Udvikling af en Lateral Flow immunokromatisk strimmel til hurtig og kvantitativ påvisning af små molekyleforbindelser

Published: November 13, 2021
doi:

Abstract

Membranbaserede sidestrøm immunkromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig selvdiagnosticering og er blevet effektivt anvendt på toksin, fysiologisk indeks og klinisk biomarkørdetektering. I denne protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af trinene til at udvikle en hurtig, følsom og kvantitativ lateral-flow immunoassay (ved hjælp af auNPs som markør og mAbs som sonde). Proceduren beskriver forberedelse og karakterisering af kolloidt guld, syntese af AuNP-mAb konjugat, samling af den immunokromatiske strimmel, og metodologisk undersøgelse af analysen. Resultaterne viste, at de sidste strimler kan udnyttes yderligere til hurtig og bekvem selvdiagnosticering af et lille molekyle, som kan give et alternativt værktøj i den hurtige og præcise analyse af fysiologiske og biologiske indekser.

Introduction

Membranbaserede sidestrøm immunokromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig og hurtig detektion. Nitrocellulosemembranen som bærer og kolloidguld som markører for immunkromatografi rapid diagnostic reagenser er den mest almindeligt anvendte POCT (punkt for plejetest), og projektets testområde er bredere. Fra deres oprindelige anvendelse i overvågning under graviditeten er deres anvendelse blevet udvidet til at overvåge blodkoagulationstilstand1,2, myokardieskade3,veterinærmedicin4, pesticidrester5,smitsomme sygdomme6 og lægemiddelkoncentrationer. Flere typer prøver kan vurderes, herunder urin, spyt, fuldblod, serum og andre kropsvæsker7,8,9.

I de senere år er der udviklet talrige nye analyser til påvisning af biomarkører i diagnosticering af lidelser, herunder HPLC, UPLC, LC-MS og ELISA, som er følsomme og præcise, troværdige og specifikke. Disse metoder kræver dog sofistikeret instrumentering, kompleks forbehandling og tidskrævende behandlinger9. Derfor er det presserende10, 11at udvikle en hurtigere og bekvem point-of-care diagnostisk strategi for selv- og realtidsdetektion af medicinske aktive forbindelser.

Populariteten af ICSs, især for almindelige tests, er drevet af deres brugervenlighed, da de ikke kræver fagfolk eller udarbejde instrumentale opsætninger12. Med andre ord kan folk, der ikke har særlig træning, betjene strimler eller selvtest13. Resultaterne af testen kan opnås på 5 minutter, hvilket betyder, at den kan bruges til inspektioner på stedet14. Desuden kan omkostningerne ved strimler ifølge vores beregninger være lavere end 1 RMB15, hvilket betyder, at testene er billige til at fremme16. Derfor er ICS en relativt præcis, enkel og billig engangsenhed. ICSs baseret på kolloid guld17,18 anvendes også i hurtig COVID-19 afsløring.

Princippet om ICS kan opdeles i sandwich ICS og konkurrencedygtige ICS. Figur 1A er et skematisk diagram over sandwich ICS, som hovedsageligt bruges til at opdage makromolekyllære stoffer som proteiner, herunder tumormarkører, inflammatoriske faktorer og human chorionic gonadotropin (HCG, tidlig graviditet antigen). I denne metode anvendes parrede antistoffer rettet mod forskellige epitoper af antigen, og opsamlingsantistoffet tørres på NC-membranen som en testlinje. Mærket antistof tørres på konjugatpuden, og sekundært antistof anvendes som kontrollinje.

Figur 1B er et skematisk diagram over konkurrencedygtige ICS, som hovedsageligt bruges til at detektere små molekylestoffer (MWCO < 2000 Da). Belægningsantigen er fastgjort på NC-membranen som en testlinje, og det mærkede antistof tørres på konjugatpuden. Under påvisning strømmer prøven og mærket antistof gennem detektionslinjen under kapillær handling, og det coatede antigen binder frit antigen i prøven og udvikler en rød farve på detektionslinjen.

For nylig beskrev vi proceduren for monoklonal antistofproduktion mod naturlige produkter19. I dette arbejde udviklede vi en ny lateral flow immunoassay baseret på den forberedte anti-SSD mA20 til hurtig, on-site detektion. Resultaterne tyder på, at immunochromatografianalysen er et uundværligt og praktisk værktøj til påvisning af naturlige produktafledte forbindelser.

Figure 1
Figur 1 Skemat diagram over immunkromatografianalysen (A) Sandwich immunkromatiske teststrimler. (B) Indirekte konkurrencedygtige immunkromatografiske teststrimler. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al., 201821. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle de procedurer, der blev udført i denne undersøgelse, blev godkendt af Ethics Review Committee på Beijing University of Chinese Medicine (godkendelsesnummer 2017BZYYL00120). 1. Forberedelse og karakterisering af kolloidt guld BEMÆRK: For kolloid guldsyntese, da kolloidguld let adsorberes på fartøjets indre væg og er tilbøjelig til at blive udfældet af urenheder, skal beholderen til syntese og opbevaring af kolloidguld rengøres grundigt o…

Representative Results

Karakterisering af kolloidt guldDe forberedte kolloide guldopløsninger var claret røde. TEM-analyser blev anvendt til at bestemme morfologien og formen af auNPs (figur 2A-D). Figur 2A og figur 2B viser, at partiklerne er polyhedrale i form og jævnt fordelt. Det blev konstateret, at auNPs’ gennemsnitlige diameter var ca. 14 nm (figur 2C). Et TEM -billede (High-Res…

Discussion

I dette arbejde præsenterer vi en protokol til fremstilling af mAbs mod naturlige produkt-afledte små molekyler. De væsentlige trin og de spørgsmål, der kræver opmærksomhed i proceduren, er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol ved hjælp af det lille molekyle SSD som et eksempel. Eksempelspektre, TEM-billeder, kvantitative resultater og metodiske undersøgelser er vist i repræsentative data. Derfor har vi vist, at den kolloide guldproduktion, AuNP-mAb-bøjnings- og stripassemblystrategi, der …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af de særlige fonde for grundforskningsfonde for højere læreanstalter, der er tilknyttet centrale afdelinger. Vi sætter pris på støtte fra klassisk recept grundforskning Team af Beijing University of Chinese Medicine.

Materials

Chloroauric acid solution (HAuCl4) Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory JY-SJ102
bovine serum albumin AMRESCO 332
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
Filter paper Sinopharm H5072
Glass fibre membranes Jieyi XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
Nitrocellulose membranes Millipore millipore 180
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG20000 Sigma Aldrich RNBC6325
Pipette 10mL COSTAR 4488
Pipette 25mL FALCON 357525
semi-rigid PVC sheets Jieyi JY-C104
Sodium citrate Beijing Chemical Works C1034
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Tris-HCl Solarbio 77-86-1
TWEEN 20 Solarbio 9005-64-5

References

  1. Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
  2. Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
  3. Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
  4. Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
  5. Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
  6. Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
  7. Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
  8. Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
  9. Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
  10. Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
  11. Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
  12. Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
  13. Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
  14. Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
  15. Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
  16. Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
  17. Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
  18. Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
  19. Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
  20. Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
  21. Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
  22. Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
  23. Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Cheng, J., Qu, H. Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds. J. Vis. Exp. (177), e62754, doi:10.3791/62754 (2021).

View Video