על רעלן, אינדקס פיזיולוגי וזיהוי סמנים ביולוגיים קליניים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים לפיתוח אימונואסי מהיר, רגיש וכמותי לרוחב (באמצעות AuNPs כסמן ו- mAbs כגשוש). ההליך מתאר את ההכנה והאפיון של זהב קולואידי, סינתזה של מצומד AuNP-mAb, הרכבה של הרצועה החיסונית, וחקירה מתודולוגית של ההסתה. התוצאות הראו כי ניתן להשתמש ברצועות הסופיות עוד יותר לאבחון עצמי מהיר ונוח של מולקולה קטנה, אשר עשויה לספק כלי חלופי בניתוח מהיר ומדויק של מדדים פיזיולוגיים וביולוגיים.
Introduction
רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לזיהוי בעלות נמוכה ומהירה. קרום הניטרוצלולוז כנשא וזהב קולואידי כסמנים של ריאגנטים אבחון מהיר כרומטוגרפיה חיסונית הם שיטת POCT (נקודת הטיפול) הנפוצה ביותר, ואת היקף הבדיקה של הפרויקט הוא רחב יותר. מהיישום המקורי שלהם בניטור במהלך ההריון, השימוש בהם הוארך כדי לפקח על מצב קרישת הדם1,2, פגיעה בשריר הלב3,תרופה וטרינרית 4, שאריות חומרי הדברה5, מחלות זיהומיות6 וריכוזים סמים. ניתן להעריך סוגים נוספים של דגימות, כולל שתן, רוק, דם שלם, סרום ונוזלים אחרים בגוף7,8,9.
בשנים האחרונות פותחו בדיקות חדשניות רבות לאיתור סמנים ביולוגיים באבחון הפרעות, כולל HPLC, UPLC, LC-MS ו- ELISA, שהם רגישים ומדויקים, אמינים וספציפיים. עם זאת, שיטות אלה דורשות מכשור מתוחכם, עיבוד מקדים מורכב וטיפולים גוזלי זמן9. לפיכך, פיתוח אסטרטגיית אבחון מהירה ונוחה יותר של נקודת טיפול לגילוי עצמי ובזמן אמת של תרכובות פעילות מרפא הוא דחוף10,11.
הפופולריות של ICSs, במיוחד עבור בדיקות נפוצות, מונעת על ידי קלות השימוש שלהם, כפי שהם אינם דורשים אנשי מקצוע או הגדרות אינסטרומנטליות משוכללות12. במילים אחרות, אנשים שאין להם הכשרה מיוחדת יכולים להפעיל רצועות או בדיקות עצמיות13. את תוצאות הבדיקה ניתן להשיג בתוך 5 דקות, מה שאומר שזה יכול לשמש לבדיקות באתר14. יתר על כן, על פי החישובים שלנו, העלות של רצועות יכול להיות נמוך יותר מ 1 RMB15, כלומר הבדיקות זולות כדי לקדם16. לפיכך, ICS הוא מכשיר חד פעמי מדויק יחסית, פשוט וזול. ICSs המבוסס על זהב קולואידי17,18 מיושמים גם בגילוי מהיר COVID-19.
העיקרון של ICS ניתן לחלק כריך ICS ו- ICS תחרותי. איור 1A הוא תרשים סכמטי של כריך ICS, המשמש בעיקר לאיתור חומרים מקרומולקולריים כגון חלבונים, כולל סמני גידול, גורמים דלקתיים וגונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG, אנטיגן הריון מוקדם). בשיטה זו, נוגדנים מזווגים המיועדים לאפיטופים שונים של האנטיגן משמשים, ונוגדן הלכידה מיובש על קרום NC כקו בדיקה. נוגדן שכותרתו מיובש על כרית מצומד, ונוגדן משני משמש כקו הביקורת.
איור 1B הוא תרשים סכמטי של ICS תחרותי, המשמש בעיקר לזיהוי חומרים של מולקולות קטנות (MWCO < 2000 Da). אנטיגן הציפוי קבוע על קרום NC כקו בדיקה, ואת הנוגדן המסומן מיובש על כרית מצומד. במהלך הזיהוי, המדגם והתווג הנוגדנים זורמים דרך קו הזיהוי תחת פעולה נימית, והאנטיגן המצולף קושר באופן תחרותי אנטיגן חינם במדגם ומפתח צבע אדום בקו הזיהוי.
לאחרונה, תיארנו את ההליך של ייצור נוגדנים חד שבטיים נגד מוצרים טבעיים19. בעבודה זו, פיתחנו אימונואזיה זרימה לרוחב רומן המבוסס על mA20 מוכן נגד SSD לגילוי מהיר באתר. התוצאות מצביעות על כך שבדיקת החיסונים היא כלי חיוני ונוח לאיתור תרכובות טבעיות המופקות ממוצר.
איור 1 תרשים סכמטי של בדיקת החיסונים (A)רצועות בדיקה אימונוכרומטיות של כריך. (B)רצועות בדיקה כרומטוגרפיות חיסון עקיפות. נתון זה שונה מ ג'אנג ואח', 201821. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לבדיקת אתיקה באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (מספר אישור 2017BZYYL00120).
1. הכנה ואפיון של זהב קולואידי
הערה: עבור סינתזת זהב קולואידי, כמו זהב קולואידי הוא נספג בקלות על הקיר הפנימי של הכלי והוא נוטה משקעים על ידי זיהומים, הכלי עבור סינתזה ואחסון של זהב קולואידי צריך להיות ניקה ביסודיות ספוג בחומצה (40 מ"ל של מים מזוקקים, 360 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת, 20 גרם של אשלגן dichromate) או נתון לטיפול פסיבציה פני השטח. שיטה להפחתת חומצת לימון שימשה לסנתז זהב קולואידי.
- מפעילים את המערבב המגנטי ומניחים את הבקבוק (250 מ"ל) על המיקסר.
- הכן 4% תמיסה חומצת כלוריד זהב ו 1% פתרון נתרן סיטראט, בהתאמה.
- מוסיפים 120 מ"ל של מים מזוקקים לבקבוקון התחתון העגול ומחממים אותו לרתיחה על מערבב מגנטי תרמוסטטי.
- שמור רותח, ולהוסיף במהירות 0.5 מ"ל של 4% חומצה כלורוארית ו 5 מ"ל של 1% נתרן ציטוטראט.
- שים לב לצבע הפתרון. תמיסה חומצה כלורוארית צהובה חיוורת הופכת יין אדום בתוך כמה דקות.
- ממשיכים לחמם במשך 10 דקות, עד שהפתרון משתנה מיין חסר צבע לאדום שקוף.
- כבה את העוצמה של המיקסר המגנטי התרמוסטטי, מצננים לטמפרטורת החדר ומעבירים את התערובת לבקבוק נקי. לאחסן אותו ב 4 °C (5 °F).
- קבע את הגודל והמורפולוגיה של AuNPs על ידי ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה והדמיה TEM.
הערה: בגדלים שונים של חלקיקי זהב קולואיד עבור יישומים שונים ניתן להשיג על ידי שינוי שיעור נתרן ציטוט וחומצה כלורוארית.
2. סינתזה של התזת AuNPs-mAb
הערה: מאז נוגדנים להיקשר זהב קולואידי על ידי ספיחה אלקטרוסטטית, חיובים על פני השטח של חלבונים וזהב קולואידי משפיעים ישירות על עוצמת הכריכה; לכן, ערך ה- pH של המאגר הוא גורם חשוב המשפיע על יציבות ההצתה של הנוגדנים-קולואידיים של זהב. SSD ו- mAbs נגד SSD משמשים כדוגמאות בפרוטוקול זה.
- הערכה של צימוד pH
- הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לתוך שמונה צינורות.
- התאם את פתרונות AuNP ב- pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ו- 12 עם 0.1 M K2CO3.
- הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי (pH מותאם 5-12) לשמונה צינורות המכילים NaCl.
- אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.
- בחר את ערך ה- pH עם התוספת הנמוכה ביותר של K2CO3 וצבע פתרון יציב כערך pH האופטימלי להכנת מצומדי AuNP-mAb.
הערה: אין להשתמש במד pH מכיוון שהגשוש עשוי להיהרס על-ידי AuNPs.
- הערכת כמות הנוגדנים
- הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לשמונה צינורות.
- הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי עם pH אופטימלי לכל צינור.
- הוסיפו את פתרונות הנוגדנים המונוקלונליים (ריכוז חלבונים 0.1 מ"ג/מ"ל-3.2 מ"ג/מ"ל) לשמונה הצינורות הנ"ל.
- אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.
- בחר את כמות הנוגדנים עם הריכוז הנמוך ביותר של mAb וצבע פתרון יציב כמו כמות mAb אופטימלי להכנת מצומדים AuNP-mAb.
- הכן את מאגר ההשתתפות מחדש: הוסף 1 M Tris-HCl (pH 8.8), 1% (w/v) BSA, 0.5% (v/v) Tween 20 ו- 1% (v/v) PEG 20000 ומיזוג היטב.
- סינתזה של התקהלות AuNP-mAb
- קח 10 מ"ל של פתרון זהב קולואידי והשתמש ב- 0.1 M K2CO 3 כדילהתאים את הפתרון לערך ה- pH האופטימלי.
- יש להוסיף לאט את ה-SSD mAbs בריכוזים המתאימים ולנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- צנטריפוגות התערובת ב 83 x גרם (1,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את המשקעים, אשר מכיל זיהומים או זהב קולואידי מזורם.
- צנטריפוגות התערובת ב 8,330 x גרם (10,000 סל"ד) במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F). השלך את supernatant, ואת המשקעים הוא קולואידי זהב-mAb ההמולה.
- הוסף את מאגר ההפצה מחדש כדי לנתק את המשקעים.
3. כינוס הרצועה
הערה: עבור חיסוני זרימה מאוחרים יותר, הבחירה והטיפל הממברנה ישפיעו ישירות על הבדיקה, אשר יש לחקור. הרצועה החיסונית מורכבת משטח דגימה, כרית מצומדת, קרום ניטרוצלולוז (NC), כרית סופגת ולוח PVC(איור 1). חומר הממברנה צריך להיבדק ולהעריך על ידי סטריאומיקרוסקופיה כדי לחסל את האינומוגניות.
- הדבק את קרום NC על לוח PVC 2 ס"מ מלבד קצה קצה היניקה של הלוח.
- הוסף SSD-BSA (2 מ"ג / מ"ל) טיפה לקרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה העליון) כקו בדיקה (1 מ"מ רוחב), ולהוסיף עז נגד עכבר IgG (1.5 מ"ג / מ"ל) טיפה על קרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה התחתון) כקו בקרה (1 מ"מ רוחב). לשלוט בכמות החלבון שנוסף.
- חבר את כרית הספיגה לגיליון PVC מעל קרום NC וחפוף אותו עם קרום NC על ידי 2 מ"מ.
- שקועים בקרום סיבי הזכוכית לתוך פתרון מצומד AuNPs-mAb. יבש את הממברנה הרטובה באינקובטור ב 37 °C (50 °F).
- חותכים את קרום סיבי הזכוכית לאורך 5 ס"מ ורוחב 2 ס"מ ומשתמשים בו כרפידה מצומדת.
- הדבק את כרית מצומד מטופל מראש מתחת לקרום NC. אורך החפיפה עם קרום NC צריך להיות 0.1 ס"מ.
הערה: קרום סיבי הזכוכית יש יכולת חזקה לקשור ולשחרר חלבונים. - חותכים את ההיתוך 3 ממברנה ל 1.8 ס"מ ארוך 3.5 ס"מ רוחב ולהשתמש בו כמו כרית מדגם.
- הדבק את משטח המדגם על לוח PVC וחפיפת אותו עם כרית מצומד על ידי 2 מ"מ.
- חותכים את לוח הנייר המורכב לרצועות ברוחב 3.5 מ"מ באמצעות מכונת חיתוך וקומפצים אותו באמצעות מערכת למינציה אצווה.
- לבסוף, מניחים את רצועות הבדיקה לתוך הקליפה, אוטמים אותן בשקית רדיד אלומיניום המכילה חיטוי, ומאחסנים אותן הרחק מהאור. ICSs מורכבים כעת.
הערה: האמור לעיל הוא הליך המעבדה. בייצור, ציוד ריסוס זהב ומכשירים ממברנה צולבת משמשים לרסס זהב ולעשות את קווי T ו- C.
4. זיהוי כמותי
- זרוק 50 μL של פתרון מדגם על חור המדגם כדי לצפות בתהליך הכרומטוגרפיה.
הערה: כתוצאה מהפעולה הנימית המונעת על ידי כרית הספיגה, הפתרון לדוגמה עובר לקצה השני של הרצועה. כאשר פתרון המדגם מגיע למשטח מצומד, ה- SSD (אנטיגן) במדגם מגיב כאשר AuNPs-mAb נטען מראש על הפנקס. כאשר הפתרון נודד ומגיע לקו ה- T, ניתן ללכוד את AuNPs-mAb ללא SSD באופן סלקטיבי על-ידי SSD-BSA (מצומד חלבון נושא אנטיגן), המוצג כצבע אדום בקו T. לאחר מכן, הפתרון עובר לקו C, שבו AuNPs-mAb נלכדים על ידי עז אנטי עכבר IgG באזור, ובכך מוצג כצבע אדום על קו C. - נתח את הרצועות באמצעות קורא רצועות נייד. המכונה יכולה לספק את היחס בין קו הבדיקה לקו הבקרה (T/C).
- להעריך את הספציפיות, הרגישות, החזרה והיציבות של מבחן ICS.
הערה: תחת זיהוי איכותי, קו אדום אחד מציין תוצאה חיובית (קו בקרה). שני קווים אדומים מציינים תוצאה שלילית (קווי בדיקה ובקרה). אם שורת הביקורת אינה קיימת, הבדיקה נחשבת ללא חוקית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיון של זהב קולואידי
פתרונות הזהב הקולואידיים המוכנים היו אדומים קלארט. ניתוחי TEM שימשו לקביעת המורפולוגיה והצורה של AuNPs(איור 2A-D). איור 2A ואיור 2B חושפים שהחלקיקים הם בעלי צורה פוליהדרלית ומופצים באופן אחיד. הקוטר הממוצע של AuNPs נמצא כ 14 ננומטר(איור 2C). תמונת TEM ברזולוציה גבוהה (HRTEM) של AuNPs מוצגת באיור 2D ובאיור 2E. תמונת HRTEM שנלקחה מ- AuNP בודד מציגה תבנית שוליים רציפה עם מרווח של 0.117 ננומטר. פסגות ספיגת UV-vis של חמשת פתרונות קולואידי זהב היו 518 ננומטר, 521 ננומטר, 524 ננומטר, 534 ננומטר ו 540 ננומטר, אשר הראו כי גודל החלקיקים גדל מעט עם ירידה נתרן סיטראט (איור 2F).
איור 2 אפיון של זהב קולואידי. (A) תמונת TEM של AuNPs (הגדלה של 100,000×). (B)תמונת TEM של AuNPs (הגדלה × 500,000). (C)התפלגות הגודל של AuNPs. כפי שניתן לראות בתמונת TEM, הקטרים של AuNPs נעו בין 10 ננומטר ל 18 ננומטר, עם קוטר ממוצע של כ 14 ננומטר. (D, E) תמונת TEM ברזולוציה גבוהה (HRTEM) של AuNPs. תמונת HRTEM שנלקחה מ- AuNP בודד מציגה תבנית שוליים רציפה עם מרווח של 0.117 ננומטר. (F)ספקטרום ספיגת UV-vis של AuNPs שונים הנעים בין 10 ננומטר ל 18 ננומטר. נתון זה שונה מ ג'אנג ואח', 201821. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הערכת הדיפסטיקים
רגישות ICS
כדי לקבוע את הרגישות של ICS, רצועות אימונוכרומטוגרפיות שימשו לזיהוי מגוון של ריכוזים שונים של SSD (150,000, 60,000, 12,000, 2400, 480 ו 96 ng / mL) דגימות סטנדרטיות (איור 3A). מים מזוקקים כפולים שימשו כשליטה. בניסוי הכמותי, הרצועות נסרקו על ידי קורא ICS נייד JY1502GS(איור 3B-C). משוואת הרגרסיה הליניארית הייתה y = −0.113ln(x) + 1.5451, עם מקדם מתאם (R2) של 0.983 (איור 3D). הוא הציג ליניאריות טובה ב 96 ng / mL כדי 150 מיקרוגרם / מ"ל. ערך IC50 היה 10.39 מיקרוגרם/מ"ל. בניסוי הכמותי, זמן הבדיקה האופטימלי הוצע להיות 10 דקות.
איור 3 אפיון של אימונואסי זרימה לרוחב עבור SSD. (A)תצלומים של תוצאות עבור פתרונות סטנדרטיים המכילים ריכוזים שונים של SSD שנמדדו באמצעות ICS. (ב)צילום של סריקת הזהב הקולואידית התואמת (C) דפוסי העוצמה של קווי הבדיקה והבקרה שנסרקו על ידי המכשיר הכמותי של זהב קולואידי. (D)עקומת icELISA סטנדרטית לקביעת SSD באמצעות ICS. משוואת הרגרסיה היא y = −0.113ln(x) + 1.5451, עם מקדם מתאם (R2) של 0.983. נתון זה שונה מ ג'אנג ואח', 201821. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הספציפיות של ICS
הספציפיות של ICS נבדקה על ידי הערכת התגובה הצולבת עם תרכובות דומות ל- SSD. טבלה 1 מציגה את התגובה הצולבת של ICS עם תרכובות הקשורות ל- SSD. ניתן לראות בבירור כי ל- ICS הייתה תגובתיות צולבת נמוכה בלבד עם SSa ולא הייתה לו תגובה צולבת עם תרכובות אחרות, כולל SSc, SSb1 או SSb2 (טבלה 1), המציין כי ל- ICS המוכן יש ספציפיות גבוהה.
| דגימות | a ICS | bicELISA |
| (%) | (%) | |
| SSD | 100 | 100 |
| SSa | 4.30% | 4.97% |
| SSb1 | <0.09 | <0.09 |
| SSb2 | <0.09 | <0.09 |
| SSc | <0.09 | <0.09 |
טבלה 1. תגובה צולבת של תרכובות הנמדדות על-ידי ICS ו- icELISA. הספציפיות של ICS הוערכה על-ידי ICS (a) ו- icELISA (b). טבלה זו שונתה מ ג'אנג ואח', 201821.
קצב שחזור
כפי שמוצג בטבלה 2, שיעור ההתאוששות הממוצע היה 102.05% (ממוצע ± SD, n = 3). על בסיס הדיוק והעקביות שלו, בדיקת זה הייתה אמינה מספיק לקביעת SSD בדגימות ביולוגיות.
| ריכוז SSD | ריכוז SSD שנקבע על ידי מערכת הבדיקה (ng/mL) | התאוששות (%) |
| (נ"ל) | ||
| 100 | 135.72 ± 61.97 | 135.72 ± 61.97 |
| 1000 | 926.59 ± 114.24 | 92.66 ± 11.42 |
| 10000 | 11128.16 ± 745.75 | 111.28 ± 14.12 |
טבלה 2. שיעור שחזור של SSD. נתונים הם ה-SD ± הממוצע מדגימות משולשות בכל ריכוז ממוסמר של SSD. אחוז ההתאוששות חושב כדלקמן: התאוששות (%) = סכום/סכום נמדד × 100%. טבלה זו שונתה מ ג'אנג ואח', 201821.
ניתוח יציבות של הבדיקה ICS
כדי להעריך את היציבות של ICS, פסי הבדיקה המאוחסנים במשך 8 ו 16 שבועות נבדקו בהשוואה לרצועות שהוכנו לאחרונה. טבלה 3 מראה כי התוצאות של רצועות מאוחסנות שהוכנו לאחרונה עבור הדגימות השליליות והחיוביות נותרו כמעט ללא שינוי, מה שמצביע על כך שניתן לאחסן את ה- ICS בטמפרטורת החדר לפחות מספר חודשים וכי הוא מתאים לקידום ויישום בקנה מידה גדול.
| % RSD | |||
| SSD (ng/mL) | יוםאחד | 4 שבועותb | 8 שבועותc |
| 125 | 2.41 | 3.11 | 3.51 |
| 250 | 2.52 | 4 | 3.52 |
| 500 | 2.44 | 3 | 5.2 |
| 1000 | 3.12 | 2.71 | 4.5 |
טבלה 3. וריאציות בין ICS המשמשות לניתוח SSD. a הערכים מציינים מקדמי שונות עבור דגימות משולשות על 3 רצועות שונות המשמשות יום אחד לאחר הייצור. b הערכים מציינים מקדמי שונות עבור דגימות משולשות על 3 רצועות שונות המשמשות לאחר אחסון במשך 4 שבועות. ג הערכים מציינים מקדמי שונות עבור דגימות משולשות על 3 רצועות שונות המשמשות לאחר אחסון במשך 8 שבועות. טבלה זו שונתה מ ג'אנג ואח', 201821.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול להכנת mAbs נגד מולקולות קטנות טבעיות המופקות ממוצר. הצעדים החיוניים והעניינים הזקוקים לתשומת לב בהליך תוארו, והדגמנו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות המולקולה הקטנה SSD כדוגמה. ספקטרום לדוגמה, תמונות TEM, תוצאות כמותיות וחקירות מתודולוגיות מוצגים בנתונים מייצגים. לפיכך, הוכחנו כי ייצור הזהב הקולואידי, הטיות AuNP-mAb ואסטרטגיית הרכבת רצועה המוצגת כאן גורמות ליצירת אימונואזיה חדשנית שניתן להשתמש בה כדי לזהות במהירות את מולקולת היעד.
קל לתפעול רצועות אימונוכרומטיות, והתגובה מהירה מאוד. רק 50 μL של מדגם נדרש, וזיהוי הושלם בתוך 5 דקות. לעומת זאת, שיטת ELISA, שהיא גם אימונואה, דורשת מספר שעות, כולל כביסות מרובות ודגורות ארוכות. שטיפות מרובות ותקופות דגירה ארוכות יכולות להסיר ביעילות את התגובה הלא-מדעית של מטריצת המדגם כדי לשפר את יחס האות לרעש ואת הרגישות על ידי הגדלת ערך האות. משמעות הדבר היא כי היכולת נגד הפרעות וטכנולוגיית אופטימיזציה של נייר טומוגרפי הם הבעיות העיקריות שיש לפתור במחקר זה. אופטימיזציות טכנולוגיות ניתן להשיג במספר דרכים. בחר חומרים מתאימים עבור כרית הדגימה ואת כרית מצומד. אורך משטח המדגם הוגדל כראוי כדי לשפר ביעילות את יכולת הטיפול מראש של המדגם. ניתן להשתמש ב- pH גבוה, חוזק יוני גבוה ויכולת אגירה גבוהה של טיפול מקדים בחומרים כדי למנוע השפעה על גורמים כגון תגובת האנטיגן-נוגדנים של ערך ה- pH של המדגם הביולוגי. כמו ההגדרה המותנית של "שלוש גבוה" יכול להפריע כריכה של נוגדנים, זה צריך להיחשב באופן מקיף.
יתר על כן, חשוב גם לציין כי נוגדן חד שבטי (mAb) הוא בדיקה על הרצועה. לכן, הליך זה קשור לרגישות של mAb. ה- mAb שהגשנו הוכן בעבודה הקודמת שלנו17, וניתן להתייחס לייצור mAb בפרסום הקודם שלנו19.
רצועות אימונוכרומטוגרפיות מבוססות זהב קולואידיות הן רצועות בשימוש נרחב מכיוון שהן זולות ומציעות זיהוי נוח. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות משלה ובעיות יציבות. עוצמת האות של AuNPs נמוכה יותר מזו של צבעים פלואורסצנטיים, פחמן קולואידי וסמנים אחרים, כלומר הרגישות מוגבלת. כאשר הם נחשפים לאוויר, ה- AuNPs משתנים מיין אדום לסגול, מה שיגרום לשינוי בערך האפור וישפיע על הזיהוי הכמותי. לפיכך, רצועות אימונוכרומטוגרפיות שונות שהשתנו הופיעו, והכנו גם רצועות פלואורסצנטיות קוונטיות עם תוויתנקודה 22 ורצועות אימונוכרומטוגרפיות מבוססות IgY23, שיש להן הליכים דומים לייצור.
חיסונים מבוססי ממברנה היו בשימוש נרחב אינדיקטורים קליניים, מחלות זיהומיות, שאריות חומרי הדברה וניטור ריכוז סמים. בפרוטוקול זה התמקדנו בהכנת שיטה מבוססת AuNP למוצרים טבעיים של מולקולות קטנות. הליך זה משמש כתבנית לפיתוח חיסונים שונים היעד שניתן להשתמש בהם ביעילות ככלים אנליטיים להערכה ובקרת איכות של מוצרים טבעיים.
עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט לפיתוח חיסונים בזרימה לרוחב המבוססים על רצועות כרומטוגרפיות חיסוניות לשימוש בזיהוי מהיר, רגיש וכמותי של מולקולות קטנות. הליך זה כולל הכנת זהב קולואידי, סינתזה של מצומדים AuNP-mAb, הרכבה של הרצועה, וחקירה מתודולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרנות המיוחדות לקרנות מחקר יסודיות של מוסדות להשכלה גבוהה המזוהים עם מחלקות מרכזיות. אנו מעריכים את התמיכה של מרשם קלאסי צוות מחקר בסיסי של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. Guo, H., et al. , US20040184954A1 (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
