Summary
Vi beskriver en detaljert protokoll for generering av menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede hjerneorganoider og deres bruk i modellering av mitokondriesykdommer.
Abstract
Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen og er for tiden uhelbredelig. Disse sykdommene forårsaker nevrodevelopmentale defekter hvis underliggende mekanismer gjenstår å bli belyst. En stor veisperring er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer tidlig nevronsvikt sett hos pasientene. Fremskritt i teknologien for induserte pluripotente stamceller (iPSCer) muliggjør generering av tredimensjonale (3D) hjerneorganoider som kan brukes til å undersøke virkningen av sykdommer på utvikling og organisering av nervesystemet. Forskere, inkludert disse forfatterne, har nylig introdusert menneskelige hjerneorganoider for å modellere mitokondrieforstyrrelser. Denne artikkelen rapporterer en detaljert protokoll for robust generering av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk i mitokondriebioenergetiske profilerings- og bildeanalyser. Disse forsøkene vil tillate bruk av hjerneorganoider for å undersøke metabolske og utviklingsmessige dysfunksjoner og kan gi avgjørende informasjon for å dissekere nevronpatologien til mitokondriesykdommer.
Introduction
Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen1. De er forårsaket av genetiske mutasjoner som forstyrrer forskjellige mitokondrieprosesser, inkludert oksidativ fosforylering (OXPHOS)2, respiratorisk kjedemontering, mitokondriedynamikk og mitokondrie-DNA-transkripsjon eller replikering3. Vev med energibehov påvirkes spesielt av mitokondrie dysfunksjon4. Følgelig utvikler pasienter med mitokondriesykdommer vanligvis tidlige nevrologiske manifestasjoner.
Det finnes for tiden ingen behandlinger tilgjengelig for barn som er rammet av mitokondriesykdommer5. En stor hindring for legemiddelutvikling av mitokondriesykdommer er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer det menneskelige sykdomsforløpet6. Flere av de for tiden studerte dyremodellene viser ikke de nevrologiske feilene som finnes hos pasientene7. Derfor er mekanismene som ligger til grunn for nevronpatologien til mitokondriesykdommer fortsatt ikke fullt ut forstått.
Nyere studier genererte iPSCer fra pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer og brukte disse cellene til å skaffe pasientspesifikke nevronceller. For eksempel har genetiske defekter forbundet med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, vist seg å forårsake avvik i cellulær bioenergi 8,9, proteinsyntese10 og kalsium homeostase9,11. Disse rapportene ga viktige mekanistiske ledetråder om nevronnedsettelsen som forekommer i mitokondriesykdommer, og banet vei for narkotikaoppdagelse for disse uhelbredelige sykdommene12.
Todimensjonale (2D) kulturer muliggjør imidlertid ikke undersøkelse av den arkitektoniske kompleksiteten og den regionale organiseringen av 3D-organer13. For dette formål kan bruk av 3D-hjerneorganoider avledet fra pasientspesifikke iPSCer14 tillate forskere å få ytterligere viktig informasjon og dermed bidra til å dissekere hvordan mitokondriesykdommer påvirker utviklingen og funksjonen til nervesystemet15. Studier som bruker iPSC-avledede hjerneorganoider for å undersøke mitokondriesykdommer begynner å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer.
Ryggmargsorganoider som bærer mutasjoner forbundet med mitokondriesykdommen, mitokondrie encefalopati, melkesyreose og slaglignende episoder syndrom (MELAS), viste defekt nevrogenese og forsinket motorisk nevrondifferensiering16. Kortikale organoider avledet fra pasienter med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, viste redusert størrelse, defekter i nevral epitelial knoppgenerering og tap av kortikale arkitektur17. Hjerneorganoider fra Leighs syndrompasienter viste at sykdomsfeilene initierer på nivået av nevrale stamceller, som ikke kan forplikte seg til mitokondriemetabolisme, forårsaker avvikende nevronal forgrening og morfogenese18. Dermed kan nevrale forfedre representere et cellulært terapeutisk mål for mitokondriesykdommer, og strategier som fremmer deres mitokondriefunksjon kan støtte den funksjonelle utviklingen av nervesystemet.
Bruken av hjerneorganoider kan bidra til å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer. Mitokondriesykdommer anses hovedsakelig som tidlig nevrodegenerasjon5. Imidlertid er nevrodevelopmentale defekter også til stede hos pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer, inkludert utviklingsforsinkelse og kognitiv svikt19. Pasientspesifikke hjerneorganoider kan bidra til å adressere disse aspektene og belyse hvordan mitokondriesykdommer kan påvirke menneskelig hjerneutvikling. Mitokondrie dysfunksjon kan også spille en patogenetisk rolle i andre mer vanlige nevrologiske sykdommer, som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntington sykdom4. Derfor kan det å belyse virkningen av mitokondriefeil i nevroutvikling ved hjelp av hjerneorganoider også være avgjørende for studiet av disse sykdommene. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for å generere reproduserbare hjerneorganoider som kan brukes til å utføre sykdomsmodellering av mitokondriesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruk av menneskelige iPSCer kan kreve en etisk godkjenning. iPSC som ble brukt i denne studien ble avledet fra friske kontrollpersoner etter lokal etisk godkjenning (#2019-681). Alle cellekulturprosedyrer må utføres under en steril cellekulturhette, og desinfiserer forsiktig alle reagenser og forbruksvarer før de overføres under hetten. Humane iPSCer som brukes til differensiering bør ha et passasjenummer under 50 for å unngå potensielle genomiske avvik som kan oppstå ved omfattende kultur. Cellenes pluripotente tilstand bør valideres før organoidgenerering, for eksempel ved å overvåke uttrykket av pluripotens-tilknyttede markører som NANOG eller OCT4. Mycoplasma tester bør utføres ukentlig for å sikre mykoplasmafrie kulturer.
1. Generering av hjerneorganoider
- Kultur av menneskelige iPSCer
- Kultur menneskelige iPSCer under materfrie forhold i iPSC medium (se materialtabellen) på belagte 6-brønnsplater og hold dem i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Overdragelsen av materceller kan hemme den organoide differensieringen. Før cellene minst en gang i materfrie forhold. - Passasje iPSCene ved 80% samløp ved hjelp av enzymfri løsrivelsesmedium i forhold fra 1:4 til 1:12. For å øke celleoverlevelsen, tilsett 10 μM Rho-assosiert proteinkinase (ROCK)-hemmer (Y27632) etter hver splitting.
- Kultur menneskelige iPSCer under materfrie forhold i iPSC medium (se materialtabellen) på belagte 6-brønnsplater og hold dem i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Ta avstand fra iPSCene (80 % samløp)-dag 0.
- Klargjør kortikale differensieringsmedium I (CDMI) (tabell 1). Prewarm CDMI medium ved romtemperatur (22-25 °C) før du legger den til cellene.
- Vask brønnene som inneholder iPSCene med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne døde celler og rusk.
- Tilsett 500 μL for forhåndsvarslet reagens A (materialbord) til hver brønn og inkuber i 5 min ved 37 °C. Kontroller under mikroskopet for å sikre celleavløsning.
- Tilsett 1 ml iPSC-medium for å fortynne reagens A for å nøytralisere aktiviteten.
- Bruk en 1000 μL pipette for å fjerne cellene ved å pipettere opp og ned og overføre celleopphenget til et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger iPSCene forsiktig ved 125 x g i 5 minutter ved romtemperatur (22-25 °C).
- Aspirer forsiktig supernatanten for å unngå å forstyrre cellepellet.
- Resuspend pellet med 1 ml CDMI for å få en encellet suspensjon, og telle cellenummeret.
- Forbered såddmediet med 9000 iPSCer per 100 μL i CDMI supplert med 20 μM ROCK-hemmer, 3 μM WNT-cateninhemmer (IWR1) og 5 μM SB431542.
- Tilsett 100 μL såingsmedium per brønn til en 96-brønns v-bunnplate.
- Oppbevar platen i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Neurosphere generasjon
- På dag 1 må du observere at runde cellemengder (nevrosfærer) med definerte glatte grenser dannes. Legg merke til de døde cellene rundt aggregatene. Fortsett å dyrke i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 3, agitate platen ved å trykke på sidene tre ganger for å løsne døde celler.
- Tilsett 100 μL CDMI supplert med 20 μM ROCK-hemmer, 3 μM IWR1 og 5 μM SB431542 til hver brønn.
- Returner platen til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 6 fjerner du forsiktig 80 μL av det supernatante mediet fra hver brønn. Unngå å berøre bunnen av brønnen.
- Tilsett 100 μL CDMI supplert med 3 μM IWR1 og 5 μM SB431542 til hver brønn. Returner platen til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Gjenta trinn 5 og 6 hver tredje dag til dag 18.
- Overføring av nevrosfærer
- På dag 18 forbereder du Cortical Differentiation Medium II (CDMII) (tabell 1) og tilsetter 10 ml til en 100 mm ultralav monteringscellekulturplate.
- Bruk en 200 μL pipette med spissen avskåret for å overføre de runde nevrosfærene fra 96-brønnsplaten til den 100 mm ultra-lave festecellekulturplaten.
MERK: Vær forsiktig for å unngå å skade nevrosfærene ved å sørge for at åpningen av spissen er bred nok og at aggregatene ikke aspireres for raskt. - Fjern 5 ml medium fra platen som inneholder nevrosfærene og tilsett 5 ml fersk CDMII.
MERK: Denne prosedyren bidrar til å redusere mengden CDMI-medium som kan ha overført fra overføring av nevrosfærer. - Plasser platen på en orbital shaker ved 70 rpm inne i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Inspiser nevrosfærene visuelt neste dag. Øk hastigheten på orbital shaker hvis nevrosfærene er klumpet sammen eller festet til bunnen av platen. - Hver tredje dag aspirerer du forsiktig det overnaturlige mediet og erstatter det med fersk CDMII. La en liten mengde av mediet forhindre at nevrosfærene tørker ut.
- På dag 35 forbereder du kortikale differensieringsmedium III (CDMIII) (tabell 1).
MERK: Matrisekomponenten skal oppløses i kald CDMIII. - Aspirer mediet fra platen og tilsett 10 ml kald CDMIII.
MERK: Det er mer effektivt å bruke kaldt medium slik at matrisekomponenten kan belegge organoidene uten å danne klumper. - Etter å ha skiftet medium, plasser platen tilbake på en orbital shaker ved 70 rpm inne i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Endre mediet hver 3-5 dager, avhengig av veksthastigheten, som angitt av fargen på mediet.
- På dag 70 forbereder du Kortikale differensieringsmedium IV (CDMIV) (tabell 1). Bruk CDMIV medium til ønsket alder av organoider er nådd. I løpet av denne perioden, hold platen på en orbital shaker satt til 70 rpm inne i en fuktet vev kultur inkubator (37 °C og 5% CO2).
- Endre mediet hver 3-5 dager, avhengig av vekstraten.
2. Immunostaining av hjerneorganoider
- Vev forberedelse
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, og legg den under en sikkerhetshette.
MERK: Bruk personlig sikkerhetsutstyr ved håndtering av PFA. - Samle hjerneorganoider og overfør dem forsiktig med en stump tippet 3 ml plast Pasteur pipette til en 6-brønns plate fylt med PFA.
MERK: Bruk organoider eldre enn 40 dager for å tillate visualisering av strukturer med høyere cellulær kompleksitet. - Oppbevar organoidene i PFA-oppløsningen i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern PFA forsiktig med en 3 ml pasteurpipette i plast, og vask de faste organoidene tre ganger ved hjelp av PBS.
- Oppbevar de faste organoidene ved 4 °C i PBS inntil videre bruk.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, og legg den under en sikkerhetshette.
- Fremstilling av hjerneorganoide skiver
- Forbered en 3% agarløsning og varm sakte til flytende.
- Plasser formen (den kuttede enden av en 10 ml sprøyte) på et stykke absorberende filterpapir (glatt side opp). Legg en dråpe agar på den.
- Ta raskt en enkelt organoid ut av 6-brønnsplaten med en slikkepott og fjern overdreven PBS med filterpapir.
MERK: Pass på at du ikke berører organoiden direkte med filterpapir. - Plasser organoiden på agardråpen.
- Gjenta denne prosedyren med opptil tre organoider.
MERK: Arbeid raskt for å unngå størkning av agaren i dette trinnet. - Fyll formen med agar til alle organoidene er helt dekket.
- Vent til agaren begynner å størkne, og overfør deretter forsiktig hele formen som inneholder organoidene, inkludert absorberende filterpapir, til et kjøleelement.
MERK: Hvis et kjøleelement ikke er tilgjengelig, oppbevar organoidene i noen minutter i kjøleskap ved 4 °C. - I mellomtiden, forbered deg på skjæreprosedyren: Plasser et barberblad (rengjort med aceton og vasket med dobbelt destillert vann) i holderen på vibratomet, monter på badekaret og fyll det med PBS.
- Fjern formen fra (størknet) agar og bruk en skalpell for å trimme den for å danne en terning.
- Fest agarkuben som inneholder organoidene på bærerplaten på vibratomet med klebegel (se materialbordet), og plasser den i badekaret som inneholder PBS.
- Juster vibratomet (se materialtabellen) for å kutte skiver med en tykkelse på 150 μm.
MERK: Vibratominnstillinger (riktig vinkel, amplitude, frekvens og hastighet på bladet) kan ligne på de som brukes til kutting av fast hjernevev avledet fra tidlige postnatale dyr. De ideelle innstillingene avhenger imidlertid sterkt av typen vibratom og må bestemmes i et første trinn for å forhindre forvrengning eller til og med ripping av vevet mens du kutter. - Start skjæreprosedyren. Bruk en glasspipette eller en slikkepott for forsiktig å overføre hver nyskårne skive til en 24-brønns plate fylt med PBS.
- Oppbevar platen som inneholder skiver ved 4 °C (i opptil noen dager) til videre behandling.
- Overfør skivene ut av platen med en glasspipette eller en slikkepott på mikroskopsklier. Bruk minst to stykker per lysbilde.
- Fjern forsiktig agaren og overflødig PBS med en sprøyte.
- La skivene tørke til de fester seg til lysbildene.
MERK: Mens mikroskopskred kan lagres i plastkamre fylt med PBS ved 4 °C, bør de farges så snart som mulig etter skjæreprosedyren.
- Immunhiistokjemisk farging
- Klargjør blokkeringsløsningen (tabell 1).
- Bruk en PAP-penn til å tegne en hydrofob kantlinje rundt sektorene på lysbildet for å holde alle løsningene på lysbildene.
- Tilsett forsiktig blokkeringsløsningen på lysbildet, og inkuber i 1 time ved romtemperatur (22-25 °C). For å unngå å ødelegge vevet, ikke legg til løsningen direkte på toppen av skivene.
- Aspirer blokkeringsløsningen og påfør ønsket primært antistoff fortynnet i blokkeringsløsningen.
- Inkuber sklien over natten i et fuktet kammer ved 4 °C.
- Skyll lysbildet tre ganger med 1x PBS i 10 minutter hver.
- Inkuber skivene med det spesifikke sekundære antistoffet fortynnet i blokkeringsløsningen og utfør Hoechst-farging (1:2,500) i 1 time ved romtemperatur i mørket.
MERK: Husk å utføre negative kontroller for å bekrefte at det ikke er noen ikke-spesifikk binding eller automatisk fluorescens. - Skyll tre ganger med 1x PBS i 10 minutter hver i mørket.
- Tilsett en dråpe monteringsmedium i skiven, legg en deksleslip på kanten av dråpen, og legg dekslene sakte ned mot skiven for å unngå luftbobler.
- La skredet hvile over natten ved romtemperatur. Påfør neglelakk på kanten av dekslene for å forsegle lysbildet ytterligere. Oppbevars ved 4 °C ved langvarig lagring.
- Dokumentasjon av farging
- For å skanne store bilder for søm, bruk et motorisert oppreist bredfeltmikroskop utstyrt med (se materialtabellen for detaljer) et mål av høy kvalitet; DAPI-filtersett (f.eks. eksitasjon (EX): 340-380 nm, dikroisk speil (DM): 400 nm, barrierefilter (BA): 435-485 nm); fluorescein isothiocyanate filtersett (f.eks. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594-filtersett (f.eks. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); digitalt kamera; høy ytelse oppkjøp programvare som muliggjør automatiserte masker og stack operasjoner.
- For bildehåndtering bruker du et bildebehandlingsprogram som kan generere 8-biters tif-filer, beskjære masker, justere kontrast og lysstyrke, slå sammen kanalene (f.eks. blå, grønn og rød) og legge til skalalinjer.
- For å skanne detaljer, bruk et motorisert konfokalt laserskanningsmikroskop utstyrt med et mål av høy kvalitet, en UV-laser (EX: 408 nm), en Argon-laser (EX: 488 nm), en Helium-Neon-laser (EX: 543), bildeprogramvare for et konfokalt mikroskop.
- For bildehåndtering av detaljer, bruk et bildebehandlingsprogram som er i stand til å generere maksimalintensitetsprojeksjoner av kondole z-stabler (f.eks. optiske deler på 0,6 μm hver), generere 8-biters tif-filer, justere kontrast og lysstyrke, slå sammen kanalene (f.eks. blå, grønn og rød), og legge til skalalinjer.
- Bruk et grafisk redigeringsprogram til å ordne figurene.
3. Bioenergetisk profilering av hjerneorganoider
- Fremstilling av organoider for bioenergetisk profilering
- Forbered papain- og DNase-løsningen etter produsentens protokoll.
- Overfør 3-5 organoider til en 6-brønns plate. Vask dem to ganger med forhåndsvarslet PBS.
- Tilsett 2 ml forhåndsvarslet aktivert papainoppløsning som inneholder DNase. Bruk et blad, kutt organoidene i små biter.
- Plasser platen på en orbital shaker satt til 27 rpm inne i en cellekulturinkubator (ved 37 °C, 5 % CO2) og inkuber i 15–20 minutter.
MERK: Tidspunktet for inkubasjon avhenger av organoidstadiet. Tidlige organoider kan brukes som de er. For organoider eldre enn 3 måneder anbefales det å kutte organoidene i 2-3 stykker før dissosiasjon og inkubere brikkene med en gyngehastighet satt til 27 rpm i 15-20 min ved 37 °C. Denne prosedyren kan bidra til å fjerne nekrotisk vev som kan være til stede i de senere organoidene. - Samle det fordøyde vevet i et 15 ml rør og tilsett 5 ml organoidkulturmedium CDMIV (tabell 1).
- Triturer vevet med en 10 ml plastpipette ved å pipettere opp og ned 10-15 ganger. La det udissosierte vevet slå seg ned til bunnen av røret.
- Overfør celleopphenget forsiktig til et 15 ml rør, og unngå noen biter av udissosiert vev. Filtrer oppløsningen gjennom en 40 μm cellesil (f.eks. rundbunnsrør av polystyren med cellesilhetter).
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Vurder cellenummeret og kvaliteten ved hjelp av trypan blå.
- Tallerken ønsket antall (~20.000/brønn) av celler på belagte mikroplater på 96 brønner. Endre medium 6-8 h etter plating til Neuronal Medium (Tabell 1).
- Inkuber den belagte 96-brønns mikroplaten i en CO2-inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 4 dager.
- Bioenergetisk profilering
- På dag 3 etter at du har reparert de dissosierte cellene, tilsett 200 μL kalibreringsløsning i hver brønn i den nederste delen av 96-brønns mikroplaten, og plasser den øverste grønne sensorpatronen på den hydrerte mikroplaten.
MERK: Plasser sensorpatronen på toppen av mikroplaten i riktig retning, og sørg for at kalibrantløsningen dekker alle sensorene. - Inkuber den hydrerte mikroplaten på 96 brønner i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C over natten.
- Slå på analysatoren slik at instrumentet kan stabilisere seg ved 37 °C over natten.
- På dag 4 etter replating, inspiser den disassosierte organoidkulturen på den 96-brønns mikroplaten under mikroskopet for å sikre at cellene vises som en konfluent monolayer.
- Klargjør analysemedium (tabell 1).
- Fjern Neuronal Medium fra alle brønner med pipette uten å berøre bunnen av brønnen for å forhindre celleskade. Alternativt kan du forsiktig inverter hele platen og deretter tørke den på rent papir. Arbeid raskt for å unngå celledød.
- Vask cellene to ganger med forhåndsvarslet 200 μL analysemedium. Legg Assay Medium til et sluttvolum på 180 μL per brønn. Inkuber mikroplaten på 96 brønner i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C i 1 time.
- Forbered 10 μM løsninger av mitokondriehemmere i analysemedium. Vær oppmerksom på at den endelige konsentrasjonen etter injeksjon er 1 μM.
- Legg sensorpatronen plassert i den hydrerte mikroplaten med 10x løsninger av mitokondriehemmerne.
- Tilsett 18 μL mitokondriehemmer 1 i port A.
- Tilsett 19,8 μL mitokondriehemmer 2 i port B.
- Tilsett 21,6 μL mitokondriehemmer 2 i port C.
- Tilsett 23,4 μL mitokondriehemmer 3 i port D.
- Plasser den ladde patronen i den hydrerte mikroplaten i en ikke-CO2-inkubator ved 37 °C til starten av analysen.
- Sett opp en kjøreprotokoll i instrumentets programvare (tabell 2).
- Trykk på START. Ta den ladde patronen fra ikke-CO2-inkubatoren og plasser den i analysatoren for kalibrering.
MERK: Pass på at platen er satt inn i riktig retning og uten lokket. - Når kalibreringstrinnet er ferdig, fjerner du kalibreringsplaten. Ta 96-brønns mikroplaten fra ikke-CO2-inkubatoren og plasser den i analysatoren. Klikk på FORTSETT for å starte målingene.
- Når løpet er ferdig, fjern den 96-brønns cellekulturmikroplaten fra analysatoren og samle mediet fra alle brønnene uten å forstyrre cellene.
MERK: Mediet kan oppbevares ved -20 °C og brukes senere til å måle mengden laktat som slippes ut av cellene i mediet ved hjelp av et passende laktatanalysesett. - Vask cellene med 200 μL 1x PBS i hver brønn.
- Etter at du har fjernet PBS, fryser du platen ved -20 °C.
MERK: Den frosne platen kan brukes til å kvantifisere celler, proteiner eller DNA i hver brønn på mikroplaten. Denne kvantifiseringen vil være nødvendig for å normalisere de oppnådde bioenergetiske ratene. Følg produsentens instruksjoner for celle-, protein- eller DNA-kvantifiseringsanalyser.
- På dag 3 etter at du har reparert de dissosierte cellene, tilsett 200 μL kalibreringsløsning i hver brønn i den nederste delen av 96-brønns mikroplaten, og plasser den øverste grønne sensorpatronen på den hydrerte mikroplaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er beskrevet her, letter robust generering av runde organoider (figur 1A). De genererte organoidene inneholder modne nevroner som kan visualiseres ved hjelp av proteinmarkører som er spesifikke for axoner (SMI312) og dendritter (mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP2)) (figur 1B). Eldre organoider inneholder ikke bare nevronceller (MAP2-positive), men også glialceller (f.eks. positive for astrocyttmarkøren S100 kalsiumbindende protein B (S100ß)) (figur 1B).
Ved å analysere skiver hjerneorganoider ved hjelp av konfektmikroskopi, er det mulig å identifisere og overvåke detaljert distribusjon og organisering av ulike celletyper og cellulære strukturer. Dette kan gi ny innsikt i hvordan mitokondriesykdommer kan påvirke utviklingen av nervesystemet. For eksempel er det mulig å overvåke nevronale aksoner (SMI312-positive) og dendritter (MAP2-positive) (figur 2A) eller den gjensidige forekomsten av nevronceller (MAP2-positive) og glialceller (S100ß-positive) (figur 2A). Konfektbilder kan også bidra til å undersøke mer detaljert distribusjon og organisering av nevrale forfedre ((kjønn som bestemmer region Y) boks-2 (SOX2)-positiv) med hensyn til nevroner (beta-III tubulin (TUJ1)-positiv) (figur 2B). Til slutt kan hjerneorganoider farges for mitokondrispesifikke markører (som det ytre mitokondriemembranproteinet, translocase av ytre membran 20 kDa subenhet (TOM20)) (figur 2C).
Den beskrevne protokollen gjør det mulig for forskere å utføre bioenergetisk profilering av hjerneorganoider. Ved hjelp av denne prosedyren er det mulig å måle både mitokondriemetabolismen ved hjelp av oksygenforbruket (OCR) (figur 2D) og glykolytisk metabolisme ved hjelp av den ekstracellulære forsuringshastigheten (ECAR) (figur 2E). Bioenergetisk profilering gjør det mulig å overvåke hvordan celler kan endre sine OCR- og ECAR-profiler som svar på en sekvensiell administrering av mitokondriehemmere.
For det første kan ATP-syntasehemmeren, oligomycin, påføres. Oligomycin forårsaker en nedgang i OCR-profilen (figur 2D) og identifiserer derfor OCR som trengs for ATP-produksjon. Ved oligomycinbehandling kan det også være en kompenserende økning i ECAR (figur 2E), noe som tyder på at cellene kan oppregulere glykolyse for å forhindre metabolsk stress forårsaket av reduksjonen i mitokondriemetabolismen. Den påfølgende doble anvendelsen av protonionofor, karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon (FCCP), forårsaker tap av mitokondriemembranpotensialet. Ettersom oksygenmolekylene nå er frie til å bevege seg, forårsaker dette en rask økning i OCR (figur 2D).
Disse endringene i OCR-profilen identifiserer cellenes maksimale respirasjonskapasitet. Den endelige administrasjonen av rotenon pluss antimycin A forårsaker en blokk av elektrontransporten, og derfor en kraftig reduksjon i OCR (figur 2D). ECAR kan vise svingninger etter behandling med FCCP og rotenon pluss antimycin A (figur 2E), avhengig av cellenes gjenværende glykolytiske kapasitet. OCR- og ECAR-profilene kan endres dramatisk hos hjerneorganoider avledet fra mitokondriepasienter.
Figur 1: Generering av hjerneorganoider fra humane iPSCer. (A) Skjematisk representasjon av protokollen som brukes til å produsere hjerneorganoider med tilsvarende overføringsbilder. Dag 0 tilsvarer dissosiasjon av iPSCer og sådd i en 96-brønnsplate med V-bunn ved hjelp av CDMI supplert med en ROCK-hemmer, en WNT-hemmer og SB431542. På dag 18 overføres nevrosfærer fra 96-brønnsplatene til 100 mm cellekulturretter med CDMII supplert med N2. Fra dette tidspunktet og utover er kulturene plassert på en orbital shaker. På dag 35 byttes mediet fra CDMII til CDMIII, som også inneholder en oppløst matrisekomponent (tabell 1). Fra dag 70 og utover byttes CDMIII til CDMIV supplert med B27. Et representativt neurosphere-bilde ble tatt på dag 12 ved hjelp av et mikroskopkamera med 10x forstørrelse. Et tidlig organoidbilde ble tatt på dag 22 ved hjelp av et mikroskopkamera ved 4x forstørrelse. Et modent organoidbilde ble tatt på dag 40 ved hjelp av et mikroskopkamera med 4x forstørrelse. (B) Den generelle strukturen og cellulær organisering av hjerneorganoider kan visualiseres ved hjelp av bredfeltmikroskopi. Representative sydde bredfeltsbilder vises for å visualisere forholdet mellom dendritter (MAP2-positive) og axoner (SMI312-positive), og mellom nevronceller (MAP2-positive) og antatt astrocytter (S100ß-positiv). Cellene ble motarbeidet med Hoechst for å avsløre kjernene. Alle bildene ble tatt ved hjelp av 78 dager gamle hjerneorganoider. Den høyre kolonnen viser overlegget av tre kanaler (slå sammen). Skalastenger = 500 μm. Forkortelser: iPSC = indusert pluripotent stamcelle; CDM = Kortikale differensieringsmedium; ROCK = Rho kinase; MAP2 = mikrotubule-assosiert protein 2; S100ß= S100 kalsiumbindende protein B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering og bioenergetisk profilering av hjerneorganoider for mitokondriesykdomsmodellering. Den detaljerte organiseringen og arkitekturen av organoider kan analyseres ved hjelp av konfektmikroskopi. Alle bildene ble tatt ved hjelp av 78 dager gamle hjerneorganoider og motstått med Hoechst for å avsløre kjernene. Den høyre kolonnen viser overlegget av tre kanaler (slå sammen). Skalastenger = 50 μm. (A) Representative projeksjoner med utvidet fokus (44-48 optiske plan, 0,6 μm hver) som adresserer samspillet mellom dendritter (MAP2-positive, pilspisser) og aksoner (SMI312-positive, piler) og mellom nevronale celler (MAP2-positive, pilspisser) og antatt astrocytter (S100ß-positive, piler). (B) Representative utvidet fokus projeksjoner (14-31 optiske plan, 0,6 μm hver) viser fordelingen av nevroner (TUJ1-positive, pilspisser) med hensyn til nevrale forfedre (SOX2-positive, piler). (C) Representative projeksjoner med utvidet fokus (20 optiske plan, 0,6 μm hver) som viser fordelingen innen nevroner (TUJ1-positive, pilspisser) av mitokondrier (visualisert ved hjelp av antistoffer mot det ytre mitokondriemembranproteinet TOM20, piler). (D) Mitokondrie respirasjon av hjerneorganoider kan overvåkes basert på profilen til OCR etter sekvensiell administrering av forskjellige mitokondriehemmere (se tekst for detaljer). (E) Glykolytisk aktivitet av hjerneorganoider kan overvåkes basert på ECAR ved sekvensiell administrering av mitokondriehemmere (se tekst for detaljer). For bioenergetisk profilering ble ca. 10-15 hjerneorganoider dissosiert for å få nok celler til replating på 96-brønns mikroplaten. Stolpene angir SEMs basert på resultatene oppnådd i to uavhengige eksperimenter. Forkortelser: MAP2 = mikrotubule-assosiert protein 2; S100ß = S100 kalsiumbindende protein B; TUJ1 = beta-III tubulin; SOX2 = (kjønn som bestemmer region Y) boks-2; TOM20 = translocase av ytre membran 20 kDa underenhet; OCR = oksygenforbruk; ECAR = ekstracellulær forsuringshastighet; Oligom. = oligomycin; FCCP = carbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon; R = rotenon; AntA = Antimycin A; SEMs = standard feil av midler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mediesammensetning | |||
| CDMI (Dag 0-18) | Siste innrømmelse. | ||
| Glasgow-MEM | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Knockout serum erstatning (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (MEM ikke-essensiell aminosyreoppløsning) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Natrium Pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| 2-mercaptetanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml og 100 μg/ml |
| CDMII (Dag 18-35) | Siste innrømmelse. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillegg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kjemisk definert lipidkonsentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml og 100 μg/ml |
| CDMIII (Dag 35-70) | Siste innrømmelse. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillegg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kjemisk definert lipidkonsentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml og 100 μg/ml |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV (dag 70+) | Siste innrømmelse. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| N-2 Tillegg (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Kjemisk definert lipidkonsentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin og streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml og 100 μg/ml |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| B-27 supplement med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Nevronalt medium | Siste innrømmelse. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | [1x] |
| B-27 supplement med vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| L-askorbinsyre | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (dibutyryl syklisk adenosinmonofosfat) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (hjerne-avledet nøytrotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/ml] |
| GDNF (glialcellelinje-avledet nevrotrofisk faktor) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/ml] |
| Human TGF-β3 (transformerende vekstfaktor-beta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/ml] |
| Analysemedium | Siste innrømmelse. | ||
| Seahorse XF DMEM medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | 500 ml |
| Natrium Pyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| L-Glutamin | Lonza | BEBP17-605E | 2 mM |
| Glukose | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 mM |
| Blokkeringsløsning | Siste innrømmelse. | ||
| PBS-Tween | [1:1] 0,1 % Tween | ||
| Esel serum | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | 1% |
Tabell 1: Detaljer om medier og løsninger som brukes til organoid generering.
| Initialisering | Opprinnelig plan (X3) | Oligomycin injeksjon (X3) | FCCP-injeksjon (X3) | FCCP-injeksjon (X3) | Anti A + rotinjeksjon (X3) |
| Kalibrere | Blande | Blande | Blande | Blande | Blande |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Likevekt (12:00) | Vent | Vent | Vent | Vent | Vent |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Mål (03:00) | Mål (03:00) | Mål (03:00) | Måle | Mål (03:00) | |
| (03:00) |
Tabell 2: Protokolloppsett for bioenergetisk profilering. Beskrivelse av trinnene og lengden på dem på få minutter ved hjelp av Seahorse Wave Desktop-programvaren. Forkortelser: FCCP = carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; Rot = rotenon; Anti A = Antimycin A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver den reproduserbare generasjonen av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk for mitokondriesykdomsmodellering. Protokollen som er beskrevet her, endres basert på et tidligere publisert arbeid20. En stor fordel med den nåværende protokollen er at den ikke krever manuell innebygging av hvert organoid i en stillasmatrise. Faktisk er matriseløsningen ganske enkelt oppløst i cellekulturmediet. Videre er det ikke nødvendig å bruke dyre bioreaktorer, da organoider kan dyrkes i standard vevskultur 6-brønnsplater plassert på en orbital shaker inne i inkubatoren. Denne prosedyren muliggjør også parallell dyrking av flere plater som inneholder forskjellige organoider avledet fra ulike individuelle linjer, og dermed øker gjennomstrømningen av forsøkene og tillater overvåking av potensielle forskjeller som dukker opp i vekstprofilene til forskjellige organoider. Vi testet denne protokollen ved hjelp av forskjellige iPSCer avledet fra sunne kontroller og personer som er rammet av mitokondriesykdommer, med konsistente resultater.
For mitokondriesykdomsmodellering er det viktig å bruke forskjellige markører for å visualisere morfologien og organiseringen av mitokondrienettverket. Denne prosedyren muliggjør undersøkelse av om mitokondrienummer, morfologi eller distribusjon kan endres hos hjerneorganoider avledet fra pasienter med mitokondriesykdommer. Tilstedeværelsen og organiseringen av nevrale forfedre i hjernen organoider kan være av avgjørende betydning for modellering av mitokondrieforstyrrelser. Vi oppdaget nylig at mutasjoner som forårsaker mitokondriesykdommen, Leighs syndrom, forstyrrer cellulær arkitektur og distribusjon av nevrale stamceller i pasientavledede hjerneorganoider18.
For å utføre bioenergetisk profilering har vi tilpasset en metode som tidligere ble beskrevet for å vurdere bioenergetikken til pluripotente stamceller21. En nylig protokoll beskrev hvordan man utfører bioenergetisk profilering av organoider avledet fra musens tynntarmen, human kolon og kolorektale svulster22. Imidlertid er disse organoidene ganske små sammenlignet med hjerneorganoider, og derfor er det nødvendig med en annen protokoll, som den som er rapportert her, for hjerneorganoider. Vi brukte nylig denne protokollen for å vurdere den bioenergetiske profilen til humane hjerneorganoider som bærer mutasjoner i surfeit locus protein 1-genet (SURF1) som forårsaker den alvorlige mitokondriesykdommen, Leigh syndrom18. Vi fant at OCR-profilen er spesielt påvirket av Leighs syndromorganoider, som vist ved en betydelig reduksjon i basal OCR-nivået, ATP-produksjonshastigheten og maksimal respirasjonsrate18.
Til slutt presenterer vi her en detaljert protokoll for robust generering av humane hjerneorganoider og beskriver hvordan man utfører eksperimenter som vil være viktige for undersøkelsen av sykdomsmekanismene som ligger til grunn for mitokondriesykdommer. Humane hjerneorganoider kan også være av kritisk betydning for å belyse mitokondriemangfoldet i den menneskelige hjerne og dens rolle i menneskers helse og sykdommer23. Det er viktig å klargjøre at hjerneorganoider generert med tilgjengelige protokoller, inkludert den som er beskrevet her, fortsatt bærer begrensninger. Disse inkluderer for eksempel mangel på vaskularisering og fravær av mikroglia populasjon24. Disse aspektene må tas i betraktning for å tolke resultatene riktig.
For eksempel kan mangelen på vaskulatur og mikroglia begrense kompenserende mekanismer som kan være på plass in vivo. Pasientavledede hjerneorganoider kan dermed vise feil som er sterkere enn de som observeres hos pasienter17,18. Videre, til tross for en generell reproduserbarhet av denne protokollen20, kan linje-til-linje heterogenitet observeres. For dette formål, når du utfører sykdomsmodelleringsstudier, er det alltid viktig å systematisk kvantifisere ensartetheten av kontroll og pasientorganoider ved å vurdere morfologimønstrene (størrelse, lag) og fordelingen av molekylære markører på tvers av forskjellige organoider.
Til slutt er det ikke mulig å generere hjerneorganoider fra en enkelt iPSC, noe som begrenser muligheten for storskala genetisk screening med CRISPR / Cas9. Gitt tempoet i forskningen, er det sannsynlig at noen av de nåværende begrensningene i protokollen som er beskrevet her, snart vil bli overvunnet. Optimaliserte protokoller blir tilgjengelige. Disse 3D-modellene av mitokondriesykdommer vil forhåpentligvis muliggjøre den endelige oppdagelsen av implementerbare terapier for mitokondriesykdommer, som er skadelige, og for uhelbredelige sykdommer med svært udekkede medisinske behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske eller ikke-finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Miriam Bünning for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 til A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD til A.P.), og det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) (e: Bio ung etterforsker gi AZ 031L0211 til A.P.). Arbeidet i laboratoriet til C.R.R. ble støttet av DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A.
- Gorman, G. S., et al.
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J.
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
