Summary

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

Published: June 21, 2021
doi:

Summary

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Abstract

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme en zijn momenteel ongeneeslijk. Deze ziekten veroorzaken neurologische ontwikkelingsdefecten waarvan de onderliggende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Een belangrijke wegversperring is het gebrek aan effectieve modellen die de neuronale stoornis met vroege aanvang bij de patiënten samenvatten. Vooruitgang in de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) maakt het mogelijk om driedimensionale (3D) hersenorganoïden te genereren die kunnen worden gebruikt om de impact van ziekten op de ontwikkeling en organisatie van het zenuwstelsel te onderzoeken. Onderzoekers, waaronder deze auteurs, hebben onlangs menselijke hersenorganoïden geïntroduceerd om mitochondriale aandoeningen te modelleren. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik in mitochondriale bio-energetische profilering en beeldvormingsanalyses. Deze experimenten zullen het gebruik van hersenorganoïden mogelijk maken om metabole en ontwikkelingsstoornissen te onderzoeken en kunnen cruciale informatie opleveren om de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten te ontleden.

Introduction

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme1. Ze worden veroorzaakt door genetische mutaties die verschillende mitochondriale processen verstoren, waaronder oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2, ademhalingsketenassemblage, mitochondriale dynamica en mitochondriale DNA-transcriptie of –replicatie3. Weefsels met energiebehoeften worden in het bijzonder beïnvloed door mitochondriale disfunctie4. Dienovereenkomstig ontwikkelen patiënten met mitochondriale ziekten meestal neurologische manifestaties met vroege aanvang.

Er zijn momenteel geen behandelingen beschikbaar voor kinderen met mitochondriale ziekten5. Een belangrijke belemmering voor de ontwikkeling van mitochondriale ziekten door geneesmiddelen is het gebrek aan effectieve modellen die het verloop van de menselijke ziekte samenvatten6. Verschillende van de momenteel bestudeerde diermodellen vertonen niet de neurologische defecten die bij de patiënten aanwezig zijn7. Vandaar dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten nog steeds niet volledig worden begrepen.

Recente studies genereerden iPSC’s van patiënten met mitochondriale ziekten en gebruikten deze cellen om patiëntspecifieke neuronale cellen te verkrijgen. Genetische defecten geassocieerd met de mitochondriale ziekte, het syndroom van Leigh, blijken bijvoorbeeld afwijkingen te veroorzaken in cellulaire bio-energetica8,9, eiwitsynthese10 en calciumhomeostase9,11. Deze rapporten gaven belangrijke mechanistische aanwijzingen over de neuronale stoornis die optreedt bij mitochondriale ziekten, waardoor de weg werd vrijgemaakt voor de ontdekking van geneesmiddelen voor deze ongeneeslijke ziekten12.

Tweedimensionale (2D) culturen maken het echter niet mogelijk om de architecturale complexiteit en regionale organisatie van 3D-organen te onderzoeken13. Hiertoe kan het gebruik van 3D-hersenorganoïden afgeleid van patiëntspecifieke iPSCs14 onderzoekers in staat stellen aanvullende belangrijke informatie te verkrijgen en daardoor te helpen ontleden hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel beïnvloeden15. Studies met iPSC-afgeleide hersenorganoïden om mitochondriale ziekten te onderzoeken, beginnen de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten te ontdekken.

Ruggenmergorganoïden met mutaties geassocieerd met de mitochondriale ziekte, mitochondriale encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes syndroom (MELAS), vertoonden defecte neurogenese en vertraagde differentiatie van motorneuronen16. Corticale organoïden afgeleid van patiënten met de mitochondriale ziekte, Leigh-syndroom, vertoonden verminderde omvang, defecten in neurale epitheliale knopgeneratie en verlies van corticale architectuur17. Hersenorganoïden van patiënten met het Leigh-syndroom toonden aan dat de ziektedefecten initiëren op het niveau van neurale voorlopercellen, die zich niet kunnen binden aan mitochondriaal metabolisme, waardoor afwijkende neuronale vertakkingen en morfogenese18 ontstaan. Neurale voorlopers kunnen dus een cellulair therapeutisch doelwit vormen voor mitochondriale ziekten, en strategieën die hun mitochondriale functie bevorderen, kunnen de functionele ontwikkeling van het zenuwstelsel ondersteunen.

Het gebruik van hersenorganoïden kan helpen bij het blootleggen van de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten. Mitochondriale ziekten worden voornamelijk beschouwd als neurodegeneratie met vroege aanvang5. Neurologische ontwikkelingsstoornissen zijn echter ook aanwezig bij patiënten die worden getroffen door mitochondriale ziekten, waaronder ontwikkelingsachterstand en cognitieve stoornissen19. Patiëntspecifieke hersenorganoïden kunnen helpen deze aspecten aan te pakken en op te helderen hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van de menselijke hersenen kunnen beïnvloeden. Mitochondriale disfunctie kan ook een pathogenetische rol spelen bij andere, meer voorkomende neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington4. Vandaar dat het ophelderen van de impact van mitochondriale defecten in de neurologische ontwikkeling met behulp van hersenorganoïden ook instrumenteel kan zijn voor de studie van die ziekten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden die kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van ziektemodellering van mitochondriale ziekten.

Protocol

OPMERKING: Voor het gebruik van menselijke iPSC’s kan een ethische goedkeuring vereist zijn. iPSC’s die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van gezonde controlepersonen na lokale ethische goedkeuring (# 2019-681). Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd onder een steriele celkweekkap, waarbij alle reagentia en verbruiksartikelen zorgvuldig worden gedesinfecteerd voordat ze onder de motorkap worden overgebracht. Menselijke iPSC’s die voor differentiatie worden gebruikt, moeten een passagegetal hebben …

Representative Results

Het hier beschreven protocol vergemakkelijkt de robuuste generatie van ronde organoïden (figuur 1A). De gegenereerde organoïden bevatten volwassen neuronen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van eiwitmarkers die specifiek zijn voor axonen (SMI312) en dendrieten (microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2)) (Figuur 1B). Volwassen organoïden bevatten niet alleen neuronale cellen (MAP2-positief), maar ook g…

Discussion

Dit artikel beschrijft de reproduceerbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik voor mitochondriale ziektemodellering. Het hier beschreven protocol is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd werk20. Een groot voordeel van het huidige protocol is dat het niet vereist dat elke organoïde handmatig in een steigermatrix wordt ingesloten. In feite wordt de matrixoplossing eenvoudig opgelost in het celkweekmedium. Bovendien is het niet nodig om dure bioreactoren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Miriam Bünning voor de technische ondersteuning. We erkennen de steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 aan A.P.), Spark en Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), de United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) en het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (e: Bio jonge onderzoeker subsidie AZ 031L0211 aan A.P.). Het werk in het laboratorium van C.R.R. werd ondersteund door de DFG (FOR 2795 “Synapsen under stress”, Ro 2327/13-1).

Materials

2-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Affinity Designer Serif (Europe) Ltd Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig Sigma Aldrich SAB4600033-250UL 1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-31571 1:300
Antimycin A Sigma Aldrich 1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) Sigma Aldrich T8578 1:2000
Argon Laser Melles Griot Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid Sigma A92902
B-27 with Vitamin A Gibco 17504044
Bacto Agar Becton Dickinson 3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF Miltenyi Biotec 130-093-0811
cAMP Sigma D0627
Cell Star cell culture 6 well plate Greiner-Bio-One 657160
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031
Confocal laser scanning microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231 Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit Thermo Fisher C7026
DMEM/F12 ThermoFisher 31330038
DMSO Sigma D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3 Merck Millipore AP180C 1:300
Donkey anti-mouse Cy3 Merck Millipore AP192C 1:300
Donkey anti-rabbit Cy3 Merck Millipore AP182C 1:300
DPBS Gibco 14190250
DS-Q1Mc camera Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
FCCP Sigma Aldrich 370-86-5
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
GDNF Miltenyi Biotec 130-096-291
Glasgow MEM Gibco 11710-035
Glass Pasteur pipette Brand 747715 Inverted
Glutamax Gibco 35050-061
Helium-Neon Laser Melles Griot Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin Merck H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026331
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 1:2500
Image J 1.53c Wayne Rasband National Institute of Health Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer Braun 4606108V
Knockout Serum Replacement Gibco 10828010
Laser (407 nm) Coherent Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2 Synaptic Systems No. 188004 1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA Gibco 11140-050
mTeSR Plus Stemcell Technology 85850 iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza # LT07-218
N2 Supplement Gibco 17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW) Neoject 10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 Nikon Imaging software
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
PAP Pen Sigma Z377821-1EA To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit Worthington LK003150
Paraformaldehyde Merck 818715 4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL VWR 612-1681 Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0 Nikon Microscope Solutions Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 Nikon Microscope Solutions Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm) Greiner Bio-One 664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) Falcon 352235
Potassium chloride Roth 6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant Invitrogen P36980
Qualitative filter paper VWR 516-0813
Rock Inhibitior Merck SCM075
Rotenone Sigma 83-794
S100β Abcam Ab11178 1:600
SB-431542 Cayman Chemical Company 13031
Scalpel blades Heinz Herenz Hamburq 1110918
SMI312 Biolegend 837904 1:500
Sodium bicarbonate Merck/Sigma 31437-1kg-M
Sodium chloride Roth 3957
Sodium dihydrogen phosphate Applichem 131965
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
SOX2 Santa Cruz Biotechnology Sc-17320 1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco/StemPro A1110501 Reagent A
Super Glue Gel UHU 63261 adhesive gel
SuperFrost Plus VWR 631-0108
Syringe for single usage (1 mL) BD Plastipak 300015
TB2 Thermoblock Biometra
TC Plate 24 Well Sarstedt 83.3922
TC Plate 6 Well Sarstedt 83.392
TGFbeta3 Miltenyi Biotec 130-094-007
Tissue Culture Hood ThermoFisher 51032711
TOM20 Santa Cruz Biotechnology SC-11415 1:200
Triton-X Merck X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA Invitrogen 15575020
Vibratome Microm HM 650 V Thermo Scientific Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade Wilkinson Sword 70517470
Whatman Benchkote Merck/Sigma 28418852
Wnt Antagonist I EMD Millipore Corp 3378738
XF 96 extracellular flux analyser Seahorse Bioscience 100737-101
XF Assay DMEM Medium Seahorse Bioscience 103680-100
XF Calibrant Solution Seahorse Bioscience 100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate) Seahorse Bioscience 102416-100

References

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Play Video

Cite This Article
Le, S., Petersilie, L., Inak, G., Menacho-Pando, C., Kafitz, K. W., Rybak-Wolf, A., Rajewsky, N., Rose, C. R., Prigione, A. Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling. J. Vis. Exp. (172), e62756, doi:10.3791/62756 (2021).

View Video