Summary
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga inducerade pluripotenta stamcell-härledda hjärnan organoider och deras användning i modellering mitokondriell sjukdomar.
Abstract
Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen och är för närvarande obotliga. Dessa sjukdomar orsakar neurodevelopmental defekter vars underliggande mekanismer återstår att klargöra. En stor vägspärr är bristen på effektiva modeller recapitulating den tidiga debuten neuronal nedskrivningar sett hos patienterna. Framsteg inom tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av tredimensionella (3D) hjärnorganoider som kan användas för att undersöka effekterna av sjukdomar på nervsystemets utveckling och organisation. Forskare, inklusive dessa författare, har nyligen introducerat mänskliga hjärnorganoider för att modellera mitokondriella störningar. Detta dokument rapporterar ett detaljerat protokoll för robust generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning i mitokondriell bioenergetic profilering och imaging analyser. Dessa experiment kommer att tillåta användning av hjärnan organoider att undersöka metabola och utvecklingsmässiga dysfunktioner och kan ge avgörande information för att dissekera neuronal patologi av mitokondriella sjukdomar.
Introduction
Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen1. De orsakas av genetiska mutationer som stör olika mitokondriella processer, inklusive oxidativ fosforylering (OXPHOS)2, andningskedjemontering, mitokondriell dynamik och mitokondriell DNA-transkription eller replikering3. Vävnader med energibehov påverkas särskilt av mitokondriell dysfunktion4. Följaktligen utvecklar patienter med mitokondriella sjukdomar vanligtvis tidiga neurologiska manifestationer.
Det finns för närvarande inga behandlingar tillgängliga för barn som drabbats av mitokondriella sjukdomar5. Ett stort hinder för läkemedelsutveckling av mitokondriella sjukdomar är bristen på effektiva modeller som rekapitulerar den mänskliga sjukdomskursen6. Flera av de för närvarande studerade djurmodellerna uppvisar inte de neurologiska defekter som finns hos patienterna7. Därför är mekanismerna bakom den neuronala patologin av mitokondriella sjukdomar fortfarande inte helt förstådda.
Nyligen genomförda studier genererade iPSCs från patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar och använde dessa celler för att erhålla patientspecifika neuronala celler. Till exempel har genetiska defekter associerade med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visat sig orsaka avvikelser i cellulära bioenergetik8,9, proteinsyntes10 och kalciumhomeostas9,11. Dessa rapporter gav viktiga mekanistiska ledtrådar om neuronal nedskrivningar förekommer i mitokondriella sjukdomar, banar väg för läkemedelsupptäckt för dessa obotliga sjukdomar12.
Tvådimensionella (2D) kulturer möjliggör dock inte undersökningen av den arkitektoniska komplexiteten och den regionala organisationen av 3D-organ13. För detta ändamål kan användningen av 3D-hjärnorganoider som härrör från patientspecifika iPSCs14 göra det möjligt för forskare att få ytterligare viktig information och därmed bidra till att dissekera hur mitokondriella sjukdomar påverkar nervsystemets utveckling och funktion15. Studier som använder iPSC-härledda hjärnorganoider för att undersöka mitokondriella sjukdomar börjar avslöja de neurodevelopmentala komponenterna i mitokondriella sjukdomar.
Ryggmärg organoider bär mutationer som är associerade med mitokondriell sjukdom, mitokondriell encefalopati, mjölksyra acidos och stroke-liknande episoder syndrom (MELAS), visade defekt neurogenesis och fördröjd motor neuron differentiering16. Närorganoider härrör från patienter med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visade minskad storlek, defekter i neurala epitelial bud generation och förlust av när arkitektur17. Hjärnan organoider från Leigh syndrom patienter visade att sjukdomen defekter initiera på nivån av neurala stamceller, som inte kan förbinda sig till mitokondriell metabolism, orsakar avvikande neuronal förgrening och morfogenesi18. Således kan neurala stamceller representera ett cellulärt terapeutiskt mål för mitokondriella sjukdomar, och strategier som främjar deras mitokondriella funktion kan stödja nervsystemets funktionella utveckling.
Användningen av hjärnan organoider kan hjälpa till att avslöja neurodevelopmental komponenter av mitokondriella sjukdomar. Mitokondriella sjukdomar anses främst vara tidiga neurodegeneration5. Neurodevelopmental defekter finns dock också hos patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar, inklusive utvecklingsmässiga dröjsmål och kognitiv svikt19. Patientspecifika hjärnorganoider kan hjälpa till att ta itu med dessa aspekter och belysa hur mitokondriella sjukdomar kan påverka människans hjärnutveckling. Mitokondriell dysfunktion kan också spela en patogenetisk roll i andra vanligare neurologiska sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom4. Därför kan klargöra effekterna av mitokondriella defekter i neuroutveckling med hjälp av hjärnan organoider också vara avgörande för studien av dessa sjukdomar. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att generera reproducerbara hjärnan organoider som kan användas för att genomföra sjukdom modellering av mitokondriella sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ANVÄNDNING av mänskliga iPSCs kan kräva ett etiskt godkännande. iPSCs som användes i denna studie härleddes från friska kontrollpersoner efter lokalt etiskt godkännande (#2019-681). Alla cellodlingsförfaranden måste utföras under en steril cellodlingshuv, desinficera noggrant alla reagenser och förbrukningsvaror innan de överförs under huven. Mänskliga iPSCs används för differentiering bör ha ett passagenummer under 50 för att undvika potentiella genomiska avvikelser som kan uppstå på omfattande kultur. Cellernas pluripotenta tillstånd bör valideras före organoidgeneration, till exempel genom övervakning av uttrycket av pluripotensassocierade markörer som NANOG eller OCT4. Mykoplasma tester bör utföras varje vecka för att säkerställa mykoplasma-fria kulturer.
1. Generering av hjärnorganoider
- Kultur av mänskliga iPSCs
- Odla mänskliga iPSC under matarfria förhållanden i iPSC-medium (se materialtabellen) på belagda 6-brunnsplattor och förvara dem i en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
OBS: Överföring av matarceller kan hämma organoiddifferentiering. Passage cellerna minst en gång under matarfria förhållanden. - Passage iPSCs vid 80% sammanflöde med enzymfritt lösgöringsmedium i förhållanden från 1:4 till 1:12. För att öka cellens överlevnad, tillsätt 10 μM Rho-associerad proteinkinashämmare (ROCK) (Y27632) efter varje delning.
- Odla mänskliga iPSC under matarfria förhållanden i iPSC-medium (se materialtabellen) på belagda 6-brunnsplattor och förvara dem i en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- Dissociera iPSCs (80% confluency)-Dag 0.
- Förbered kortifferentieringsmedium I (CDMI) (tabell 1). Cdmi-medium före kriget vid rumstemperatur (22-25 °C) innan det tillsätts i cellerna.
- Tvätta brunnarna som innehåller iPSCs med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort döda celler och skräp.
- Tillsätt 500 μL förvarnat reagens A (Materialbord) till varje brunn och inkubera i 5 min vid 37 °C. Kontrollera under mikroskopet för att säkerställa cellavlossning.
- Tillsätt 1 ml iPSC-medium för att späda reagens A för att neutralisera dess aktivitet.
- Använd en 1000 μL-pipett för att separera cellerna genom att pipettera upp och ner och överföra cellfjädringen till ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera försiktigt iPSC:erna vid 125 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (22–25 °C).
- Aspirera försiktigt på supernatanten för att undvika att störa cellpelleten.
- Återanvänd pelleten med 1 ml CDMI för att erhålla en encellsupphängning och räkna cellnumret.
- Förbered såddmediet med 9 000 iPSC per 100 μL i CDMI kompletterat med 20 μM ROCK-hämmare, 3 μM WNT-cateninhämmare (IWR1) och 5 μM SB431542.
- Tillsätt 100 μL såddmedium per brunn till en 96-väl v-bottenplatta.
- Förvara plattan i en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- Neurosfärgeneration
- På dag 1, observera att runda cellaggregat (neurosfärer) med definierade släta gränser bildas. Notera de döda cellerna runt aggregaten. Fortsätt att odla i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2.
- På dag 3, agitera plattan genom att knacka på sidorna tre gånger för att lossa döda celler.
- Tillsätt 100 μL CDMI kompletterat med 20 μM ROCK-hämmare, 3 μM IWR1 och 5 μM SB431542 till varje brunn.
- Sätt tillbaka plattan till inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2.
- På dag 6, ta försiktigt bort 80 μL av det supernatantmediet från varje brunn. Undvik att vidröra botten av brunnen.
- Tillsätt 100 μL CDMI kompletterat med 3 μM IWR1 och 5 μM SB431542 till varje brunn. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2.
- Upprepa steg 5 och 6 var tredje dag fram till dag 18.
- Överföring av neurosfärer
- På dag 18 bereder du kortikal differentiering Medium II (CDMII) (tabell 1) och lägger till 10 ml till en 100 mm ultralåg fastsättningscellsodlingsplatta.
- Använd en 200 μL-pipett med spetsen avskuren för att överföra de runda neurosfärerna från 96-brunnsplattan till 100 mm ultralåg fastsättningscellsodlingsplatta.
OBS: Var försiktig för att undvika att skada neurosfärerna genom att se till att spetsens öppning är tillräckligt bred och att aggregaten inte aspireras för snabbt. - Ta bort 5 ml medium från plattan som innehåller neurosfärerna och tillsätt 5 ml färsk CDMII.
OBS: Denna procedur hjälper till att minska mängden CDMI-medium som kan ha överförts från överföringen av neurosfärer. - Placera plattan på en orbital shaker vid 70 rpm inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
OBS: Inspektera neurosfärerna visuellt nästa dag. Öka hastigheten på orbital shaker om neurosfärerna klumpas ihop eller fästs på botten av plattan. - Var tredje dag, aspirera försiktigt supernatantmediet och ersätt det med färsk CDMII. Lämna en liten mängd av mediet för att förhindra att neurosfärerna torkar ut.
- Förbered kortikal differentiering medium III (CDMIII) (tabell 1) på dag 35.
OBS: Matriskomponenten ska lösas upp i kalla CDMIII. - Aspirera mediet från plattan och tillsätt 10 ml kall CDMIII.
OBS: Det är effektivare att använda kallt medium så att matriskomponenten kan täcka organoiderna utan att bilda klumpar. - Efter att ha bytt medium, placera plattan tillbaka på en orbital shaker vid 70 rpm inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- Byt medium var 3-5 dagar beroende på tillväxttakten, vilket indikeras av mediets färg.
- På dag 70 bereder du kortikal differentiering medium IV (CDMIV) (tabell 1). Använd CDMIV-medium tills önskad ålder av organoider uppnås. Under denna period, håll plattan på en orbital shaker inställd på 70 rpm inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator (37 °C och 5% CO2).
- Byt medium var 3-5 dag, beroende på tillväxttakten.
2. Immunstaining av hjärnan organoider
- Vävnadsberedning
- Förbered 4% paraformaldehydlösning (PFA) och placera den under en säkerhetshuv.
OBS: Använd personlig säkerhetsutrustning vid hantering av PFA. - Samla hjärnorganoider och överför dem försiktigt med en trubbig 3 ml plast Pasteur pipetter till en 6-välplatta fylld med PFA.
OBS: Använd organoider äldre än 40 dagar för att tillåta visualisering av strukturer med högre cellulär komplexitet. - Förvara organoiderna i PFA-lösningen i 1 h i rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort PFA med en Pasteurpipeett i 3 ml plast och tvätta de fasta organoiderna tre gånger med PBS.
- Förvara de fasta organoiderna vid 4 °C i PBS tills vidare användning.
- Förbered 4% paraformaldehydlösning (PFA) och placera den under en säkerhetshuv.
- Beredning av hjärnan organoid skivor
- Förbered en 3% agarlösning och värm långsamt tills den kondenseras.
- Placera formen (den skurna änden av en 10 ml spruta) på en bit absorberande filterpapper (slät sida upp). Lägg en droppe agar på den.
- Ta snabbt en enda organoid ur 6-brunnsplattan med en spatel och ta bort överdriven PBS med filterpapper.
OBS: Var försiktig så att du inte rör organoiden direkt med filterpapper. - Placera organoiden på agardroppen.
- Upprepa denna procedur med upp till tre organoider.
OBS: Arbeta snabbt för att undvika stelning av agaren under detta steg. - Fyll på formen med agar tills alla organoider är helt täckta.
- Vänta tills agaren börjar stelna och överför sedan försiktigt hela formen som innehåller organoiderna, inklusive det absorberande filterpapperet, till ett kylelement.
OBS: Om ett kylelement inte är tillgängligt, förvara organoiderna i några minuter i kylskåp vid 4 °C. - Under tiden förbereder du för skivningsförfarandet: placera ett rakblad (rengörs med aceton och tvättas med dubbeldestillerat vatten) i vibratomens hållare, montera på badet och fyll det med PBS.
- Ta bort formen från (stelnad) agar och använd en skalpell för att trimma den för att bilda en kub.
- Fäst agarkuben som innehåller organoiderna på vibratomens bärarplatta med självhäftande gel (se materialtabellen) och placera den i badet som innehåller PBS.
- Justera vibratomen (se materialtabellen) för att skära skivor med en tjocklek av 150 μm.
OBS: Vibratominställningar (korrekt vinkel, amplitud, frekvens och klingans hastighet) kan likna dem som används för skivning av fast hjärnvävnad som härrör från tidiga postnatala djur. De ideala inställningarna beror dock starkt på typen av vibratom och måste bestämmas i ett första steg för att förhindra förvrängning eller till och med rippning av vävnaden under skärning. - Starta skärproceduren. Använd en glaspipetter eller en spatel för att försiktigt överföra varje nyskuren skiva till en 24-välplatta fylld med PBS.
- Förvara plattan som innehåller skivor vid 4 °C (i upp till några dagar) tills den bearbetas vidare.
- Överför skivorna ur plattan med en glaspipett eller en spatel till mikroskopglas. Använd minst 2 segment per bild.
- Ta försiktigt bort agar och överskott av PBS med en spruta.
- Låt skivorna torka tills de håller fast vid bilderna.
OBS: Även om mikroskopbilder kan förvaras i plastkammare fyllda med PBS vid 4 °C, bör de färgas så snart som möjligt efter skivningsproceduren.
- Immunohistokemisk färgning
- Förbered blockeringslösningen (tabell 1).
- Använd en PAP-penna för att rita en hydrofobisk kant runt segmenten på bilden för att hålla alla lösningar på bilderna.
- Tillsätt försiktigt blockeringslösningen på glidbanan och inkubera i 1 h vid rumstemperatur (22-25 °C). För att undvika att förstöra vävnaden, lägg inte till lösningen direkt ovanpå skivorna.
- Aspirera på blockeringslösningen och applicera önskad primär antikropp utspädd i blockeringslösningen.
- Inkubera glidningen över natten i en fuktad kammare vid 4 °C.
- Skölj bilden tre gånger med 1x PBS i 10 min vardera.
- Inkubera skivorna med den specifika sekundära antikroppen utspädd i blockeringslösningen och utför Hoechst-färgning (1:2 500) i 1 h vid rumstemperatur i mörker.
OBS: Kom ihåg att utföra negativa kontroller för att bekräfta att det inte finns någon icke-specifik bindning eller automatisk fluorescens. - Skölj tre gånger med 1x PBS i 10 min vardera i mörkret.
- Tillsätt en droppe monteringsmedium till skivan, placera ett täckglas på kanten av droppen och lägg långsamt täcket ner mot skivan för att undvika luftbubblor.
- Låt bilden vila över natten vid rumstemperatur. Applicera nagellack på täckslipets kant för att ytterligare försegla glidningen. För långtidsförvaring, förvara vid 4 °C.
- Dokumentation av färgning
- För att skanna stora bilder för sömnad, använd ett motoriserat upprätt bredfältsmikroskop utrustat med (se materialtabellen för detaljer) ett högkvalitativt mål; DAPI-filteruppsättning (t.ex. excitation (EX): 340-380 nm, dichroisk spegel (DM): 400 nm, barriärfilter (BA): 435-485 nm); fluorescein isotiocyanate filteruppsättning (t.ex. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 filteruppsättning (t.ex. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); Digitalkamera; högpresterande förvärvsprogram som möjliggör automatiserade stygn och stackoperationer.
- För bildhantering, använd ett bildbehandlingsprogram som kan generera 8-bitars tif-filer, beskära stygn, justera kontrast och ljusstyrka, slå samman kanalerna (t.ex. blå, grön och röd) och lägga till skalstänger.
- För att skanna detaljer, använd ett motoriserat konfokalt laserskanningsmikroskop utrustat med ett högkvalitativt mål, en UV-laser (EX: 408 nm), en Argon-laser (EX: 488 nm), en Helium-Neon-laser (EX: 543), bildprogramvara för ett konfokalt mikroskop.
- För bildhantering av detaljer, använd ett bildbehandlingsprogram som kan generera maximal intensitetsprojektioner av konfokala z-staplar (t.ex. optiska sektioner på 0,6 μm vardera), generera 8-bitars tif-filer, justera kontrast och ljusstyrka, slå samman kanalerna (t.ex. blå, grön och röd), lägga till skalstänger.
- Använd en grafisk redigerare för att ordna siffrorna.
3. Bioenergetisk profilering av hjärnan organoider
- Beredning av organoider för bioenergetisk profilering
- Förbered papain- och DNase-lösningen enligt tillverkarens protokoll.
- Överför 3-5 organoider till en 6-välplatta. Tvätta dem två gånger med förvarnad PBS.
- Tillsätt 2 ml förvarnad aktiverad papainlösning som innehåller DNase. Skär organoiderna i små bitar med hjälp av ett blad.
- Placera plattan på en orbital shaker inställd på 27 rpm inuti en cellodlingsinkubator (vid 37 °C, 5% CO2) och inkubera i 15-20 min.
OBS: Inkubationstiden beror på organoidstadiet. Organoider i tidigt stadium kan användas som de är. För organoider äldre än 3 månader rekommenderas att skära organoiderna i 2-3 stycken före dissociation och inkubera bitarna vid en gunghastighet inställd på 27 rpm i 15-20 min vid 37 °C. Denna procedur kan hjälpa till att ta bort nekrotisk vävnad som kan finnas i de senare organoiderna. - Samla de smälta vävnaderna i ett 15 ml-rör och tillsätt 5 ml organoidkulturmedium CDMIV (tabell 1).
- Triturera vävnaden med en 10 ml plastpipett genom att pipettera upp och ner 10-15 gånger. Låt den odissocierade vävnaden sätta sig ner till botten av röret.
- Överför försiktigt cellfjädringen till ett 15 ml-rör och undvik bitar av odissocierad vävnad. Filtrera lösningen genom en 40 μm cellsil (t.ex. polystyren rundbottna rör med cellsiltak).
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Utvärdera cellnumret och kvaliteten med trypan blå.
- Plätera önskat nummer (~ 20 000 / brunn) av celler på belagda 96-brunns mikroplattor. Byt medium 6-8 h efter plätering till Neuronal Medium (tabell 1).
- Inkubera den belagda 96-brunnsmikroplattan i en CO2-inkubator (37 °C, 5% CO2) i 4 dagar.
- Bioenergetisk profilering
- På dag 3 efter att ha replatat om de dissocierade cellerna, tillsätt 200 μL kalibreringslösning i varje brunn i den nedre delen av 96-brunnsmikroplattan och placera den övre gröna sensorpatronen på den hydratiserade mikroplattan.
OBS: Placera sensorpatronen ovanpå mikroplattan i rätt riktning och se till att kalibrerlösningen täcker alla sensorer. - Inkubera den hydratiserade 96-brunnsmikroplattan i en icke-CO2-inkubator vid 37 °C över natten.
- Slå på analysatorn så att instrumentet kan stabiliseras vid 37 °C över natten.
- På dag 4 efter replating, inspektera den disassocierade organoidkulturen på 96-brunnsmikroplattan under mikroskopet för att säkerställa att cellerna visas som ett sammanflöde monoskikt.
- Förbered analysmedium (tabell 1).
- Ta bort Neuronal Medium från alla brunnar med en pipett utan att röra botten av brunnen för att förhindra cellskador. Alternativt kan du försiktigt vända hela plattan och torka den sedan på rent papper. Arbeta snabbt för att undvika celldöd.
- Tvätta cellerna två gånger med förvarnad 200 μL analysmedium. Tillsätt Analysmedium till en slutlig volym på 180 μL per brunn. Inkubera 96-brunnsmikroplattan i en icke-CO2-inkubator vid 37 °C i 1 timme.
- Förbered 10 μM-lösningar av mitokondriella hämmare i analysmediet. Observera att den slutliga koncentrationen efter injektionen är 1 μM.
- Ladda sensorpatronen placerad i den hydratiserade mikroplattan med 10x lösningar av mitokondriella hämmare.
- Tillsätt 18 μL mitokondriell hämmare 1 i port A.
- Tillsätt 19,8 μL mitokondriell hämmare 2 i port B.
- Tillsätt 21,6 μL mitokondriell hämmare 2 i port C.
- Tillsätt 23,4 μL mitokondriell hämmare 3 i port D.
- Placera den laddade patronen i den hydratiserade mikroplattan i en icke-CO2-inkubator vid 37 °C tills analysen börjar.
- Ställ in ett löpande protokoll i instrumentets programvara (tabell 2).
- Tryck på START. Ta den laddade patronen från inkubatorn som inte är CO2 och placera den i analysatorn för kalibrering.
OBS: Se till att plattan är insatt i rätt riktning och utan lock. - När kalibreringssteget är slut, ta bort kalibreringsplattan. Ta 96-brunnsmikroplattan från icke-CO2-inkubatorn och placera den i analysatorn. Klicka på FORTSÄTT för att starta mätningarna.
- När körningen är klar, ta bort 96-brunnscellskulturmikroplattan från analysatorn och samla mediet från alla brunnar utan att störa cellerna.
OBS: Mediet kan lagras vid -20 °C och användas senare för att mäta mängden laktat som frigörs av cellerna i mediet med hjälp av ett lämpligt laktatanalyskit. - Tvätta cellerna med 200 μL 1x PBS i varje brunn.
- När du har tagit bort PBS, frys plattan vid -20 °C.
OBS: Den frusna plattan kan användas för att kvantifiera celler, proteiner eller DNA i varje brunn på mikroplattan. Denna kvantifiering kommer att behövas för att normalisera de erhållna bioenergetiska satserna. Följ tillverkarens anvisningar för cell-, protein- eller DNA-kvantifieringsanalyser.
- På dag 3 efter att ha replatat om de dissocierade cellerna, tillsätt 200 μL kalibreringslösning i varje brunn i den nedre delen av 96-brunnsmikroplattan och placera den övre gröna sensorpatronen på den hydratiserade mikroplattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här underlättar den robusta genereringen av runda organoider (figur 1A). De genererade organoiderna innehåller mogna nervceller som kan visualiseras med hjälp av proteinmarkörer som är specifika för axoner (SMI312) och dendriter (mikrotubuleassocierat protein 2 (MAP2)) (figur 1B). Mogna organoider innehåller inte bara neuronala celler (MAP2-positiva) utan även gliaceller (t.ex. positiva för astrocytmarkören S100 kalciumbindande protein B (S100ß)) (figur 1B).
Genom att analysera skivade hjärnorganoider med hjälp av konfokal mikroskopi är det möjligt att identifiera och övervaka detaljerad distribution och organisation av olika celltyper och cellulära strukturer. Detta kan ge ny inblick i hur mitokondriella sjukdomar kan påverka nervsystemets utveckling. Det är till exempel möjligt att övervaka neuronala axoner (SMI312-positiva) och dendriter (MAP2-positiva) (figur 2A) eller ömsesidig förekomst av neuronala celler (MAP2-positiva) och gliaceller (S100ß-positiva) (figur 2A). Konfokala bilder kan också bidra till att mer i detalj undersöka distribution och organisering av neurala stamceller ((könbestämningsregion Y) box-2 (SOX2)-positiva) med avseende på nervceller (beta-III tubulin (TUJ1)-positiv) (figur 2B). Slutligen kan hjärnorganoider färgas för mitokondrispecifika markörer (såsom det yttre mitokondriella membranproteinet, translocase av yttre membran 20 kDa-underenhet (TOM20)) (figur 2C).
Det beskrivna protokollet gör det möjligt för forskare att utföra bioenergetisk profilering av hjärnorganoider. Med hjälp av detta förfarande är det möjligt att mäta både mitokondriell metabolism med hjälp av syreförbrukningen (OCR) (figur 2D) och den glykolytiska metabolismen med hjälp av den extracellulära försurningshastigheten (ECAR) (figur 2E). Bioenergetisk profilering gör det möjligt att övervaka hur celler kan ändra sina OCR- och ECAR-profiler som svar på en sekventiell administrering av mitokondriella hämmare.
För det första kan ATP-syntashämmaren, oligomycin, appliceras. Oligomycin orsakar en minskning av OCR-profilen (figur 2D) och identifierar därför den OCR som behövs för ATP-produktion. Vid behandling med oligomycin kan det också finnas en kompensatorisk ökning av ECAR (figur 2E), vilket tyder på att cellerna kan uppreglera glykolys för att förhindra den metaboliska stress som orsakas av minskningen av mitokondriell metabolism. Den efterföljande dubbla tillämpningen av protonjonofor, kolylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), orsakar förlusten av mitokondriell membranpotential. Eftersom syremolekylerna nu är fria att röra sig orsakar detta en snabb ökning av OCR (figur 2D).
Dessa förändringar i OCR-profilen identifierar cellernas maximala andningsförmåga. Den slutliga administrerar rotenone plus antimycin A orsakar ett block av elektrontransporten, och därför en brant minskning av OCR (figur 2D). ECAR kan visa fluktuation efter behandling med FCCP och rotenon plus antimycin A (figur 2E), beroende på cellernas återstående glykolytiska kapacitet. OCR- och ECAR-profilerna kan ändras dramatiskt i hjärnan organoider härrör från mitokondriella patienter.
Figur 1: Generering av hjärnorganoider från mänskliga iPSCs. (A) Schematisk representation av det protokoll som används för att producera hjärnorganoider med motsvarande överföringsbilder. Dag 0 motsvarar dissociation av iPSCs och sådd i en 96-väl platta med V-botten med CDMI kompletterad med en ROCK-hämmare, en WNT-hämmare och SB431542. På dag 18 överförs neurosfärer från 96-brunnsplattorna till 100 mm cellodlingsrätter med CDMII kompletterade med N2. Från och med nu är kulturerna placerade på en omloppsbana. På dag 35 växlas mediet från CDMII till CDMIII, som också innehåller en upplöst matriskomponent (tabell 1). Från dag 70 och framåt, CDMIII byts till CDMIV kompletteras med B27. En representativ neurosfär bild togs på dag 12 med hjälp av en mikroskop kamera med 10x förstoring. En tidig organoid bild togs på dag 22 med hjälp av en mikroskop kamera vid 4x förstoring. En mogen organoid bild togs på dag 40 med hjälp av en mikroskop kamera med 4x förstoring. (B) Den övergripande strukturen och cellulära organisationen av hjärnorganoider kan visualiseras med hjälp av bredfältsmikroskopi. Representativa sydda bredfältsbilder visas för att visualisera sambanden mellan dendriter (MAP2-positiva) och axoner (SMI312-positiva) och mellan neuronala celler (MAP2-positiva) och förmodade astrocyter (S100ß-positiva). Cellerna var kontradda med Hoechst för att avslöja atomkärnorna. Alla bilder togs med hjälp av 78 dagar gamla hjärnan organoider. Den högra kolumnen visar överlägget av tre kanaler (sammanfoga). Skalstänger = 500 μm. Förkortningar: iPSC = inducerad pluripotent stamcell; CDM = Kortikal differentieringsmedium; ROCK = Rho kinas; MAP2 = mikrotubuleassocierad protein 2; S100ß= S100 kalciumbindande protein B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visualisering och bioenergetisk profilering av hjärnans organoider för mitokondriell sjukdomsmodellering. Den detaljerade organisationen och arkitekturen av organoider kan analyseras med hjälp av konfokal mikroskopi. Alla bilder togs med hjälp av 78 dagar gamla hjärnan organoider och counterstained med Hoechst för att avslöja atomkärnorna. Den högra kolumnen visar överlägget av tre kanaler (sammanfoga). Skalstänger = 50 μm. (A) Representativa projektioner med utökad fokusering (44–48 optiska plan, 0,6 μm vardera) som behandlar samspelet mellan dendriter (MAP2-positiva, pilspetsar) och axoner (SMI312-positiva pilar) och mellan neuronala celler (MAP2-positiva pilspetsar) och förmodade astrocyter (S100ß-positiva pilar). (B) Representativa projektioner med utökad fokusering (14–31 optiska plan, 0,6 μm vardera) som visar fördelningen av nervceller (TUJ1-positiva pilspetsar) med avseende på neurala stamceller (SOX2-positiva pilar). (C) Representativa projektioner med utökad fokusering (20 optiska plan, 0,6 μm vardera) som visar fördelningen inom nervceller (TUJ1-positiva, pilspetsar) av mitokondrier (visualiserade med antikroppar mot det yttre mitokondriella membranproteinet TOM20, pilar). (D) Mitokondriell andning av hjärnan organoider kan övervakas baserat på profilen av OCR efter sekventiell administrering av olika mitokondriella hämmare (se text för detaljer). (E) Glykolytisk aktivitet hos hjärnan organoider kan övervakas baserat på ECAR vid sekventiell administrering av mitokondriella hämmare (se text för detaljer). För bioenergetic profilering, cirka 10-15 hjärnan organoider dissociateds för att få tillräckligt med celler för replating på 96-brunn microplate. Staplarna anger SEMs baserat på resultaten som erhållits i två oberoende experiment. Förkortningar: MAP2 = mikrotubuleassocierad protein 2; S100ß = S100 kalciumbindande protein B; TUJ1 = beta-III tubulin; SOX2 = (könsbestämningsregion Y) ruta-2; TOM20 = translocase av yttre membran 20 kDa underenhet; OCR = syreförbrukningshastighet; ECAR = extracellulär försurningshastighet; Oligomer. = oligomycin; FCCP = kolylcyanid-p-trifluoretetoxifenylhydrazon; R = rotenone; AntA = Antimycin A; SEMs = standardfel av medel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Mediekomposition | |||
| CDMI (Dag 0-18) | Sista insläpp. | ||
| Glasgow-MEM | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Knockout serum ersättning (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (MEM icke-essentiell aminosyralösning) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Natrium pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| 2-mercaptethanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicillin och streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml och 100 μg/ml |
| CDMII (Dag 18-35) | Sista insläpp. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillägg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemiskt definierat lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin och streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml och 100 μg/ml |
| CDMIII (Dag 35-70) | Sista insläpp. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillägg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemiskt definierat lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin och streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml och 100 μg/ml |
| Fetala nötkreatur serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV(dag 70+) | Sista insläpp. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillägg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kemiskt definierat lipidkoncentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin och streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml och 100 μg/ml |
| Fetala nötkreatur serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| B-27 tillägg med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Neuronal Medium | Sista insläpp. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| N-2 tillägg | Gibco | 17502048 | [1x] |
| B-27 tillägg med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| L-askorbinsyra | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (dibutyryl cykliskt adenosinmonofosfat) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (hjärnan-härledd neutrotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/mL] |
| GDNF (gliacelllinje-härledd neurotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/mL] |
| Human TGF-β3 (transformerande tillväxtfaktor-beta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/mL] |
| Analysmedium | Sista insläpp. | ||
| Seahorse XF DMEM medium | Sjöhäst Biovetenskap | 103680-100 | 500 ml |
| Natrium pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| L-glutamin | Lonza | BEBP17-605E | 2 mM |
| Glukos | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 mM |
| Blockera lösning | Sista insläpp. | ||
| PBS-Interpolering | [1:1] 0.1% Interpolering | ||
| Åsne serum | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | 1% |
Tabell 1: Uppgifter om medier och lösningar som används för organoidgenerering.
| Initiering | Baslinje (X3) | Oligomycin injektion (X3) | FCCP-injektion (X3) | FCCP-injektion (X3) | Anti A + Rot Injektion (X3) |
| Kalibrera | Blanda | Blanda | Blanda | Blanda | Blanda |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Jämvikt (12:00) | Vänta | Vänta | Vänta | Vänta | Vänta |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Mått (03:00) | Mått (03:00) | Mått (03:00) | Mått | Mått (03:00) | |
| (03:00) |
Tabell 2: Protokollinställning för bioenergetisk profilering. Beskrivning av stegen och deras längd på några minuter med Seahorse Wave Desktop-programvaran. Förkortningar: FCCP = carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; Rot = rotenone; Anti A = Antimycin A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver reproducerbar generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning för mitokondriell sjukdom modellering. Protokollet som beskrivs här ändras baserat på ett tidigare publicerat verk20. En stor fördel med det nuvarande protokollet är att det inte kräver manuell inbäddning av varje organoid i en byggnadsställningsmatris. Faktum är att matrislösningen helt enkelt löses upp i cellodlingsmediet. Dessutom finns det inget behov av att använda dyra bioreaktorer, eftersom organoider kan odlas i standardvävnadskultur 6-brunnsplattor placerade på en orbital shaker inuti inkubatorn. Detta förfarande möjliggör också parallell odling av flera plattor som innehåller olika organoider som härrör från olika enskilda linjer, vilket ökar genomströmningen av experimenten och möjliggör övervakning av potentiella skillnader som uppstår i tillväxtprofilerna för olika organoider. Vi testade detta protokoll med hjälp av olika iPSCs härrör från friska kontroller och individer som drabbats av mitokondriella sjukdomar, med konsekventa resultat.
För mitokondriell sjukdom modellering är det viktigt att använda olika markörer för att visualisera morfologin och organisationen av mitokondriellt nätverk. Detta förfarande gör det möjligt att undersöka om mitokondriellt antal, morfologi eller distribution kan ändras i hjärnan organoider härrör från patienter med mitokondriella sjukdomar. Förekomsten och organisationen av neurala stamceller inom hjärnan organoider kan vara av avgörande betydelse för modellering mitokondriella störningar. Vi upptäckte nyligen att mutationer som orsakar mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, störa cellulära arkitekturen och distributionen av neurala stamceller inom patient-härledda hjärnan organoider18.
För att utföra bioenergetisk profilering har vi anpassat en metod som tidigare beskrivits för att bedöma bioenergetik av pluripotenta stamceller21. Ett nytt protokoll beskrev hur man utför bioenergetic profilering av organoider härrör från mus tunntarmen, mänskliga kolon och kolorektal tumörer22. Dessa organoider är dock ganska små jämfört med hjärnans organoider, och därför behövs ett annat protokoll, som det som rapporteras här, för hjärnorganoider. Vi använde nyligen detta protokoll för att bedöma den bioenergetiska profilen för mänskliga hjärnan organoider bär mutationer i surfeit locus protein 1 genen (SURF1) som orsakar den allvarliga mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom18. Vi fann att OCR profilen är särskilt påverkas i Leigh syndrom organoider, vilket framgår av en betydande minskning av den basala OCR nivå, ATP produktionstakten och den maximala andning hastighet18.
Sammanfattningsvis presenterar vi här ett detaljerat protokoll för robust generering av mänskliga hjärnan organoider och beskriver hur man utför experiment som skulle vara viktiga för undersökningen av de sjukdomsmekanismer som ligger till grund för mitokondriella sjukdomar. Mänskliga hjärnorganoider kan också vara av avgörande betydelse för att klargöra den mitokondriella mångfalden i den mänskliga hjärnan och dess roll i människors hälsa och sjukdomar23. Det är viktigt att klargöra att hjärnan organoider genereras med för närvarande tillgängliga protokoll, inklusive den som beskrivs här, fortfarande har begränsningar. Dessa inkluderar till exempel bristen på kärlbildning och frånvaron av mikrogliapopulation24. Dessa aspekter måste beaktas för att tolka resultaten korrekt.
Till exempel kan bristen på vaskulatur och mikroglia begränsa kompensatoriska mekanismer som kan finnas på plats in vivo. Patient-härledda hjärnan organoider kan således uppvisa defekter som är starkare än de som observerats hos patienter17,18. Dessutom, trots en allmän reproducerbarhet av detta protokoll20, kan line-to-line heterogenitet observeras. För detta ändamål, när man utför sjukdomsmodelleringsstudier, är det alltid viktigt att systematiskt kvantifiera enhetligheten hos kontroll och patientens organoider genom att bedöma mönstren för morfologi (storlek, lager) och fördelningen av molekylära markörer över olika organoider.
Slutligen är det inte möjligt att generera hjärnorganoider från en enda iPSC, vilket begränsar möjligheten till storskalig genetisk screening med CRISPR/Cas9. Med tanke på forskningstakten är det troligt att några av de nuvarande begränsningarna i det protokoll som beskrivs här snart kommer att övervinnas. Optimerade protokoll blir tillgängliga. Dessa 3D-modeller av mitokondriella sjukdomar kommer förhoppningsvis att möjliggöra en eventuell upptäckt av genomförbara terapier för mitokondriella sjukdomar, som är skadliga, och för obotliga sjukdomar med mycket ouppfyllda medicinska behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska eller icke-finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Miriam Bünning för teknisk support. Vi bekräftar stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 till A.P.), Spark och Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och Det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF Bio young investigator bevilja AZ 031L0211 till A.P.). Arbetet i laboratoriet för C.R.R. stöddes av DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A.
- Gorman, G. S., et al.
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J.
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
