Summary
We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.
Abstract
Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme en zijn momenteel ongeneeslijk. Deze ziekten veroorzaken neurologische ontwikkelingsdefecten waarvan de onderliggende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Een belangrijke wegversperring is het gebrek aan effectieve modellen die de neuronale stoornis met vroege aanvang bij de patiënten samenvatten. Vooruitgang in de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maakt het mogelijk om driedimensionale (3D) hersenorganoïden te genereren die kunnen worden gebruikt om de impact van ziekten op de ontwikkeling en organisatie van het zenuwstelsel te onderzoeken. Onderzoekers, waaronder deze auteurs, hebben onlangs menselijke hersenorganoïden geïntroduceerd om mitochondriale aandoeningen te modelleren. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik in mitochondriale bio-energetische profilering en beeldvormingsanalyses. Deze experimenten zullen het gebruik van hersenorganoïden mogelijk maken om metabole en ontwikkelingsstoornissen te onderzoeken en kunnen cruciale informatie opleveren om de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten te ontleden.
Introduction
Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme1. Ze worden veroorzaakt door genetische mutaties die verschillende mitochondriale processen verstoren, waaronder oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2, ademhalingsketenassemblage, mitochondriale dynamica en mitochondriale DNA-transcriptie of -replicatie3. Weefsels met energiebehoeften worden in het bijzonder beïnvloed door mitochondriale disfunctie4. Dienovereenkomstig ontwikkelen patiënten met mitochondriale ziekten meestal neurologische manifestaties met vroege aanvang.
Er zijn momenteel geen behandelingen beschikbaar voor kinderen met mitochondriale ziekten5. Een belangrijke belemmering voor de ontwikkeling van mitochondriale ziekten door geneesmiddelen is het gebrek aan effectieve modellen die het verloop van de menselijke ziekte samenvatten6. Verschillende van de momenteel bestudeerde diermodellen vertonen niet de neurologische defecten die bij de patiënten aanwezig zijn7. Vandaar dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten nog steeds niet volledig worden begrepen.
Recente studies genereerden iPSC's van patiënten met mitochondriale ziekten en gebruikten deze cellen om patiëntspecifieke neuronale cellen te verkrijgen. Genetische defecten geassocieerd met de mitochondriale ziekte, het syndroom van Leigh, blijken bijvoorbeeld afwijkingen te veroorzaken in cellulaire bio-energetica8,9, eiwitsynthese10 en calciumhomeostase9,11. Deze rapporten gaven belangrijke mechanistische aanwijzingen over de neuronale stoornis die optreedt bij mitochondriale ziekten, waardoor de weg werd vrijgemaakt voor de ontdekking van geneesmiddelen voor deze ongeneeslijke ziekten12.
Tweedimensionale (2D) culturen maken het echter niet mogelijk om de architecturale complexiteit en regionale organisatie van 3D-organen te onderzoeken13. Hiertoe kan het gebruik van 3D-hersenorganoïden afgeleid van patiëntspecifieke iPSCs14 onderzoekers in staat stellen aanvullende belangrijke informatie te verkrijgen en daardoor te helpen ontleden hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel beïnvloeden15. Studies met iPSC-afgeleide hersenorganoïden om mitochondriale ziekten te onderzoeken, beginnen de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten te ontdekken.
Ruggenmergorganoïden met mutaties geassocieerd met de mitochondriale ziekte, mitochondriale encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes syndroom (MELAS), vertoonden defecte neurogenese en vertraagde differentiatie van motorneuronen16. Corticale organoïden afgeleid van patiënten met de mitochondriale ziekte, Leigh-syndroom, vertoonden verminderde omvang, defecten in neurale epitheliale knopgeneratie en verlies van corticale architectuur17. Hersenorganoïden van patiënten met het Leigh-syndroom toonden aan dat de ziektedefecten initiëren op het niveau van neurale voorlopercellen, die zich niet kunnen binden aan mitochondriaal metabolisme, waardoor afwijkende neuronale vertakkingen en morfogenese18 ontstaan. Neurale voorlopers kunnen dus een cellulair therapeutisch doelwit vormen voor mitochondriale ziekten, en strategieën die hun mitochondriale functie bevorderen, kunnen de functionele ontwikkeling van het zenuwstelsel ondersteunen.
Het gebruik van hersenorganoïden kan helpen bij het blootleggen van de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten. Mitochondriale ziekten worden voornamelijk beschouwd als neurodegeneratie met vroege aanvang5. Neurologische ontwikkelingsstoornissen zijn echter ook aanwezig bij patiënten die worden getroffen door mitochondriale ziekten, waaronder ontwikkelingsachterstand en cognitieve stoornissen19. Patiëntspecifieke hersenorganoïden kunnen helpen deze aspecten aan te pakken en op te helderen hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van de menselijke hersenen kunnen beïnvloeden. Mitochondriale disfunctie kan ook een pathogenetische rol spelen bij andere, meer voorkomende neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington4. Vandaar dat het ophelderen van de impact van mitochondriale defecten in de neurologische ontwikkeling met behulp van hersenorganoïden ook instrumenteel kan zijn voor de studie van die ziekten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden die kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van ziektemodellering van mitochondriale ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voor het gebruik van menselijke iPSC's kan een ethische goedkeuring vereist zijn. iPSC's die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van gezonde controlepersonen na lokale ethische goedkeuring (# 2019-681). Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd onder een steriele celkweekkap, waarbij alle reagentia en verbruiksartikelen zorgvuldig worden gedesinfecteerd voordat ze onder de motorkap worden overgebracht. Menselijke iPSC's die voor differentiatie worden gebruikt, moeten een passagegetal hebben van minder dan 50 om mogelijke genomische afwijkingen te voorkomen die kunnen optreden bij uitgebreide kweek. De pluripotente toestand van de cellen moet vóór organoïdegeneratie worden gevalideerd, bijvoorbeeld door de expressie van pluripotentie-geassocieerde markers zoals NANOG of OCT4 te monitoren. Mycoplasma-tests moeten wekelijks worden uitgevoerd om mycoplasmavrije culturen te garanderen.
1. Generatie van hersenorganoïden
- Cultuur van menselijke iPSC's
- Kweek menselijke iPSC's onder feedervrije omstandigheden in iPSC-medium (zie de tabel met materialen) op gecoate 6-putplaten en bewaar ze in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: De overdracht van feedercellen kan de organoïde differentiatie belemmeren. Passeer de cellen minstens één keer in feedervrije omstandigheden. - Passeer de iPSC's bij 80% confluentie met behulp van enzymvrij loslatingsmedium in verhoudingen variërend van 1: 4 tot 1: 12. Om de celoverleving te verhogen, voegt u na elke splitsing 10 μM Rho-associated protein kinase (ROCK)-remmer (Y27632) toe.
- Kweek menselijke iPSC's onder feedervrije omstandigheden in iPSC-medium (zie de tabel met materialen) op gecoate 6-putplaten en bewaar ze in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Dissociëer de iPSC's (80% confluency)-Dag 0.
- Bereid corticale differentiatie medium I (CDMI) voor (tabel 1). Verwarm CDMI medium voor bij kamertemperatuur (22-25 °C) voordat u het aan de cellen toevoegt.
- Was de putjes met de iPSC's met fosfaatbuffered saline (PBS) om dode cellen en puin te verwijderen.
- Voeg 500 μL voorgewarmd reagens A (materiaaltabel) toe aan elke put en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Controleer onder de microscoop om celloslating te garanderen.
- Voeg 1 ml iPSC-medium toe aan het verdunningsmiddel A om de activiteit ervan te neutraliseren.
- Gebruik een pipet van 1000 μL om de cellen te dissociëren door op en neer te pipetteren en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Centrifugeer de iPSC's voorzichtig bij 125 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (22-25 °C).
- Zuig het supernatant voorzichtig op om te voorkomen dat de celkorrel wordt verstoord.
- Resuspend de pellet met 1 ml CDMI om een eencellige suspensie te verkrijgen en tel het celnummer.
- Bereid het zaaimedium voor met 9.000 iPSC's per 100 μL in CDMI aangevuld met 20 μM ROCK-remmer, 3 μM WNT-catenineremmer (IWR1) en 5 μM SB431542.
- Voeg 100 μL zaaimedium per put toe aan een 96-well v-bottom plaat.
- Bewaar de plaat in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Neurosfeer generatie
- Merk op dag 1 op dat ronde celaggregaten (neurosferen) met gedefinieerde gladde randen zich vormen. Let op de dode cellen rond de aggregaten. Blijf in de couveuse kweken bij 37 °C en 5% CO2.
- Op dag 3 roer je de plaat door drie keer op de zijkanten te tikken om dode cellen los te maken.
- Voeg 100 μL CDMI aangevuld met 20 μM ROCK-remmer, 3 μM IWR1 en 5 μM SB431542 toe aan elke put.
- Breng de plaat terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Verwijder op dag 6 voorzichtig 80 μL van het supernatant medium uit elke put. Vermijd het aanraken van de bodem van de put.
- Voeg 100 μL CDMI aangevuld met 3 μM IWR1 en 5 μM SB431542 toe aan elke put. Breng de plaat terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Herhaal stap 5 en 6 elke 3 dagen tot dag 18.
- Overdracht van neurosferen
- Bereid op dag 18 Cortical Differentiation Medium II (CDMII) (tabel 1) voor en voeg 10 ml toe aan een celkweekplaat van 100 mm met ultralaage aanhechting.
- Gebruik een pipet van 200 μL met de punt afgesneden om de ronde neurosferen van de 96-well plaat over te brengen naar de 100 mm ultra-low attachment celkweekplaat.
OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de neurosferen worden beschadigd door ervoor te zorgen dat de opening van de punt breed genoeg is en dat de aggregaten niet te snel worden aangezogen. - Verwijder 5 ml medium uit de plaat met de neurosferen en voeg 5 ml verse CDMII toe.
OPMERKING: Deze procedure helpt om de hoeveelheid CDMI-medium te verminderen die mogelijk is overgedragen van de overdracht van neurosferen. - Plaats de plaat op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Inspecteer de neurosferen de volgende dag visueel. Verhoog de snelheid van de orbitale shaker als de neurosferen samengeklonterd zijn of aan de onderkant van de plaat zijn bevestigd. - Aspirateer het supernatant medium elke 3 dagen zorgvuldig en vervang het door verse CDMII. Laat een kleine hoeveelheid van het medium achter om te voorkomen dat de neurosferen uitdrogen.
- Bereid op dag 35 Corticale Differentiatie Medium III (CDMIII) voor (Tabel 1).
OPMERKING: De matrixcomponent moet worden opgelost in koude CDMIII. - Zuig het medium uit de plaat en voeg 10 ml koude CDMIII toe.
OPMERKING: Het is effectiever om koud medium te gebruiken, zodat de matrixcomponent de organoïden kan coaten zonder klonten te vormen. - Plaats de plaat na het verwisselen van het medium terug op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Verander het medium elke 3-5 dagen, afhankelijk van de groeisnelheid, zoals aangegeven door de kleur van het medium.
- Bereid op dag 70 Corticale Differentiatie Medium IV (CDMIV) voor (Tabel 1). Gebruik CDMIV-medium totdat de gewenste leeftijd van organoïden is bereikt. Houd de plaat gedurende deze periode op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C en 5% CO2).
- Verander het medium elke 3-5 dagen, afhankelijk van de groeisnelheid.
2. Immunostaining van hersenorganoïden
- Weefselvoorbereiding
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing en plaats deze onder een veiligheidskap.
OPMERKING: Draag persoonlijke veiligheidsuitrusting bij het hanteren van PFA. - Verzamel hersenorganoïden en breng ze voorzichtig over met een stompe plastic Pasteur-pipet van 3 ml naar een 6-well plaat gevuld met PFA.
OPMERKING: Gebruik organoïden ouder dan 40 dagen om de visualisatie van structuren met een hogere cellulaire complexiteit mogelijk te maken. - Bewaar de organoïden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de PFA-oplossing.
- Verwijder de PFA voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet van 3 ml en was de vaste organoïden drie keer met PBS.
- Bewaar de vaste organoïden bij 4 °C in PBS tot verder gebruik.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing en plaats deze onder een veiligheidskap.
- Bereiding van hersenorganoïde plakjes
- Bereid een 3% agar-oplossing en verwarm langzaam tot het vloeibaar is.
- Plaats de vorm (het gesneden uiteinde van een spuit van 10 ml) op een stuk absorberend filterpapier (gladde kant naar boven). Leg er een druppeltje agar op.
- Haal snel een enkele organoïde uit de 6-putplaat met een spatel en verwijder overtollige PBS met filterpapier.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de organoïde niet rechtstreeks met filterpapier aanraakt. - Plaats de organoïde op de agardruppel.
- Herhaal deze procedure met maximaal drie organoïden.
OPMERKING: Werk snel om stolling van de agar tijdens deze stap te voorkomen. - Vul de mal opnieuw met agar totdat alle organoïden volledig bedekt zijn.
- Wacht tot de agar begint te stollen en breng dan voorzichtig de hele mal met de organoïden, inclusief het absorberende filterpapier, over op een koelelement.
OPMERKING: Als een koelelement niet beschikbaar is, bewaar de organoïden dan enkele minuten in een koelkast bij 4 °C. - Bereid je in de tussentijd voor op de snijprocedure: plaats een scheermesje (gereinigd met aceton en gewassen met dubbel gedestilleerd water) in de houder van de vibratome, monteer het op het bad en vul het met PBS.
- Verwijder de vorm van (gestolde) agar en gebruik een scalpel om het te trimmen tot een kubus.
- Bevestig de agarkubus met de organoïden op de dragerplaat van de vibratome met kleefgel (zie de tabel met materialen) en plaats deze in het bad met PBS.
- Pas de trilling aan (zie de tabel met materialen) om plakjes met een dikte van 150 μm te snijden.
OPMERKING: Vibratome-instellingen (juiste hoek, amplitude, frequentie en snelheid van het blad) kunnen vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor het snijden van vast hersenweefsel afkomstig van vroege postnatale dieren. De ideale instellingen zijn echter sterk afhankelijk van het type vibratome en moeten in een eerste stap worden bepaald om vervorming of zelfs scheuren van het weefsel tijdens het snijden te voorkomen. - Start de snijprocedure. Gebruik een glazen pipet of een spatel om elk vers gesneden plakje voorzichtig over te brengen in een 24-wells plaat gevuld met PBS.
- Bewaar de plaat met plakjes bij 4 °C (tot enkele dagen) tot verdere verwerking.
- Breng de plakjes uit de plaat met een glazen pipet of een spatel over op microscoopglaasjes. Gebruik minimaal 2 segmenten per dia.
- Verwijder voorzichtig de agar en overtollige PBS met een spuit.
- Laat de plakjes drogen tot ze zich aan de dia's hechten.
OPMERKING: Hoewel microscoopglaasjes kunnen worden opgeslagen in plastic kamers gevuld met PBS bij 4 °C, moeten ze zo snel mogelijk na de snijprocedure worden gekleurd.
- Immunohistochemische kleuring
- Bereid de blokkeringsoplossing voor (tabel 1).
- Gebruik een PAP-pen om een hydrofobe rand rond de plakjes op de dia te tekenen om alle oplossingen op de dia's te houden.
- Voeg voorzichtig de blokkeringsoplossing toe op de dia en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (22-25 °C). Om te voorkomen dat het weefsel wordt vernietigd, moet u de oplossing niet direct op de plakjes toevoegen.
- Zuig de blokkerende oplossing op en breng het gewenste primaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing aan.
- Incubeer de glijbaan een nacht in een bevochtigde kamer bij 4 °C.
- Spoel de dia drie keer af met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer de plakjes met het specifieke secundaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing en voer Hoechst-kleuring (1:2.500) uit gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
OPMERKING: Vergeet niet om negatieve controles uit te voeren om te bevestigen dat er geen niet-specifieke binding of autofluorescentie is. - Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk in het donker.
- Voeg een druppel bevestigingsmedium toe aan de plak, plaats een deklap op de rand van de druppel en leg de deksels langzaam naar beneden in de richting van de plak om luchtbellen te voorkomen.
- Laat de glijbaan een nacht rusten bij kamertemperatuur. Breng nagellak aan op de rand van de coverslip om de slide verder af te dichten. Voor langdurige opslag, bewaren bij 4 °C.
- Documentatie van kleuring
- Om grote afbeeldingen te scannen op stiksels, gebruikt u een gemotoriseerde rechtopstaande breedveldmicroscoop die is uitgerust met (zie de tabel met materialen voor details) een objectief van hoge kwaliteit; DAPI-filterset (bijv. excitatie (EX): 340-380 nm, dichroïsche spiegel (DM): 400 nm, barrièrefilter (BA): 435-485 nm); fluoresceïne-isothiocyanaatfilterset (bijv. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 filterset (bijv. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); digitale camera; krachtige acquisitiesoftware die geautomatiseerde steken en stapelbewerkingen mogelijk maakt.
- Gebruik voor beeldverwerking een beeldverwerkingsprogramma dat 8-bits tif-bestanden kan genereren, steken kan bijsnijden, contrast en helderheid kan aanpassen, de kanalen kan samenvoegen (bijvoorbeeld blauw, groen en rood) en schaalbalken kan toevoegen.
- Gebruik voor het scannen van details een gemotoriseerde confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een hoogwaardig objectief, een UV-laser (EX: 408 nm), een Argon-laser (EX: 488 nm), een Helium-Neon-laser (EX: 543), beeldvormingssoftware voor een confocale microscoop.
- Gebruik voor beeldverwerking van details een beeldverwerkingsprogramma dat in staat is om projecties met maximale intensiteit van confocale z-stacks te genereren (bijvoorbeeld optische secties van elk 0,6 μm), 8-bits tif-bestanden te genereren, contrast en helderheid aan te passen, de kanalen samen te voegen (bijvoorbeeld blauw, groen en rood), schaalbalken toe te voegen.
- Gebruik een grafische editor om de cijfers te rangschikken.
3. Bio-energetische profilering van hersenorganoïden
- Voorbereiding van organoïden voor bio-energetische profilering
- Bereid de papaïne en DNase-oplossing volgens het protocol van de fabrikant.
- Breng 3-5 organoïden over in een plaat met 6 putten. Was ze twee keer met voorverwarmde PBS.
- Voeg 2 ml voorgewarmde geactiveerde papaïneoplossing toe die DNase bevat. Snijd met een mes de organoïden in kleine stukjes.
- Plaats de plaat op een orbitale shaker met 27 tpm in een celkweekincubator (bij 37 °C, 5% CO2) en incubeer gedurende 15-20 minuten.
OPMERKING: De tijd van incubatie is afhankelijk van het organoïde stadium. Organoïden in een vroeg stadium kunnen worden gebruikt zoals ze zijn. Voor organoïden ouder dan 3 maanden wordt aanbevolen om de organoïden vóór dissociatie in 2-3 stukken te snijden en de stukken te incuberen met een schommelsnelheid die is ingesteld op 27 tpm gedurende 15-20 minuten bij 37 °C. Deze procedure kan helpen bij het verwijderen van necrotisch weefsel dat aanwezig kan zijn in de organoïden in een later stadium. - Verzamel de verteerde weefsels in een buis van 15 ml en voeg 5 ml organoïde kweekmedium CDMIV toe (tabel 1).
- Trituraer het weefsel met een plastic pipet van 10 ml door 10-15 keer op en neer te pipetteren. Laat het niet-gedissoceerde weefsel tot op de bodem van de buis bezinken.
- Breng de celsuspensie voorzichtig over naar een buis van 15 ml en vermijd stukjes onversost weefsel. Filtreer de oplossing door een celzeef van 40 μm (bijv. polystyreenbuizen met ronde bodem met celzeefdoppen).
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Beoordeel het celnummer en de kwaliteit met trypan blue.
- Plaats het gewenste aantal (~ 20.000 / put) cellen op gecoate 96-well microplaten. Verander het medium 6-8 uur na plating in Neuronal Medium (tabel 1).
- Incubeer de gecoate 96-well microplaat gedurende 4 dagen in een CO2-incubator (37 °C, 5% CO2).
- Bio-energetische profilering
- Voeg op dag 3 na het afstoten van de gedissocieerde cellen 200 μL kalibratieoplossing toe aan elk putje van het onderste deel van de 96-well microplaat en plaats de bovenste groene sensorcartridge op de gehydrateerde microplaat.
OPMERKING: Plaats de sensorcartridge bovenop de microplaat in de juiste richting en zorg ervoor dat de kalibrantoplossing alle sensoren bedekt. - Incubeer de gehydrateerde 96-well microplaat 's nachts in een niet-CO2-incubator bij 37 °C.
- Schakel de analysator in om het instrument 's nachts bij 37 °C te laten stabiliseren.
- Inspecteer op dag 4 na het opnieuw afspelen de gedisassocieerde organoïde cultuur op de 96-well microplaat onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen verschijnen als een confluente monolaag.
- Bereid het testmedium voor (tabel 1).
- Verwijder Neuronal Medium uit alle putten met een pipet zonder de bodem van de put aan te raken om celbeschadiging te voorkomen. U kunt ook voorzichtig het hele bord omkeren en vervolgens drogen op schoon papier. Werk snel om celdood te voorkomen.
- Was de cellen tweemaal met voorgewarmd 200 μL assaymedium. Voeg assay medium toe aan een eindvolume van 180 μL per put. Incubeer de 96-well microplaat in een niet-CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Bereid 10 μM-oplossingen van mitochondriale remmers in assaymedium. Merk op dat de uiteindelijke concentratie na injectie 1 μM is.
- Laad de sensorcartridge die in de gehydrateerde microplaat is geplaatst met 10x-oplossingen van de mitochondriale remmers.
- Voeg 18 μL mitochondriale remmer 1 toe aan poort A.
- Voeg 19,8 μL mitochondriale remmer 2 toe aan poort B.
- Voeg 21,6 μL mitochondriale remmer 2 toe aan poort C.
- Voeg 23,4 μL mitochondriale remmer 3 toe aan poort D.
- Plaats de geladen patroon in de gehydrateerde microplaat in een niet-CO2-incubator bij 37 °C tot het begin van de test.
- Stel een hardloopprotocol in de software van het instrument in (tabel 2).
- Druk op START. Neem de geladen cartridge uit de niet-CO2-incubator en plaats deze in de analysator voor kalibratie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de plaat in de juiste richting en zonder deksel is geplaatst. - Zodra de kalibratiestap is voltooid, verwijdert u de kalibratieplaat. Neem de 96-well microplaat uit de niet-CO2-incubator en plaats deze in de analyzer. Klik op DOORGAAN om de metingen te starten.
- Wanneer de run is voltooid, verwijdert u de 96-well celkweekmicroplaat uit de analyzer en verzamelt u het medium uit alle putten zonder de cellen te storen.
OPMERKING: Het medium kan worden bewaard bij -20 °C en later worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid lactaat die door de cellen in het medium wordt vrijgegeven met behulp van een geschikte lactaattestkit. - Was de cellen met 200 μL 1x PBS in elke put.
- Na het verwijderen van de PBS vriest u de plaat in bij -20 °C.
OPMERKING: De bevroren plaat kan worden gebruikt om cellen, eiwitten of DNA in elke put van de microplaat te kwantificeren. Deze kwantificering zal nodig zijn voor het normaliseren van de verkregen bio-energetische snelheden. Volg de instructies van de fabrikant voor cel-, eiwit- of DNA-kwantificeringstests.
- Voeg op dag 3 na het afstoten van de gedissocieerde cellen 200 μL kalibratieoplossing toe aan elk putje van het onderste deel van de 96-well microplaat en plaats de bovenste groene sensorcartridge op de gehydrateerde microplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol vergemakkelijkt de robuuste generatie van ronde organoïden (figuur 1A). De gegenereerde organoïden bevatten volwassen neuronen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van eiwitmarkers die specifiek zijn voor axonen (SMI312) en dendrieten (microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2)) (Figuur 1B). Volwassen organoïden bevatten niet alleen neuronale cellen (MAP2-positief), maar ook gliacellen (bijvoorbeeld positief voor de astrocytenmarker S100 calciumbindend eiwit B (S100ß)) (figuur 1B)).
Door gesneden hersenorganoïden te analyseren met behulp van confocale microscopie, is het mogelijk om de gedetailleerde distributie en organisatie van verschillende celtypen en cellulaire structuren te identificeren en te controleren. Dit zou nieuw inzicht kunnen geven in hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van het zenuwstelsel kunnen beïnvloeden. Het is bijvoorbeeld mogelijk om neuronale axonen (SMI312-positief) en dendrieten (MAP2-positief) (figuur 2A) of het wederzijdse voorkomen van neuronale cellen (MAP2-positief) en gliacellen (S100ß-positief) (figuur 2A) te monitoren. Confocale beelden kunnen ook helpen om de verdeling en organisatie van neurale voorlopercellen ((geslachtsbepalend gebied Y) box-2 (SOX2)-positief) ten opzichte van neuronen (bèta-III tubuline (TUJ1)-positief) (figuur 2B) nader te onderzoeken. Ten slotte kunnen hersenorganoïden worden gekleurd voor mitochondria-specifieke markers (zoals het buitenste mitochondriale membraaneiwit, translocase van buitenmembraan 20 kDa subeenheid (TOM20)) (Figuur 2C)).
Het beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om bio-energetische profilering van hersenorganoïden uit te voeren. Met behulp van deze procedure is het mogelijk om zowel het mitochondriale metabolisme te meten met behulp van de zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) (figuur 2D) als het glycolytische metabolisme met behulp van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (figuur 2E). Bio-energetische profilering maakt het mogelijk om te monitoren hoe cellen hun OCR- en ECAR-profielen kunnen wijzigen als reactie op een sequentiële toediening van mitochondriale remmers.
Ten eerste kan de ATP-synthaseremmer, oligomycine, worden toegepast. Oligomycine veroorzaakt een daling van het OCR-profiel (figuur 2D) en identificeert daarom de OCR die nodig is voor ATP-productie. Bij behandeling met oligomycine kan er ook een compenserende toename van ECAR zijn (figuur 2E), wat suggereert dat de cellen glycolyse kunnen upreguleren om de metabole stress veroorzaakt door de vermindering van het mitochondriale metabolisme te voorkomen. De daaropvolgende dubbele toepassing van het proton ionofoor, carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP), veroorzaakt het verlies van het mitochondriale membraanpotentiaal. Omdat de zuurstofmoleculen nu vrij kunnen bewegen, veroorzaakt dit een snelle toename van OCR (figuur 2D).
Deze veranderingen in het OCR-profiel identificeren de maximale ademhalingscapaciteit van de cellen. De uiteindelijke toediening van rotenon plus antimycine A veroorzaakt een blok van het elektronentransport en daarom een steile afname van OCR (figuur 2D). ECAR kan fluctuatie vertonen na behandeling met FCCP en rotenon plus antimycine A (figuur 2E), afhankelijk van de resterende glycolytische capaciteit van de cellen. De OCR- en ECAR-profielen kunnen dramatisch worden gewijzigd in hersenorganoïden die zijn afgeleid van mitochondriale patiënten.
Figuur 1: Generatie van hersenorganoïden uit menselijke iPSC's. (A) Schematische weergave van het protocol dat wordt gebruikt om hersenorganoïden te produceren met bijbehorende transmissiebeelden. Dag 0 komt overeen met de dissociatie van iPSC's en zaaien in een 96-well plaat met V-bodem met BEHULP van CDMI aangevuld met een ROCK-remmer, een WNT-remmer en SB431542. Op dag 18 worden neurosferen overgebracht van de 96-well platen naar 100 mm celkweekschalen met CDMII aangevuld met N2. Vanaf dit punt worden de culturen op een orbitale shaker geplaatst. Op dag 35 wordt het medium overgeschakeld van CDMII naar CDMIII, dat ook een opgeloste matrixcomponent bevat (tabel 1). Vanaf dag 70 wordt CDMIII overgeschakeld op CDMIV aangevuld met B27. Op dag 12 werd een representatief neurosfeerbeeld gemaakt met een microscoopcamera met 10x vergroting. Een vroege organoïde opname werd gemaakt op dag 22 met behulp van een microscoopcamera met 4x vergroting. Op dag 40 werd een volwassen organoïde opname gemaakt met een microscoopcamera met 4x vergroting. (B) De algehele structuur en cellulaire organisatie van hersenorganoïden kan worden gevisualiseerd met behulp van wide-field microscopie. Representatieve gestikte breedveldbeelden worden getoond om de relaties tussen dendrieten (MAP2-positief) en axonen (SMI312-positief) en tussen neuronale cellen (MAP2-positief) en veronderstelde astrocyten (S100ß-positief) te visualiseren. De cellen werden bevlekt met Hoechst om de kernen te onthullen. Alle beelden zijn gemaakt met behulp van 78 dagen oude hersenorganoïden. De rechterkolom toont de overlay van drie kanalen (samenvoegen). Schaalbalken = 500 μm. Afkortingen: iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; CDM = Corticale Differentiatie Medium; ROCK = Rho kinase; MAP2 = microtubule-geassocieerd eiwit 2; S100ß= S100 calciumbindend eiwit B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie en bio-energetische profilering van hersenorganoïden voor mitochondriale ziektemodellering. De gedetailleerde organisatie en architectuur van organoïden kan worden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie. Alle foto's zijn gemaakt met behulp van 78 dagen oude hersenorganoïden en tegengekleurd met Hoechst om de kernen te onthullen. De rechterkolom toont de overlay van drie kanalen (samenvoegen). Schaalbalken = 50 μm. (A) Representatieve projecties met uitgebreide focus (44-48 optische vlakken, elk 0,6 μm) die het samenspel tussen dendrieten (MAP2-positieve, pijlpunten) en axonen (SMI312-positieve, pijlen) en tussen neuronale cellen (MAP2-positieve, pijlpunten) en veronderstelde astrocyten (S100ß-positieve, pijlen) aanpakken. (B) Representatieve extended-focus projecties (14-31 optische vlakken, elk 0,6 μm) die de verdeling van neuronen (TUJ1-positief, pijlpunten) ten opzichte van neurale voorlopers (SOX2-positieve, pijlen) laten zien. (C) Representatieve extended-focus projecties (20 optische vlakken, elk 0,6 μm) die de verdeling binnen neuronen (TUJ1-positieve, pijlpunten) van mitochondriën laten zien (gevisualiseerd met behulp van antilichamen tegen het buitenste mitochondriale membraaneiwit TOM20, pijlen). (D) Mitochondriale ademhaling van hersenorganoïden kan worden gecontroleerd op basis van het profiel van de OCR na sequentiële toediening van verschillende mitochondriale remmers (zie tekst voor details). (E) Glycolytische activiteit van hersenorganoïden kan worden gecontroleerd op basis van de ECAR bij sequentiële toediening van mitochondriale remmers (zie tekst voor details). Voor bio-energetische profilering werden ongeveer 10-15 hersenorganoïden gedissocieerd om voldoende cellen te verkrijgen om op de 96-well microplaat te reperen. De balken geven de SEMs aan op basis van de resultaten verkregen in twee onafhankelijke experimenten. Afkortingen: MAP2 = microtubule-associated protein 2; S100ß = S100 calciumbindend eiwit B; TUJ1 = bèta-III tubuline; SOX2 = (geslachtsbepalend gebied Y) box-2; TOM20 = translocase van buitenmembraan 20 kDa subeenheid; OCR = zuurstofverbruik; ECAR = extracellulaire verzuringssnelheid; Oligom. = oligomycine; FCCP = carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon; R = rotenon; AntA = Antimycine A; SEMs = standaard fout van middelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Media compositie | |||
| CDMI (Dag 0-18) | Slotconc. | ||
| Glasgow-Mem | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Knockout serumvervanging (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (MEM niet-essentiële aminozuuroplossing) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Natriumpyruvaat | Gibco | 11360070 | 1mm |
| 2-mercaptethanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicilline en streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml en 100 μg/ml |
| CDMII (Dag 18-35) | Slotconc. | ||
| Dmem/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 meter |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilline en streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml en 100 μg/ml |
| CDMIII (Dag 35-70) | Slotconc. | ||
| Dmem/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 meter |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilline en streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml en 100 μg/ml |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparine | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV (Dag 70+) | Slotconc. | ||
| Dmem/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 meter |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilline en streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml en 100 μg/ml |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparine | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| B-27 supplement met vitamine A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Neuronaal Medium | Slotconc. | ||
| Dmem/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| N-2 aanvulling | Gibco | 17502048 | [1x] |
| B-27 supplement met vitamine A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| L-ascorbinezuur | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (dibutyryl cyclisch adenosinemonofosfaat) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (van de hersenen afgeleide neutrotrofe factor) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/ml] |
| GDNF (van gliacellijn afgeleide neurotrofe factor) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/ml] |
| Humane TGF-β3 (transformerende groeifactor-bèta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/ml] |
| Assay Medium | Slotconc. | ||
| Seahorse XF DMEM medium | Zeepaardje Bioscience | 103680-100 | 500 ml |
| Natriumpyruvaat | Gibco | 11360070 | 1mm |
| L-glutamine | Lonza | Bebp17-605e | 2 meter |
| Glucose | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 meter |
| Oplossing voor blokkeren | Slotconc. | ||
| PBS-Tween | [01:1] 0,1% Tween | ||
| Ezel Serum | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Triton-X | Merck | x100-5ml | 1% |
Tabel 1: Details van media en oplossingen die worden gebruikt voor het genereren van organoïden.
| Initialisatie | Basislijn (X3) | Oligomycine Injectie (X3) | FCCP Injectie (X3) | FCCP Injectie (X3) | Anti A + Rot Injectie (X3) |
| Kalibreren | Mengen | Mengen | Mengen | Mengen | Mengen |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Evenwicht (12:00) | Wachten | Wachten | Wachten | Wachten | Wachten |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Maatregel (03:00) | Maatregel (03:00) | Maatregel (03:00) | Meten | Maatregel (03:00) | |
| (03:00) |
Tabel 2: Protocolopstelling voor bio-energetische profilering. Beschrijving van de stappen en hun lengte in enkele minuten met behulp van de Seahorse Wave Desktop-software. Afkortingen: FCCP = carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon; Rot = rotenon; Anti A = Antimycine A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft de reproduceerbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik voor mitochondriale ziektemodellering. Het hier beschreven protocol is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd werk20. Een groot voordeel van het huidige protocol is dat het niet vereist dat elke organoïde handmatig in een steigermatrix wordt ingesloten. In feite wordt de matrixoplossing eenvoudig opgelost in het celkweekmedium. Bovendien is het niet nodig om dure bioreactoren te gebruiken, omdat organoïden kunnen worden gekweekt in standaard weefselkweek 6-well platen die op een orbitale shaker in de incubator zijn geplaatst. Deze procedure maakt ook de parallelle teelt mogelijk van verschillende platen die verschillende organoïden bevatten die zijn afgeleid van verschillende individuele lijnen, waardoor de doorvoer van de experimenten wordt verhoogd en de potentiële verschillen in de groeiprofielen van verschillende organoïden kunnen worden gevolgd. We hebben dit protocol getest met behulp van verschillende iPSC's afgeleid van gezonde controles en personen die zijn getroffen door mitochondriale ziekten, met consistente resultaten.
Voor mitochondriale ziektemodellering is het essentieel om verschillende markers te gebruiken om de morfologie en organisatie van het mitochondriale netwerk te visualiseren. Deze procedure maakt het mogelijk om te onderzoeken of mitochondriaal aantal, morfologie of distributie kan worden gewijzigd in hersenorganoïden afkomstig van patiënten met mitochondriale ziekten. De aanwezigheid en organisatie van neurale voorlopers in de hersenorganoïden kan van cruciaal belang zijn voor het modelleren van mitochondriale aandoeningen. We hebben onlangs ontdekt dat mutaties die de mitochondriale ziekte veroorzaken, het Leigh-syndroom, de cellulaire architectuur en distributie van neurale voorlopercellen in van de patiënt afgeleide hersenorganoïden verstoren18.
Voor het uitvoeren van bio-energetische profilering hebben we een eerder beschreven methode aangepast voor het beoordelen van de bio-energetica van pluripotente stamcellen21. Een recent protocol beschreef hoe bio-energetische profilering van organoïden afgeleid van de dunne darm van muizen, menselijke dikke darm en colorectale tumoren22. Die organoïden zijn echter vrij klein in vergelijking met hersenorganoïden, en daarom is een ander protocol, zoals hier gerapporteerd, nodig voor hersenorganoïden. We hebben dit protocol onlangs gebruikt voor het beoordelen van het bio-energetische profiel van menselijke hersenorganoïden die mutaties dragen in het surfeit locus protein 1-gen (SURF1) dat de ernstige mitochondriale ziekte Leigh-syndroom veroorzaakt18. We vonden dat het OCR-profiel met name wordt beïnvloed door organoïden met het syndroom van Leigh, zoals blijkt uit een significante afname van het basale OCR-niveau, de ATP-productiesnelheid en de maximale ademhalingssnelheid18.
Tot slot presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke hersenorganoïden en beschrijven we hoe experimenten kunnen worden uitgevoerd die belangrijk zouden zijn voor het onderzoek naar de ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan mitochondriale ziekten. Organoïden in de menselijke hersenen kunnen ook van cruciaal belang zijn voor het ophelderen van de mitochondriale diversiteit in het menselijk brein en de rol ervan in de menselijke gezondheid en ziekten23. Het is belangrijk om te verduidelijken dat hersenorganoïden die worden gegenereerd met momenteel beschikbare protocollen, waaronder degene die hier wordt beschreven, nog steeds beperkingen hebben. Deze omvatten bijvoorbeeld het gebrek aan vascularisatie en de afwezigheid van microgliapopulatie24. Met deze aspecten moet rekening worden gehouden om de resultaten correct te interpreteren.
Het ontbreken van vasculatuur en microglia zou bijvoorbeeld compenserende mechanismen kunnen beperken die in vivo aanwezig kunnen zijn. Van de patiënt afgeleide hersenorganoïden kunnen dus defecten vertonen die sterker zijn dan die waargenomen bij patiënten17,18. Bovendien kan, ondanks een algemene reproduceerbaarheid van dit protocol20, lijn-tot-lijn heterogeniteit worden waargenomen. Hiertoe is het bij het uitvoeren van ziektemodelleringsstudies altijd belangrijk om systematisch de uniformiteit van controle- en patiëntorganoïden te kwantificeren door de patronen van morfologie (grootte, laag) en de verdeling van moleculaire markers over verschillende organoïden te beoordelen.
Ten slotte is het niet mogelijk om hersenorganoïden te genereren uit een enkele iPSC, waardoor de haalbaarheid van grootschalige genetische screening met CRISPR / Cas9 wordt beperkt. Gezien het tempo van het onderzoek is het waarschijnlijk dat enkele van de huidige beperkingen van het hier beschreven protocol binnenkort zullen worden overwonnen. Geoptimaliseerde protocollen komen beschikbaar. Deze 3D-modellen van mitochondriale ziekten zullen hopelijk de uiteindelijke ontdekking mogelijk maken van uitvoerbare therapieën voor mitochondriale ziekten, die schadelijk zijn, en voor ongeneeslijke ziekten met zeer onvervulde medische behoeften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Wij danken Miriam Bünning voor de technische ondersteuning. We erkennen de steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 aan A.P.), Spark en Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), de United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) en het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (e: Bio jonge onderzoeker subsidie AZ 031L0211 aan A.P.). Het werk in het laboratorium van C.R.R. werd ondersteund door de DFG (FOR 2795 "Synapsen under stress", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
