Membranbaserede sidestrøm immunkromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig selvdiagnosticering og er blevet effektivt anvendt på toksin, fysiologisk indeks og klinisk biomarkørdetektering. I denne protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af trinene til at udvikle en hurtig, følsom og kvantitativ lateral-flow immunoassay (ved hjælp af auNPs som markør og mAbs som sonde). Proceduren beskriver forberedelse og karakterisering af kolloidt guld, syntese af AuNP-mAb konjugat, samling af den immunokromatiske strimmel, og metodologisk undersøgelse af analysen. Resultaterne viste, at de sidste strimler kan udnyttes yderligere til hurtig og bekvem selvdiagnosticering af et lille molekyle, som kan give et alternativt værktøj i den hurtige og præcise analyse af fysiologiske og biologiske indekser.
Membranbaserede sidestrøm immunokromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig og hurtig detektion. Nitrocellulosemembranen som bærer og kolloidguld som markører for immunkromatografi rapid diagnostic reagenser er den mest almindeligt anvendte POCT (punkt for plejetest), og projektets testområde er bredere. Fra deres oprindelige anvendelse i overvågning under graviditeten er deres anvendelse blevet udvidet til at overvåge blodkoagulationstilstand1,2, myokardieskade3,veterinærmedicin4, pesticidrester5,smitsomme sygdomme6 og lægemiddelkoncentrationer. Flere typer prøver kan vurderes, herunder urin, spyt, fuldblod, serum og andre kropsvæsker7,8,9.
I de senere år er der udviklet talrige nye analyser til påvisning af biomarkører i diagnosticering af lidelser, herunder HPLC, UPLC, LC-MS og ELISA, som er følsomme og præcise, troværdige og specifikke. Disse metoder kræver dog sofistikeret instrumentering, kompleks forbehandling og tidskrævende behandlinger9. Derfor er det presserende10, 11at udvikle en hurtigere og bekvem point-of-care diagnostisk strategi for selv- og realtidsdetektion af medicinske aktive forbindelser.
Populariteten af ICSs, især for almindelige tests, er drevet af deres brugervenlighed, da de ikke kræver fagfolk eller udarbejde instrumentale opsætninger12. Med andre ord kan folk, der ikke har særlig træning, betjene strimler eller selvtest13. Resultaterne af testen kan opnås på 5 minutter, hvilket betyder, at den kan bruges til inspektioner på stedet14. Desuden kan omkostningerne ved strimler ifølge vores beregninger være lavere end 1 RMB15, hvilket betyder, at testene er billige til at fremme16. Derfor er ICS en relativt præcis, enkel og billig engangsenhed. ICSs baseret på kolloid guld17,18 anvendes også i hurtig COVID-19 afsløring.
Princippet om ICS kan opdeles i sandwich ICS og konkurrencedygtige ICS. Figur 1A er et skematisk diagram over sandwich ICS, som hovedsageligt bruges til at opdage makromolekyllære stoffer som proteiner, herunder tumormarkører, inflammatoriske faktorer og human chorionic gonadotropin (HCG, tidlig graviditet antigen). I denne metode anvendes parrede antistoffer rettet mod forskellige epitoper af antigen, og opsamlingsantistoffet tørres på NC-membranen som en testlinje. Mærket antistof tørres på konjugatpuden, og sekundært antistof anvendes som kontrollinje.
Figur 1B er et skematisk diagram over konkurrencedygtige ICS, som hovedsageligt bruges til at detektere små molekylestoffer (MWCO < 2000 Da). Belægningsantigen er fastgjort på NC-membranen som en testlinje, og det mærkede antistof tørres på konjugatpuden. Under påvisning strømmer prøven og mærket antistof gennem detektionslinjen under kapillær handling, og det coatede antigen binder frit antigen i prøven og udvikler en rød farve på detektionslinjen.
For nylig beskrev vi proceduren for monoklonal antistofproduktion mod naturlige produkter19. I dette arbejde udviklede vi en ny lateral flow immunoassay baseret på den forberedte anti-SSD mA20 til hurtig, on-site detektion. Resultaterne tyder på, at immunochromatografianalysen er et uundværligt og praktisk værktøj til påvisning af naturlige produktafledte forbindelser.
Figur 1 Skemat diagram over immunkromatografianalysen (A) Sandwich immunkromatiske teststrimler. (B) Indirekte konkurrencedygtige immunkromatografiske teststrimler. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al., 201821. Klik her for at se en større version af dette tal.
I dette arbejde præsenterer vi en protokol til fremstilling af mAbs mod naturlige produkt-afledte små molekyler. De væsentlige trin og de spørgsmål, der kræver opmærksomhed i proceduren, er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol ved hjælp af det lille molekyle SSD som et eksempel. Eksempelspektre, TEM-billeder, kvantitative resultater og metodiske undersøgelser er vist i repræsentative data. Derfor har vi vist, at den kolloide guldproduktion, AuNP-mAb-bøjnings- og stripassemblystrategi, der …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af de særlige fonde for grundforskningsfonde for højere læreanstalter, der er tilknyttet centrale afdelinger. Vi sætter pris på støtte fra klassisk recept grundforskning Team af Beijing University of Chinese Medicine.
Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |