Summary
Vi beskriver en detaljeret protokol for generering af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse i modellering mitokondrie sygdomme.
Abstract
Mitokondriesygdomme repræsenterer den største klasse af medfødte fejl i stofskiftet og er i øjeblikket uhelbredelige. Disse sygdomme forårsager neuroudviklingsmæssige defekter, hvis underliggende mekanismer endnu ikke er belyst. En større vejspærring er manglen på effektive modeller, der rekapitulerer den tidlige neuronal svækkelse, der ses hos patienterne. Fremskridt inden for teknologien af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) muliggør generering af tredimensionelle (3D) hjerneorganoider, der kan bruges til at undersøge virkningen af sygdomme på udviklingen og organiseringen af nervesystemet. Forskere, herunder disse forfattere, har for nylig indført menneskelige hjerneorganoider til model mitokondrie lidelser. Dette papir rapporterer en detaljeret protokol for den robuste generation af humane iPSC-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse i mitokondrie bioenergetisk profilering og billeddannelse analyser. Disse eksperimenter vil gøre det muligt at bruge hjerneorganoider til at undersøge metaboliske og udviklingsmæssige dysfunktioner og kan give afgørende oplysninger til at dissekere neuronale patologi af mitokondriesygdomme.
Introduction
Mitokondriesygdomme repræsenterer den største klasse af medfødte fejl i stofskiftet1. De er forårsaget af genetiske mutationer forstyrre forskellige mitokondrie processer, herunder oxidativ fosforylering (OXPHOS)2, respiratorisk kæde samling, mitokondrie dynamik, og mitokondrie DNA transskription eller replikation3. Væv med energibehov er særligt påvirket af mitokondrie dysfunktion4. Derfor udvikler patienter med mitokondriesygdomme typisk tidlige neurologiske manifestationer.
Der er i øjeblikket ingen behandlinger til rådighed for børn ramt af mitokondrie sygdomme5. En væsentlig hindring for lægemiddeludvikling af mitokondriesygdomme er manglen på effektive modeller, der rekapitulerer det menneskelige sygdomsforløb6. Flere af de aktuelt undersøgte dyremodeller udviser ikke de neurologiske defekter, der er til stede hos patienterne7. Derfor er de mekanismer, der ligger til grund for neuronal patologi af mitokondriesygdomme, stadig ikke fuldt forstået.
Nylige undersøgelser genererede iPSC'er fra patienter, der var ramt af mitokondriesygdomme, og brugte disse celler til at opnå patientspecifikke neuronale celler. For eksempel, genetiske defekter forbundet med mitokondriesygdom, Leigh syndrom, har vist sig at forårsage afvigelser i cellulære bioenergetics8,9, proteinsyntese10, og calcium homøostase9,11. Disse rapporter gav vigtige mekanistiske spor om neuronal svækkelse forekommer i mitokondrie sygdomme, bane vejen for opdagelse af lægemidler for disse uhelbredelige sygdomme12.
Todimensionelle (2D) kulturer gør det imidlertid ikke muligt at undersøge den arkitektoniske kompleksitet og regionale organisering af 3D-organer13. Med henblik herpå kan brugen af 3D-hjerneorganoider afledt af patientspecifikke iPSCs14 give forskerne mulighed for at få yderligere vigtige oplysninger og dermed bidrage til at dissekere, hvordan mitokondriesygdomme påvirker udviklingen og funktionen af nervesystemet15. Undersøgelser, der anvender iPSC-afledte hjerneorganoider til at undersøge mitokondriesygdomme, begynder at afdække de neuroudviklingsmæssige komponenter i mitokondriesygdomme.
Rygmarvsorganoider med mutationer forbundet med mitokondriesygdom, mitokondrie encephalopati, mælkesyreose og slagtilfældelignende episoder syndrom (MELAS), viste defekt neurogenese og forsinket motor neurondifferentiering16. Kortikale organoider stammer fra patienter med mitokondriesygdom, Leigh syndrom, viste nedsat størrelse, defekter i neural epitel bud generation, og tab af kortikale arkitektur17. Hjerneorganoider fra Leigh syndrom patienter viste, at sygdommen defekter indlede på niveau med neurale stamfader celler, som ikke kan forpligte sig til mitokondrie metabolisme, forårsager afvigende neuronal forgrening og morfogenese18. Således, neurale forfædre kan repræsentere en cellulær terapeutisk mål for mitokondrie sygdomme, og strategier fremme deres mitokondrie funktion kan støtte den funktionelle udvikling af nervesystemet.
Brugen af hjerneorganoider kan hjælpe med at afdække de neuroudviklingsmæssige komponenter i mitokondriesygdomme. Mitokondriesygdomme betragtes hovedsageligt som tidlig neurodegeneration5. Men, neuroudviklingsmæssige defekter er også til stede hos patienter ramt af mitokondrie sygdomme, herunder udviklingsforsinkelse og kognitiv svækkelse19. Patient-specifikke hjerne organoider kan hjælpe med at løse disse aspekter og belyse, hvordan mitokondrie sygdomme kan påvirke menneskets hjerne udvikling. Mitokondrie dysfunktion kan også spille en patogenetisk rolle i andre mere almindelige neurologiske sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og Huntingtons Sygdom4. Derfor kan det også være medvirkende til studiet af disse sygdomme at belyse virkningen af mitokondriedefekter i neuroudvikling ved hjælp af hjerneorganoider. Dette papir beskriver en detaljeret protokol til generering reproducerbare hjerneorganoider, der kan bruges til at gennemføre sygdom modellering af mitokondrie sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brugen af menneskelige iPSC'er kan kræve en etisk godkendelse. IPSCs, der anvendes i denne undersøgelse, stammer fra raske kontrolpersoner efter lokal etisk godkendelse (# 2019-681). Alle cellekulturprocedurer skal udføres under en steril cellekulturhætte, der omhyggeligt desinficerer alle reagenser og forbrugsstoffer, før de overføres under emhætten. Humane iPSC'er, der anvendes til differentiering, bør have et passagertal under 50 for at undgå potentielle genomiske afvigelser, der kan forekomme på omfattende kultur. Cellernes pluripotente tilstand skal valideres før organoidgenerering, f.eks. Mycoplasma tests bør udføres ugentligt for at sikre mycoplasma-fri kulturer.
1. Generering af hjerneorganoider
- Kultur af menneskelige iPSCs
- Kultur humane iPSC'er under feederfrie forhold i iPSC-medium (se materialetabellen) på coatede 6-brøndsplader og opbevar dem i en luftfugtet vævskulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Overførsel af fødeceller kan hæmme organoiddifferentieringen. Passage cellerne mindst én gang i feeder-fri betingelser. - Passage iPSCs ved 80% sammenløb ved hjælp af enzymfri løsrivelse medium i nøgletal spænder fra 1:4 til 1:12. For at øge celleoverlevelsen tilsættes 10 μM Rho-associeret proteinkinase (ROCK) hæmmer (Y27632) efter hver opdeling.
- Kultur humane iPSC'er under feederfrie forhold i iPSC-medium (se materialetabellen) på coatede 6-brøndsplader og opbevar dem i en luftfugtet vævskulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Dissociate iPSCs (80% sammenløb)-Dag 0.
- Forbered kortikal differentiering Mellem I (CDMI) (tabel 1). Præwarm CDMI medium ved stuetemperatur (22-25 °C), før du føjer det til cellerne.
- Vask brøndene, der indeholder iPSC'erne, med fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne døde celler og snavs.
- Der tilsættes 500 μL præwarmed reagens A (materialetabel) til hver brønd og inkuberes i 5 min ved 37 °C. Kontroller under mikroskopet for at sikre cellefordeling.
- Tilsæt 1 mL iPSC medium til at fortynde reagens A for at neutralisere sin aktivitet.
- Brug en 1000 μL pipette til at adskille cellerne ved pipetter op og ned og overføre celleaffjedringen til et 15 mL centrifugerør.
- Centrifugere iPSC'erne forsigtigt ved 125 x g i 5 min ved stuetemperatur (22-25 °C).
- Sy forsigtigt supernatanten for at undgå at forstyrre cellepillen.
- Brug pelleten igen med 1 mL CDMI for at opnå en enkeltcellet suspension og tælle cellenummeret.
- Såningsmediet forberedes med 9.000 iPSC'er pr. 100 μL i CDMI suppleret med 20 μM ROCK-hæmmer, 3 μM WNT-cateninhæmmer (IWR1) og 5 μM SB431542.
- Tilsæt 100 μL såning medium pr godt til en 96-godt v-bund plade.
- Opbevar pladen i en befugtet vævskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Neurosfære generation
- På dag 1 skal du bemærke, at runde celleaggregater (neurosfærer) med definerede glatte kanter dannes. Bemærk de døde celler omkring aggregaterne. Fortsæt til kulturen i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- På dag 3, agitere pladen ved at trykke på siderne tre gange for at løsne døde celler.
- Der tilsættes 100 μL CDMI suppleret med 20 μM ROCK-hæmmer, 3 μM IWR1 og 5 μM SB431542 til hver brønd.
- Pladen returneres til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 6 fjernes 80 μL af supernatantmediet forsigtigt fra hver brønd. Undgå at røre bunden af brønden.
- Der tilsættes 100 μL CDMI suppleret med 3 μM IWR1 og 5 μM SB431542 til hver brønd. Pladen returneres til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Gentag trin 5 og 6 hver 3. dag indtil dag 18.
- Overførsel af neurosfærer
- På dag 18 skal du forberede kortikal differentiering Medium II (CDMII) (tabel 1) og tilføje 10 mL til en 100 mm ultralav cellekulturplade med ultralav fastgørelsescelle.
- Brug en 200 μL pipette med spidsen afskåret for at overføre de runde neurosfærer fra 96-brøndspladen til den 100 mm ultralave fastgørelsescellekulturplade.
BEMÆRK: Vær forsigtig med at undgå at beskadige neurosfærerne ved at sikre, at åbningen af spidsen er bred nok, og at aggregaterne ikke suges for hurtigt. - Fjern 5 mL medium fra pladen, der indeholder neurospheres og tilsæt 5 mL frisk CDMII.
BEMÆRK: Denne procedure hjælper med at reducere mængden af CDMI-medium, der kan have overført fra overførslen af neurosfærer. - Placer pladen på en orbital shaker ved 70 omdr./min inde i en befugtet vævskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Undersøg visuelt neurosfærerne den næste dag. Forøg hastigheden af orbital shaker, hvis neurosfærerne er klumpet sammen eller fastgjort til bunden af pladen. - Hver 3. dag skal du forsigtigt aspirere det supernatante medium og erstatte det med frisk CDMII. Lad en lille mængde af mediet for at forhindre neurospheres i at tørre ud.
- På dag 35 forberede kortikale differentiering Medium III (CDMIII) (tabel 1).
BEMÆRK: Matrixkomponenten skal opløses i kold CDMIII. - Aspirere mediet fra pladen og tilsæt 10 mL kold CDMIII.
BEMÆRK: Det er mere effektivt at bruge koldt medium, så matrixkomponenten kan belægge organoiderne uden at danne klumper. - Når du har skiftet medium, skal pladen placeres tilbage på en orbital shaker ved 70 omdr./min. inde i en befugtet vævskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift mediet hver 3-5 dage afhængigt af vækstraten, som angivet af mediets farve.
- På dag 70 forberede kortikale differentiering Medium IV (CDMIV) (tabel 1). Brug CDMIV medium, indtil den ønskede alder af organoider er nået. I denne periode skal pladen opbevares på en orbital shaker, der er indstillet til 70 omdr./min. inde i en befugtet vævskulturinkubator (37 °C og 5% CO2).
- Skift medium hver 3-5 dage, afhængigt af vækstraten.
2. Immunstaining af hjerneorganoider
- Vævspræparat
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning, og læg den under en sikkerhedshætte.
BEMÆRK: Brug personligt sikkerhedsudstyr ved håndtering af PFA. - Saml hjerneorganoider og overfør dem forsigtigt med en stumpspidset 3 mL plast Pasteur pipette til en 6-brønds plade fyldt med PFA.
BEMÆRK: Brug organoider, der er ældre end 40 dage, til at tillade visualisering af strukturer med højere cellulær kompleksitet. - Hold organoiderne i PFA-opløsningen i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt PFA med en 3 mL plast Pasteur pipette, og vask de faste organoider tre gange ved hjælp af PBS.
- Opbevar de faste organoider ved 4 °C i PBS, indtil de anvendes yderligere.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning, og læg den under en sikkerhedshætte.
- Forberedelse af hjerneorganoide skiver
- Forbered en 3% agaropløsning og varm langsomt, indtil flydende.
- Placer formen (den afskårne ende af en 10 mL sprøjte) på et stykke absorberende filterpapir (glat side op). Læg en dråbe agar på den.
- Tag hurtigt en enkelt organoid ud af 6-brøndspladen med en spatel og fjern overdreven PBS med filterpapir.
BEMÆRK: Pas på ikke at røre organoiden direkte med filterpapir. - Placer organoiden på agardråben.
- Gentag denne procedure med op til tre organoider.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt for at undgå størkning af agaren i løbet af dette trin. - Genopfyld formen med agar, indtil alle organoider er fuldt dækket.
- Vent, indtil agaren begynder at størkne, og overfør derefter forsigtigt hele formen, der indeholder organoiderne, herunder det absorberende filterpapir, på et køleelement.
BEMÆRK: Hvis et køleelement ikke er tilgængeligt, skal organoiderne opbevares i et par minutter i køleskab ved 4 °C. - I mellemtiden skal du forberede skæreproceduren: Placer et barberblad (renset med acetone og vasket med dobbeltdestilleret vand) i indehaveren af vibratomen, monter på badet og fyld det med PBS.
- Fjern formen fra (størknet) agar og bruge en skalpel til at trimme den til at danne en terning.
- Fastgør agarkuben, der indeholder organoiderne, på vibratomens bæreplade med klæbegel (se materialetabellen), og læg den i badet, der indeholder PBS.
- Vibratomen justeres (se materialetabellen) for at skære skiver med en tykkelse på 150 μm.
BEMÆRK: Vibratom indstillinger (korrekt vinkel, amplitud, frekvens, og hastighed af bladet) kan svare til dem, der anvendes til udskæring fast hjernevæv stammer fra tidlige postnatal dyr. De ideelle indstillinger afhænger dog stærkt af typen af vibratomen og skal bestemmes i et første skridt for at forhindre forvrængning eller endda rippe af vævet under skæring. - Start skæreproceduren. Brug en glaspipette eller en spatel til forsigtigt at overføre hver friskskåret skive til en 24-brønds plade fyldt med PBS.
- Pladen, der indeholder skiver, opbevares ved 4 °C (i op til et par dage), indtil den er yderligere behandlet.
- Overfør skiverne ud af pladen med en glaspipette eller en spatel på mikroskop dias. Brug mindst 2 udsnit pr. dias.
- Fjern forsigtigt agaren og overskydende PBS med en sprøjte.
- Lad skiverne tørre, indtil de klæber til diasene.
BEMÆRK: Mens mikroskopslids kan opbevares i plastkamre fyldt med PBS ved 4 °C, skal de farves så hurtigt som muligt efter udskæringsproceduren.
- Immunohistokemisk farvning
- Forbered blokeringsløsningen (tabel 1).
- Brug en PAP-pen til at tegne en hydrofob kant rundt om udsnitdene på diaset for at hjælpe med at holde alle løsningerne på diasene.
- Tilsæt forsigtigt blokeringsopløsningen på diaset, og inkuber i 1 time ved stuetemperatur (22-25 °C). For at undgå at ødelægge vævet skal du ikke tilføje opløsningen direkte oven på skiverne.
- Indsugning af blokeringsopløsningen og påfør det ønskede primære antistof fortyndet i blokeringsopløsningen.
- Inkuberes diaset natten over i et befugtet kammer ved 4 °C.
- Skyl diaset tre gange med 1x PBS i 10 min hver.
- Inkuber skiverne med det specifikke sekundære antistof fortyndet i blokeringsopløsningen og udfør Hoechst farvning (1:2,500) i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Husk at udføre negative kontroller for at bekræfte, at der ikke er nogen ikke-specifik binding eller auto-fluorescens. - Skyl tre gange med 1x PBS i 10 min hver i mørke.
- Tilføj en dråbe montering medium til skiven, placere en coverlip på kanten af dråben, og langsomt lægge coverlip ned mod skiven for at undgå luftbobler.
- Lad rutsjebanen hvile natten over ved stuetemperatur. Påfør neglelak på kanten af dækslet for yderligere at forsegle diaset. Til langtidsopbevaring opbevares ved 4 °C.
- Dokumentation af farvning
- Hvis du vil scanne store billeder til syning, skal du bruge et motoriseret opretstående mikroskop med brede felter, der er udstyret med (se materialetabellen for detaljer) et mål af høj kvalitet; DAPI-filtersæt (f.eks. excitation (EX): 340-380 nm, dichroic spejl (DM): 400 nm, barrierefilter (BA): 435-485 nm); fluorescein isothiocynatfiltersæt (f.eks. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm) Alexa594-filtersæt (f.eks. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); digitalkamera; højtydende anskaffelsessoftware, der giver mulighed for automatiserede sting og stakoperationer.
- Til billedhåndtering skal du bruge et billedbehandlingsprogram, der kan generere 8-bit tif-filer, beskære sting, justere kontrast og lysstyrke, flette kanalerne (f.eks. blå, grøn og rød) og tilføje skalalinjer.
- For at scanne detaljer skal du bruge et motoriseret konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med et mål af høj kvalitet, en UV-laser (EX: 408 nm), en Argon laser (EX: 488 nm), en Helium-Neon laser (EX: 543), billedbehandlingssoftware til et konfokalt mikroskop.
- Til billedhåndtering af detaljer skal du bruge et billedbehandlingsprogram, der kan generere maksimale intensitetsfremskrivninger af konfokale z-stakke (f.eks. optiske sektioner på 0,6 μm hver), generere 8-bit tif-filer, justere kontrast og lysstyrke, flette kanalerne (f.eks. blå, grøn og rød), tilføje skalalinjer.
- Brug en grafisk editor til at arrangere tallene.
3. Bioenergetisk profilering af hjerneorganoider
- Fremstilling af organoider til bioenergetisk profilering
- Forbered papain- og DNase-opløsningen efter producentens protokol.
- Overfør 3-5 organoider til en 6-brønds plade. Vask dem to gange med præwarmed PBS.
- Tilsæt 2 mL forforvarmet aktiveret papainopløsning, der indeholder DNase. Skær organoiderne i små stykker ved hjælp af en klinge.
- Placer pladen på en orbital shaker, der er indstillet ved 27 omdr./min.
BEMÆRK: Tidspunktet for inkubation afhænger af organoidstadiet. Tidlige organoider kan bruges som de er. For organoider, der er ældre end 3 måneder, anbefales det at skære organoiderne i 2-3 stykker før dissociation og inkubere stykkerne ved en gyngehastighed, der er indstillet til 27 rpm i 15-20 min ved 37 °C. Denne procedure kan hjælpe med at fjerne nekrotisk væv, der kan være til stede i de senere fase organoider. - Opsamles det fordøjede væv i et 15 mL rør og tilsæt 5 mL organoid kulturmedie CDMIV (tabel 1).
- Triturere vævet med en 10 mL plast pipette ved pipetter op og ned 10-15 gange. Lad det ubundne væv slå sig ned til bunden af røret.
- Overfør forsigtigt celleaffjedringen til et 15 ML-rør, så du undgår stykker af usammenhængende væv. Opløsningen filtreres gennem en 40 μm cellesnive (f.eks. polystyrenrør med cellestive hætter).
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Vurder cellenummeret og kvaliteten ved hjælp af trypan blå.
- Plade det ønskede antal (~ 20.000 / brønd) af celler på belagt 96-brønd mikroplader. Skift mediet 6-8 timer efter plating til Neuronal Medium (tabel 1).
- Inkuberes den overtrukne 96-brønd mikroplade i en CO2-inkubator (37 °C, 5% CO2) i 4 dage.
- Bioenergetisk profilering
- På dag 3 efter at have formonteret de dissocierede celler tilsættes 200 μL kalibreringsopløsning i hver brønd i den nederste del af den 96-brønds mikroplade, og den øverste grønne sensorpatron placeres på den hydrerede mikroplade.
BEMÆRK: Placer sensorpatronen oven på mikropladen i den korrekte retning, og sørg for, at calibrantopløsningen dækker alle sensorerne. - Inkuberes den hydrerede 96-brønds mikroplade i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C natten over.
- Tænd analysatoren, så instrumentet kan stabilisere sig ved 37 °C natten over.
- På dag 4 efter forsplning inspiceres den disassocierede organoidkultur på den 96-brønd mikroplade under mikroskopet for at sikre, at cellerne fremstår som et sammenflydende monolag.
- Forbered assay medium (tabel 1).
- Fjern Neuronal Medium fra alle brønde med en pipette uden at røre bunden af brønden for at forhindre celleskader. Alternativt kan du forsigtigt vende hele pladen og derefter tørre den på rent papir. Arbejd hurtigt for at undgå celledød.
- Vask cellerne to gange med præwarmed 200 μL assay medium. Tilsættes Assay Medium til et endeligt volumen på 180 μL pr. brønd. Inkuberes 96-brønd mikropladen i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C i 1 time.
- Tilbered 10 μM opløsninger af mitokondriehæmmere i analysemediet. Bemærk, at den endelige koncentration efter injektionen er 1 μM.
- Læg sensorpatronen, der er placeret i den hydrerede mikroplade, med 10x opløsninger af mitokondriehæmmerne.
- Der tilsættes 18 μL mitokondriehæmmer 1 i port A.
- Der tilsættes 19,8 μL mitokondriehæmmer 2 i port B.
- Der tilsættes 21,6 μL mitokondriehæmmer 2 i port C.
- Der tilsættes 23,4 μL mitokondriehæmmer 3 i port D.
- Anbring den lastede patron i den hydrerede mikroplade i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C indtil analysens start.
- Konfigurer en kørende protokol i instrumentets software (tabel 2).
- Tryk på START. Tag den indlæste patron fra ikke-CO2-inkubatoren, og sæt den i analysatoren til kalibrering.
BEMÆRK: Sørg for, at pladen er sat i den rigtige retning og uden låget. - Når kalibreringstrinnet slutter, skal kalibreringspladen fjernes. Tag 96-brønd mikropladen fra ikke-CO2-inkubatoren og læg den i analysatoren. Klik på FORTSÆT for at starte målingerne.
- Når kørslen er færdig, skal du fjerne mikropladen med 96 brønde celler og samle mediet fra alle brøndene uden at forstyrre cellerne.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares ved -20 °C og anvendes senere til måling af den mængde laktat, som cellerne i mediet frigiver ved hjælp af et passende laktatanalysesæt. - Vask cellerne med 200 μL på 1x PBS i hver brønd.
- Når PBS er fjernet, fryses pladen ved -20 °C.
BEMÆRK: Den frosne plade kan bruges til at kvantificere celler, proteiner eller DNA i hver brønd af mikropladen. Denne kvantificering vil være nødvendig for at normalisere de opnåede bioenergetic satser. Følg producentens anvisninger for celle-, protein- eller DNA-kvantificeringsanalyser.
- På dag 3 efter at have formonteret de dissocierede celler tilsættes 200 μL kalibreringsopløsning i hver brønd i den nederste del af den 96-brønds mikroplade, og den øverste grønne sensorpatron placeres på den hydrerede mikroplade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet her, letter den robuste generering af runde organoider (figur 1A). De genererede organoider indeholder modne neuroner, der kan visualiseres ved hjælp af proteinmarkører, der er specifikke for axoner (SMI312) og dendritter (mikrotubule-associeret protein 2 (MAP2)) (Figur 1B). Modne organoider indeholder ikke kun neuronale celler (MAP2-positive), men også gliaceller (f.eks. positive for astrocytmarkøren S100 calciumbindende protein B (S100ß)) (Figur 1B).
Ved at analysere skiver hjerneorganoider ved hjælp af konfokal mikroskopi er det muligt at identificere og overvåge den detaljerede fordeling og organisering af forskellige celletyper og cellulære strukturer. Dette kunne give ny indsigt i, hvordan mitokondrie sygdomme kan påvirke udviklingen af nervesystemet. For eksempel er det muligt at overvåge neuronale axoner (SMI312-positive) og dendritter (MAP2-positive) (figur 2A) eller den gensidige forekomst af neuronale celler (MAP2-positive) og gliaceller (S100ß-positive) (Figur 2A). Confocal billeder kan også bidrage til at undersøge mere detaljeret fordelingen og organiseringen af neurale forfædre ((sex bestemmelse region Y) boks-2 (SOX2)-positiv) med hensyn til neuroner (beta-III tubulin (TUJ1)-positiv) (Figur 2B). Endelig kan hjerneorganoider farves til mitokondrier-specifikke markører (såsom det ydre mitokondriemembranprotein, translocase af ydre membran 20 kDa subunit (TOM20)) (Figur 2C).
Den beskrevne protokol gør det muligt for forskere at udføre bioenergetisk profilering af hjerneorganoider. Ved hjælp af denne procedure er det muligt at måle både mitokondriemetabolisme ved hjælp af iltforbrugshastigheden (OCR) (figur 2D) og glykolytisk metabolisme ved hjælp af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) (Figur 2E). Bioenergetisk profilering gør det muligt at overvåge, hvordan celler kan ændre deres OCR- og ECAR-profiler som reaktion på en sekventiel administration af mitokondriehæmmere.
For det første kan ATP synthasehæmmeren, oligomycin, påføres. Oligomycin forårsager et fald i OCR-profilen (Figur 2D), og identificerer derfor ocr, der er nødvendig for ATP-produktion. Ved oligomycinbehandling kan der også være en kompenserende stigning i ECAR (figur 2E), hvilket tyder på, at cellerne kan opregulere glykolyse for at forhindre den metaboliske stress forårsaget af reduktionen i mitokondriemetabolismen. Den efterfølgende dobbelte anvendelse af protonionophore, carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), forårsager tab af mitokondriemembranpotentialet. Da iltmolekylerne nu frit kan bevæge sig, medfører dette en hurtig stigning i OCR (Figur 2D).
Disse ændringer i OCR-profilen identificerer cellernes maksimale respirationskapacitet. Den endelige administration af rotenon plus antimycin A forårsager en blok af elektrontransporten og derfor et stejlt fald i OCR (Figur 2D). ECAR kan vise udsving efter behandling med FCCP og rotenon plus antimycin A (figur 2E), afhængigt af cellernes resterende glykolytiske kapacitet. OCR- og ECAR-profilerne kan ændres dramatisk i hjerneorganoider, der stammer fra mitokondriepatienter.
Figur 1: Generering af hjerneorganoider fra humane iPSC'er. (A) Skematisk repræsentation af den protokol, der anvendes til at producere hjerneorganoider med tilsvarende transmissionsbilleder. Dag 0 svarer til dissociation af iPSCs og såning i en 96-brønd plade med V-bund ved hjælp af CDMI suppleret med en ROCK-hæmmer, en WNT-hæmmer og SB431542. På dag 18 overføres neurosfærer fra 96-brøndspladerne til 100 mm cellekulturretter med CDMII suppleret med N2. Fra dette tidspunkt og fremefter er kulturerne placeret på en orbital shaker. På dag 35 skiftes mediet fra CDMII til CDMIII, som også indeholder en opløst matrixkomponent (tabel 1). Fra dag 70 og frem skiftes CDMIII til CDMIV suppleret med B27. En repræsentativ neurosfære billede blev taget på dag 12 ved hjælp af et mikroskop kamera med 10x forstørrelse. En tidlig organoid billede blev taget på dag 22 ved hjælp af et mikroskop kamera på 4x forstørrelse. En moden organoid billede blev taget på dag 40 ved hjælp af et mikroskop kamera med 4x forstørrelse. (B) Den overordnede struktur og cellulære organisation af hjerneorganoider kan visualiseres ved hjælp af bredspektret mikroskopi. Repræsentative syede wide-field billeder er vist at visualisere forholdet mellem dendritter (MAP2-positive) og axoner (SMI312-positive), og mellem neuronale celler (MAP2-positive) og formodede astrocytter (S100ß-positive). Cellerne var kontraplettede med Hoechst for at afsløre kernerne. Alle billeder blev taget ved hjælp af 78 dage gamle hjerneorganoider. Den højre kolonne viser overlejringen af tre kanaler (fletning). Skalastænger = 500 μm. Forkortelser: iPSC = induceret pluripotente stamceller; CDM = Kortikal differentiering Medium; ROCK = Rho kinase; MAP2 = mikrotubule-associeret protein 2; S100ß= S100 calciumbindende protein B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Visualisering og bioenergetisk profilering af hjerneorganoider til mitokondriesygdom modellering. Den detaljerede organisation og arkitektur af organoider kan analyseres ved hjælp af konfokal mikroskopi. Alle billeder blev taget ved hjælp af 78 dage gamle hjerneorganoider og tæller farves med Hoechst at afsløre kernerne. Den højre kolonne viser overlejringen af tre kanaler (fletning). Skalastænger = 50 μm. (A) Repræsentative fremskrivninger med udvidet fokus (44-48 optiske planer, 0,6 μm hver), der omhandler samspillet mellem dendritter (MAP2-positive, pilespidser) og axoner (SMI312-positive pile) og mellem neuronale celler (MAP2-positive, pilespidser) og formodede astrocytter (S100ß-positive pile). (B) Repræsentative fremskrivninger med udvidet fokus (14-31 optiske planer, 0,6 μm hver), der viser fordelingen af neuroner (TUJ1-positive pilespidser) med hensyn til neurale forfædre (SOX2-positive, pile). (C) Repræsentative fremskrivninger med udvidet fokus (20 optiske planer, 0,6 μm hver), der viser fordelingen inden for neuroner (TUJ1-positive pilespidser) af mitokondrier (visualiseret ved hjælp af antistoffer mod det ydre mitokondriemembranprotein TOM20, pile). (D) Mitokondrie respiration af hjernen organoider kan overvåges baseret på profilen af OCR efter sekventiel administration af forskellige mitokondrie hæmmere (se tekst for detaljer). (E) Glykolytisk aktivitet af hjerneorganoider kan overvåges baseret på ECAR ved sekventiel administration af mitokondriehæmmere (se teksten for detaljer). Til bioenergetisk profilering blev ca. 10-15 hjerneorganoider adskilt for at få nok celler til at replating på den 96-brønd mikroplade. Søjlerne angiver SPM'erne baseret på de resultater, der er opnået i to uafhængige eksperimenter. Forkortelser: MAP2 = mikrotubule-associeret protein 2; S100ß = S100 calciumbindende protein B; TUJ1 = beta-III tubulin; SOX2 = (kønsbestemmende region Y) boks-2; TOM20 = translocase af ydre membran 20 kDa underenhed; OCR = iltforbrug; ECAR = ekstracellulær forsuringshastighed; Oligom. = oligomycin; FCCP = carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; R = rotenon; AntA = Antimycin A; SEMs = standardfejl på midler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mediesammensætning | |||
| CDMI (dag 0-18) | Sidste konk. | ||
| Glasgow-MEM | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Knockout serum udskiftning (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Natrium pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| 2-mercaptethanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL og 100 μg/mL |
| CDMII (dag 18-35) | Sidste konk. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillæg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemisk defineret lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL og 100 μg/mL |
| CDMIII (Dag 35-70) | Sidste konk. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillæg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemisk defineret lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL og 100 μg/mL |
| Føtalt kvægserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/mL |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV(dag 70+) | Sidste konk. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillæg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemisk defineret lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL og 100 μg/mL |
| Føtalt kvægserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/mL |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| B-27 supplement med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Neuronalt medium | Sidste konk. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | [1x] |
| B-27 tilskud med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| L-Ascorbinsyre | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (dibutyrylcyklisk adenosin monophosphat) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (hjerne-afledt neutrotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/mL] |
| GDNF (glialcellelinje-afledt neurotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/mL] |
| Human TGF-β3 (transformerende vækstfaktor-beta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/mL] |
| Analyse mellem | Sidste konk. | ||
| Søhest XF DMEM medium | Søhest Bioscience | 103680-100 | 500 mL |
| Natrium pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| L-Glutamin | Lonza | BEBP17-605E | 2 mM |
| Glukose | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 mM |
| Blokeringsløsning | Sidste konk. | ||
| PBS-Tween | [1:1] 0,1% Mellem | ||
| Æsel Serum | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | 1% |
Tabel 1: Oplysninger om medier og opløsninger, der anvendes til organoidgenerering.
| Initialisering | Oprindelig plan (X3) | Oligomycin injektion (X3) | FCCP-injektion (X3) | FCCP-injektion (X3) | Anti A + Rot Injektion (X3) |
| Kalibrere | Blande | Blande | Blande | Blande | Blande |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Ekvilibrere (12:00) | Vent | Vent | Vent | Vent | Vent |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Mål (03:00) | Mål (03:00) | Mål (03:00) | Måle | Mål (03:00) | |
| (03:00) |
Tabel 2: Protokolopsætning for bioenergetisk profilering. Beskrivelse af trinene og deres længde på få minutter ved hjælp af Seahorse Wave Desktop-softwaren. Forkortelser: FCCP = carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; Rot = rotenon; Anti A = Antimycin A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver reproducerbar generation af humane iPSC-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse til mitokondrie sygdom modellering. Den protokol, der er beskrevet her, ændres på basis af et tidligere udgivet værk20. En stor fordel ved den nuværende protokol er, at det ikke kræver manuel indlejring af hvert organoid i en stilladsmatrix. Faktisk opløses matrixopløsningen simpelthen i cellekulturmediet. Desuden er der ingen grund til at ansætte dyre bioreaktorer, da organoider kan dyrkes i standardvævskultur 6-brøndplader placeret på en orbital shaker inde i inkubatoren. Denne procedure muliggør også parallel dyrkning af flere plader, der indeholder forskellige organoider, der stammer fra forskellige individuelle linjer, hvilket øger eksperimenternes gennemløb og gør det muligt at overvåge potentielle forskelle, der opstår i vækstprofilerne for forskellige organoider. Vi testede denne protokol ved hjælp af forskellige iPSCs stammer fra sunde kontroller og personer ramt af mitokondrie sygdomme, med ensartede resultater.
For mitokondrie sygdom modellering, er det vigtigt at bruge forskellige markører til at visualisere morfologi og organisering af mitokondrie netværk. Denne procedure gør det muligt at undersøge, om mitokondrienummer, morfologi eller distribution kan ændres i hjerneorganoider, der stammer fra patienter med mitokondriesygdomme. Tilstedeværelsen og organiseringen af neurale forfædre i hjernen organoider kunne være af afgørende betydning for modellering mitokondrie lidelser. Vi opdagede for nylig, at mutationer forårsager mitokondriesygdom, Leigh syndrom, forstyrre cellulære arkitektur og distribution af neurale stamfader celler i patient-afledte hjerne organoider18.
Til udførelse af bioenergetisk profilering har vi tilpasset en metode, der tidligere blev beskrevet til vurdering af bioenergetik af pluripotente stamceller21. En nylig protokol beskrevet, hvordan man udfører bioenergetic profilering af organoider stammer fra musen tyndtarmen, menneskelige kolon, og kolorektal tumorer22. Men disse organoider er ret små sammenlignet med hjerneorganoider, og derfor er en anden protokol, som den, der er rapporteret her, nødvendig for hjerneorganoider. Vi har for nylig ansat denne protokol til vurdering af den bioenergetiske profil af menneskelige hjerneorganoider, der bærer mutationer i det surfeit locus protein 1-gen (SURF1), der forårsager den alvorlige mitokondriesygdom, Leigh syndrom18. Vi fandt, at OCR profil er særligt påvirket i Leigh syndrom organoider, som det fremgår af et betydeligt fald i den basale OCR niveau, ATP produktion sats, og den maksimale respiration rate18.
Afslutningsvis præsenterer vi her en detaljeret protokol for den robuste generation af menneskelige hjerneorganoider og beskriver, hvordan man udfører eksperimenter, der ville være vigtige for undersøgelsen af de sygdomsmekanismer, der ligger til grund for mitokondriesygdomme. Menneskelige hjerneorganoider kan også være af afgørende betydning for at belyse den mitokondriediversitet i den menneskelige hjerne og dens rolle i menneskers sundhed og sygdomme23. Det er vigtigt at præcisere, at hjerneorganoider genereret med aktuelt tilgængelige protokoller, herunder den, der er beskrevet her, stadig bærer begrænsninger. Disse omfatter for eksempel manglen på vascularisering og fraværet af mikrogliapopulation24. Disse aspekter skal tages i betragtning for at fortolke resultaterne korrekt.
For eksempel kan manglen på vaskulatur og mikroglia begrænse kompensationsmekanismer, der kan være på plads in vivo. Patient-afledte hjerneorganoider kan således udvise defekter, der er stærkere end dem, der observeres hos patienter17,18. På trods af en generel reproducerbarhed af denne protokol20 kan der desuden observeres line-to-line heterogenitet. Med henblik herpå er det ved udførelse af sygdomsmodelleringsundersøgelser altid vigtigt systematisk at kvantificere ensartetheden af kontrol- og patientorganoider ved at vurdere morfologimønstrene (størrelse, lag) og fordelingen af molekylære markører på tværs af forskellige organoider.
Endelig er det ikke muligt at generere hjerneorganoider fra en enkelt iPSC, hvilket begrænser muligheden for storstilet genetisk screening med CRISPR/Cas9. I betragtning af forskningstempoet er det sandsynligt, at nogle af de nuværende begrænsninger i den protokol, der er beskrevet her, snart vil blive overvundet. Optimerede protokoller bliver tilgængelige. Disse 3D-modeller af mitokondriesygdomme vil forhåbentlig muliggøre en eventuel opdagelse af implementerbare behandlinger for mitokondriesygdomme, som er skadelige, og for uhelbredelige sygdomme med meget uopfyldte medicinske behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle eller ikke-finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Miriam Bünning for teknisk support. Vi anerkender støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 til A.P.), Spark og Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leighskadrom International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Düsseldorf (Forschungs UKD til A.P.) og det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) (e: Bio unge investigator tilskud AZ 031L0211 til A.P.). Arbejdet i laboratoriet i C.R.R. blev støttet af DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A.
- Gorman, G. S., et al.
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J.
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
