Summary
Мы описываем подробный протокол генерации индуцированных человеком плюрипотентных органоидов мозга, полученных из стволовых клеток, и их использование в моделировании митохондриальных заболеваний.
Abstract
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма и в настоящее время неизлечимы. Эти заболевания вызывают дефекты развития нервной системы, основные механизмы которых еще предстоит выяснить. Основным препятствием является отсутствие эффективных моделей, повторяющих раннее нарушение нейронов, наблюдаемое у пациентов. Достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) позволяют генерировать трехмерные (3D) органоиды мозга, которые могут быть использованы для исследования влияния заболеваний на развитие и организацию нервной системы. Исследователи, в том числе эти авторы, недавно представили органоиды человеческого мозга для моделирования митохондриальных расстройств. В этой статье сообщается о подробном протоколе для надежной генерации органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использовании в митохондриальном биоэнергетическом профилировании и анализе изображений. Эти эксперименты позволят использовать органоиды мозга для исследования метаболических дисфункций и дисфункций развития и могут предоставить важную информацию для препарирования нейронной патологии митохондриальных заболеваний.
Introduction
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма1. Они вызваны генетическими мутациями, нарушающими различные митохондриальные процессы, включая окислительное фосфорилирование (OXPHOS)2, сборку дыхательной цепи, митохондриальную динамику и транскрипцию или репликацию митохондриальной ДНК3. Ткани с энергетическими потребностями особенно страдают от митохондриальной дисфункции4. Соответственно, у пациентов с митохондриальными заболеваниями обычно развиваются ранние неврологические проявления.
В настоящее время нет доступных методов лечения для детей, страдающих митохондриальными заболеваниями5. Основным препятствием для разработки лекарств от митохондриальных заболеваний является отсутствие эффективных моделей, повторяющих течение болезни человека6. Некоторые из изученных в настоящее время животных моделей не демонстрируют неврологических дефектов, присутствующих у пациентов7. Следовательно, механизмы, лежащие в основе нейронной патологии митохондриальных заболеваний, до сих пор не до конца поняты.
Недавние исследования генерировали ИПСК у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, и использовали эти клетки для получения специфических для пациента нейрональных клеток. Например, было обнаружено, что генетические дефекты, связанные с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, вызывают аберрации в клеточной биоэнергетике8,9, синтезе белка10 и гомеостазе кальция9,11. Эти отчеты предоставили важные механистические подсказки о нарушениях нейронов, происходящих при митохондриальных заболеваниях, проложив путь к открытию лекарств для этих неизлечимых заболеваний12.
Двумерные (2D) культуры, однако, не позволяют исследовать архитектурную сложность и региональную организацию 3D-органов13. С этой целью использование 3D-органоидов мозга, полученных из специфических для пациента iPSCs14, может позволить исследователям получить дополнительную важную информацию и тем самым помочь проанализировать, как митохондриальные заболевания влияют на развитие и функцию нервной системы15. Исследования с использованием органоидов головного мозга, полученных из iPSC, для изучения митохондриальных заболеваний начинают раскрывать компоненты развития нервной системы митохондриальных заболеваний.
Органоиды спинного мозга, несущие мутации, связанные с митохондриальным заболеванием, митохондриальной энцефалопатией, лактоацидозом и синдромом инсультоподобных эпизодов (MELAS), показали дефектный нейрогенез и задержку дифференцировки двигательных нейронов16. Корковые органоиды, полученные от пациентов с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, показали уменьшенные размеры, дефекты генерации нервных эпителиальных почек и потерю корковой архитектуры17. Органоиды головного мозга у пациентов с синдромом Ли показали, что дефекты заболевания инициируются на уровне нейронных клеток-предшественников, которые не могут фиксировать митохондриальный метаболизм, вызывая аберрантное ветвление нейронов и морфогенез18. Таким образом, нейронные предшественники могут представлять собой клеточную терапевтическую мишень для митохондриальных заболеваний, а стратегии, способствующие их митохондриальной функции, могут поддерживать функциональное развитие нервной системы.
Использование органоидов мозга может помочь раскрыть компоненты нейроразвития митохондриальных заболеваний. Митохондриальные заболевания в основном рассматриваются как раннее начало нейродегенерации5. Однако дефекты развития нервной системы также присутствуют у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, включая задержку развития и когнитивные нарушения19. Органоиды мозга, специфичные для пациента, могут помочь решить эти аспекты и прояснить, как митохондриальные заболевания могут влиять на развитие мозга человека. Митохондриальная дисфункция может также играть патогенетическую роль в других более распространенных неврологических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона4. Следовательно, выяснение влияния митохондриальных дефектов на нервное развитие с использованием органоидов мозга также может сыграть важную роль в изучении этих заболеваний. В этой статье описывается подробный протокол генерации воспроизводимых органоидов головного мозга, которые могут быть использованы для проведения моделирования заболеваний митохондрий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование человеческих ИПСК может потребовать этического одобрения. IPSCs, используемые в этом исследовании, были получены от здоровых контрольных лиц после местного этического одобрения (#2019-681). Все процедуры культивирования клеток должны выполняться под стерильным клеточным культиватором, тщательно дезинфицируя все реагенты и расходные материалы перед переносом под капот. Человеческие ИПСК, используемые для дифференциации, должны иметь число проходов ниже 50, чтобы избежать потенциальных геномных аберраций, которые могут возникнуть при обширной культуре. Плюрипотентное состояние клеток должно быть подтверждено до генерации органоидов, например, путем мониторинга экспрессии маркеров, связанных с плюрипотентностью, таких как NANOG или OCT4. Тесты на микоплазму следует проводить еженедельно, чтобы обеспечить культуры без микоплазмы.
1. Генерация органоидов головного мозга
- Культура человеческих ИПСК
- Культивируйте человеческие ИПСК в условиях, свободных от кормителей, в среде iPSC (см. Таблицу материалов) на покрытых 6-луночными пластинами и храните их в инкубаторе культуры увлажненных тканей при 37 °C и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос питательных клеток может препятствовать дифференцировке органоидов. Прохождение клеток по крайней мере один раз в условиях, свободных от кормушки. - Проходят иПСК при 80% слиянии с использованием безферментной отслойной среды в соотношениях от 1:4 до 1:12. Чтобы увеличить выживаемость клеток, добавляют 10 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора протеинкиназы (ROCK) (Y27632) после каждого расщепления.
- Культивируйте человеческие ИПСК в условиях, свободных от кормителей, в среде iPSC (см. Таблицу материалов) на покрытых 6-луночными пластинами и храните их в инкубаторе культуры увлажненных тканей при 37 °C и 5% CO2.
- Диссоциация iPSCs (80% слияния) - День 0.
- Готовят кортикальную дифференцировочную среду I (CDMI) (табл. 1). Передогреваемую среду CDMI при комнатной температуре (22-25 °C) перед добавлением ее в ячейки.
- Промывайте колодцы, содержащие ИПСК, фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления мертвых клеток и мусора.
- Добавьте 500 мкл предварительно расплавленного реагента А (Таблица материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться в отсоединении клеток.
- Добавляют 1 мл среды iPSC для разбавления реагента А для нейтрализации его активности.
- Используйте пипетку объемом 1000 мкл для диссоциации клеток путем пипетирования вверх и вниз и переноса клеточной суспензии в трубку центрифуги объемом 15 мл.
- Осторожно центрифугируйте иПСК при 125 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (22-25 °C).
- Осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не нарушить клеточную гранулу.
- Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл CDMI для получения одноклеточной суспензии и подсчитайте номер ячейки.
- Готовят посевную среду с 9000 иПСК на 100 мкл в CDMI, дополненную ингибитором ROCK 20 мкМ, ингибитором WNT-катенина 3 мкМ (IWR1) и 5 мкМ SB431542.
- Добавьте 100 мкл посевной среды на скважину к пластине с v-образным дном из 96 лунок.
- Храните пластину в инкубаторе культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
- Генерация нейросферы
- На 1-й день наблюдайте, что формируются круглые клеточные агрегаты (невросферы) с определенными гладкими границами. Обратите внимание на мертвые клетки вокруг агрегатов. Продолжают культивировать в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- На 3-й день перемешайте тарелку, постукивая по бокам три раза, чтобы отделить мертвые клетки.
- Добавьте 100 мкл CDMI, дополненного ингибитором ROCK 20 мкМ, 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 к каждой лунке.
- Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
- На 6 день осторожно удалите 80 мкл надопоставленной среды из каждой лунки. Избегайте прикосновения к дну колодца.
- Добавьте 100 мкл CDMI с добавлением 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 в каждую лунку. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
- Повторяйте шаги 5 и 6 каждые 3 дня до 18 дня.
- Перенос невросфер
- На 18-й день подготовьте кортикальную дифференцировочную среду II (CDMII) (таблица 1) и добавьте 10 мл в 100 мм ультранизкую пластину для культивирования клеток.
- Используйте пипетку объемом 200 мкл с отрезанным наконечником, чтобы перенести круглые невросферы с 96-луночной пластины на 100-миллиметровую пластину для культивирования клеток со сверхнизким прикреплением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать повреждения невросфер, убедившись, что отверстие наконечника достаточно широкое и что агрегаты не аспирируются слишком быстро. - Удалите 5 мл среды из пластины, содержащей невросферы, и добавьте 5 мл свежего CDMII.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура помогает уменьшить количество среды CDMI, которая, возможно, перешла от переноса невросфер. - Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите невросферы на следующий день. Увеличьте скорость орбитального шейкера, если невросферы слипнуты вместе или прикреплены к нижней части пластины. - Каждые 3 дня тщательно аспирируйте надосадочную среду и заменяйте ее свежим CDMII. Оставьте небольшое количество среды, чтобы предотвратить высыхание невросфер.
- На 35-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду III (CDMIII) (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Компонент матрицы должен быть растворен в холодном CDMIII. - Аспирируйте среду из пластины и добавьте 10 мл холодного CDMIII.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более эффективно использовать холодную среду, чтобы компонент матрицы мог покрывать органоиды, не образуя сгустков. - После изменения среды поместите пластину обратно на орбитальный шейкер при 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% CO2.
- Меняйте среду каждые 3-5 дней в зависимости от скорости роста, на что указывает цвет среды.
- На 70-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду IV (CDMIV) (таблица 1). Используйте среду CDMIV до тех пор, пока не будет достигнут желаемый возраст органоидов. В течение этого периода держите пластину на орбитальном шейкере, установленном при 70 оборотах в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани (37 ° C и 5% CO2).
- Меняйте среду каждые 3-5 дней, в зависимости от скорости роста.
2. Иммуноокрашивание органоидов головного мозга
- Подготовка тканей
- Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его под защитную оболочку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной безопасности при работе с PFA. - Соберите органоиды мозга и аккуратно перенесите их с помощью пластиковой пипетки Пастера с тупым наконечником 3 мл на 6-луночную пластину, заполненную PFA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органоиды старше 40 дней, чтобы обеспечить визуализацию структур с более высокой клеточной сложностью. - Выдерживают органоиды в растворе PFA в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Осторожно удалите PFA пластиковой пипеткой Пастера объемом 3 мл и трижды вымойте неподвижные органоиды с помощью PBS.
- Храните фиксированные органоиды при температуре 4 °C в PBS до дальнейшего использования.
- Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его под защитную оболочку.
- Приготовление органоидных срезов головного мозга
- Приготовьте 3% раствор агара и медленно нагревайте до разжижения.
- Поместите форму (вырезанный конец шприца объемом 10 мл) на кусок абсорбирующей фильтровальной бумаги (гладкая сторона вверх). Поместите на него каплю агара.
- Быстро достаньте один органоид из 6-луночной пластины шпателем и удалите лишний PBS фильтровальной бумагой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не касаться органоида непосредственно фильтровальной бумагой. - Поместите органоид на каплю агара.
- Повторите эту процедуру с тремя органоидами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы избежать затвердевания агара на этом этапе. - Заправляйте форму агаром до тех пор, пока все органоиды не будут полностью покрыты.
- Подождите, пока агар начнет затвердевать, а затем аккуратно перенесите всю форму, содержащую органоиды, включая абсорбирующую фильтровальную бумагу, на охлаждающий элемент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлаждающий элемент недоступен, храните органоиды в течение нескольких минут в холодильнике при температуре 4 °C. - А пока подготовьтесь к процедуре нарезки: поместите лезвие бритвы (очищенное ацетоном и промытое двойной дистиллированной водой) в держатель вибратома, установите на ванну и наполните его PBS.
- Удалите плесень из (затвердевшего) агара и используйте скальпель, чтобы обрезать его, чтобы сформировать куб.
- Прикрепите куб агара, содержащий органоиды, к несущей пластине вибратома с помощью адгезивного геля (см. Таблицу материалов) и поместите его в ванну, содержащую PBS.
- Отрегулируйте вибратом (см. Таблицу материалов) для резки срезов толщиной 150 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки вибратома (правильный угол, амплитуда, частота и скорость лезвия) могут быть аналогичны тем, которые используются для нарезки фиксированной мозговой ткани, полученной от ранних постнатальных животных. Тем не менее, идеальные настройки сильно зависят от типа вибратома и должны быть определены на первом этапе, чтобы предотвратить искажение или даже разрыв ткани во время разреза. - Начните процедуру резки. Используйте стеклянную пипетку или шпатель, чтобы аккуратно перенести каждый свеженарезанный кусочек в 24-луночную тарелку, наполненную PBS.
- Храните пластину, содержащую ломтики, при 4 °C (до нескольких дней) до дальнейшей обработки.
- Переложите кусочки из тарелки стеклянной пипеткой или шпателем на предметные стекла микроскопа. Используйте не менее 2 фрагментов на слайд.
- Аккуратно удалите агар и излишки ПБС шприцем.
- Дайте ломтикам высохнуть, пока они не прилипнут к слайдам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предметные стекла микроскопа можно хранить в пластиковых камерах, заполненных PBS при 4 °C, они должны быть окрашены как можно скорее после процедуры нарезки.
- Иммуногистохимическое окрашивание
- Подготовьте блокирующий раствор (табл. 1).
- Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать гидрофобную границу вокруг срезов на слайде, чтобы сохранить все решения на слайдах.
- Осторожно добавляют блокирующий раствор на горку, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре (22-25 °С). Чтобы избежать разрушения ткани, не добавляйте раствор непосредственно поверх ломтиков.
- Аспирировать блокирующий раствор и применять желаемое первичное антитело, разведенное в блокирующем растворе.
- Инкубируйте горку в течение ночи в увлажненной камере при 4 °C.
- Промойте слайд три раза с 1x PBS в течение 10 минут каждый.
- Инкубируют срезы со специфическим вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе, и выполняют окрашивание Hoechst (1:2,500) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте выполнить отрицательные элементы управления, чтобы подтвердить, что нет неспецифического связывания или автофлуоресценции. - Смойте три раза 1x PBS в течение 10 минут каждый в темноте.
- Добавьте одну каплю монтажной среды к срезу, поместите крышку на край капли и медленно положите крышку вниз к срезу, чтобы избежать пузырьков воздуха.
- Дайте слайду отдохнуть ночью при комнатной температуре. Нанесите лак для ногтей на границу обшивки, чтобы еще больше запечатать слайд. Для длительного хранения хранить при температуре 4 °C.
- Документация по окрашиванию
- Для сканирования больших изображений на предмет сшивания используйте моторизованный вертикальный широкоугольный микроскоп, оснащенный (см. Таблицу материалов для деталей) высококачественным объективом; Набор фильтров DAPI (например, возбуждение (EX): 340-380 нм, дихроичное зеркало (DM): 400 нм, барьерный фильтр (BA): 435-485 нм); набор флуоресцеиновых изотиоцианатных фильтров (например, EX: 465-495 нм, DM: 505 нм, BA: 515-555 нм); Набор фильтров Alexa594 (например, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); цифровой фотоаппарат; высокопроизводительное программное обеспечение для сбора, позволяющее автоматизировать стежки и стековые операции.
- Для обработки изображений используйте программу обработки изображений, способную генерировать 8-битные tif-файлы, обрезать стежки, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный) и добавлять шкалы масштаба.
- Для сканирования деталей используйте моторизованный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный высококачественным объективом, УФ-лазер (EX: 408 нм), аргоновый лазер (EX: 488 нм), гелий-неоновый лазер (EX: 543), программное обеспечение для визуализации для конфокального микроскопа.
- Для обработки деталей изображения используйте программу обработки изображений, способную генерировать проекции максимальной интенсивности конфокальных z-стеков (например, оптических секций по 0,6 мкм каждый), генерировать 8-битные tif-файлы, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный), добавлять шкалы масштаба.
- Используйте графический редактор для упорядочения фигур.
3. Биоэнергетическое профилирование органоидов головного мозга
- Подготовка органоидов для биоэнергетического профилирования
- Подготовьте раствор папаина и ДНКазы в соответствии с протоколом производителя.
- Переведите 3-5 органоидов в 6-луночную пластину. Вымойте их два раза с помощью предварительно расплавленного PBS.
- Добавьте 2 мл предварительно расплавленного активированного раствора папаина, содержащего ДНКазу. С помощью лезвия разрежьте органоиды на мелкие кусочки.
- Поместите пластину на орбитальный шейкер, установленный при 27 об/мин внутри инкубатора клеточной культуры (при 37 °C, 5% CO2), и инкубируйте в течение 15-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от органоидной стадии. Органоиды ранней стадии могут быть использованы такими, какие они есть. Для органоидов старше 3 месяцев рекомендуется разрезать органоиды на 2-3 части перед диссоциацией и инкубировать кусочки со скоростью раскачивания, установленной при 27 об/мин в течение 15-20 мин при 37 °C. Эта процедура может помочь удалить некротическую ткань, которая может присутствовать в органоидах более поздней стадии. - Соберите переваренные ткани в пробирку объемом 15 мл и добавьте 5 мл органоидной культуральной среды CDMIV (таблица 1).
- Тритурируйте ткань пластиковой пипеткой объемом 10 мл, пипеткой вверх и вниз 10-15 раз. Дайте недиссоциированной ткани осесть на дно трубки.
- Осторожно перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, избегая любых кусочков недиссоциированной ткани. Отфильтруйте раствор через 40-мкм клеточный сетчатый фильтр (например, полистирольные трубки круглого дна с крышками клеточного сетчатого фильтра).
- Гранулируют ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Оцените количество и качество клеток с помощью трипан-синего цвета.
- Нанесите желаемое количество (~20 000/лунка) ячеек на покрытые 96-луночными микропластинами. Изменение среды через 6-8 ч после нанесения покрытия на нейронную среду (табл. 1).
- Инкубировать микропластину с покрытием из 96 лунок в CO2-инкубаторе (37 °C, 5% CO2) в течение 4 дней.
- Биоэнергетическое профилирование
- На 3-й день после повторного покрытия диссоциированных клеток добавьте 200 мкл калибровочного раствора в каждую лунку нижней части 96-луночной микропластины и поместите верхний зеленый картридж датчика на гидратированную микропластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите картридж датчика поверх микропластины в правильной ориентации и убедитесь, что калибрант покрывает все датчики. - Инкубируйте гидратированную 96-луночную микропластину в инкубаторе без CO2 при 37 °C в течение ночи.
- Включите анализатор, чтобы прибор стабилизировался при 37 °C в течение ночи.
- На 4-й день после повторного покрытия осмотрите диссоциированную органоидную культуру на 96-луночной микропластине под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки выглядят как сливающийся монослой.
- Подготовьте пробирную среду (табл. 1).
- Удалите нейронную среду из всех лунок с помощью пипетки, не касаясь дна лунки, чтобы предотвратить повреждение клеток. Кроме того, осторожно переверните всю пластину, а затем высушите ее на чистой бумаге. Работайте быстро, чтобы избежать гибели клеток.
- Дважды промыть клетки предварительно расплавленным 200 мкл пробирной среды. Добавьте пробирную среду к конечному объему 180 мкл на скважину. Инкубируйте 96-луночную микропластину в инкубаторе без CO2 при 37 °C в течение 1 ч.
- Готовят 10 мкМ растворов митохондриальных ингибиторов в пробирной среде. Отметим, что конечная концентрация после инъекции составляет 1 мкМ.
- Загрузите картридж датчика, помещенный в гидратированную микропластинку, 10-кратными растворами митохондриальных ингибиторов.
- Добавьте 18 мкл митохондриального ингибитора 1 в порт А.
- Добавьте 19,8 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт B.
- Добавьте 21,6 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт С.
- Добавьте 23,4 мкл митохондриального ингибитора 3 в порт D.
- Поместите заряженный картридж в гидратированную микропластинку в инкубаторе без CO2 при температуре 37 °C до начала анализа.
- Настройте работающий протокол в программном обеспечении прибора (таблица 2).
- Нажмите кнопку СТАРТ. Возьмите заряженный картридж из инкубатора без CO2 и поместите его в анализатор для калибровки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пластина вставлена в правильной ориентации и без крышки. - Как только этап калибровки закончится, снимите калибровочную пластину. Возьмите 96-луночную микропластину из инкубатора без CO2 и поместите ее в анализатор. Нажмите ПРОДОЛЖИТЬ , чтобы начать измерения.
- Когда пробег будет завершен, извлеките микропластину 96-луночной клеточной культуры из анализатора и соберите среду из всех лунок, не нарушая клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может храниться при -20 °C и использоваться позже для измерения количества лактата, высвобождаемого клетками в среде, с использованием соответствующего набора для анализа лактата. - Промывайте ячейки 200 мкл 1x PBS в каждой лунке.
- После удаления PBS заморозьте пластину при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная пластина может быть использована для количественной оценки клеток, белков или ДНК в каждой лунке микропластины. Эта количественная оценка понадобится для нормализации полученных биоэнергетических норм. Следуйте инструкциям производителя для количественных анализов клеток, белков или ДНК.
- На 3-й день после повторного покрытия диссоциированных клеток добавьте 200 мкл калибровочного раствора в каждую лунку нижней части 96-луночной микропластины и поместите верхний зеленый картридж датчика на гидратированную микропластину.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, облегчает надежную генерацию круглых органоидов (рисунок 1A). Генерируемые органоиды содержат зрелые нейроны, которые можно визуализировать с помощью белковых маркеров, специфичных для аксонов (SMI312) и дендритов (микротрубоче-ассоциированный белок 2 (MAP2)) (Рисунок 1B). Зрелые органоиды содержат не только нейронные клетки (MAP2-положительные), но и глиальные клетки (например, положительные для астроцита маркера S100 кальций-связывающего белка B (S100ß)) (Рисунок 1B).
Анализируя разрезанные органоиды мозга с помощью конфокальной микроскопии, можно идентифицировать и контролировать подробное распределение и организацию различных типов клеток и клеточных структур. Это может дать новое представление о том, как митохондриальные заболевания могут повлиять на развитие нервной системы. Например, можно контролировать нейронные аксоны (SMI312-положительные) и дендриты (MAP2-положительные) (Рисунок 2A) или взаимное возникновение нейрональных клеток (MAP2-положительных) и глиальных клеток (S100ß-положительных) (Рисунок 2A). Конфокальные изображения могут также помочь более подробно исследовать распределение и организацию нейронных предшественников ((определяющая пол область Y) box-2 (SOX2)-положительная) по отношению к нейронам (бета-III тубулин (TUJ1)-положительный) (рисунок 2B). Наконец, органоиды мозга могут быть окрашены для митохондрий-специфических маркеров (таких как белок внешней митохондриальной мембраны, транслоказ наружной мембраны субъединицы 20 кДа (TOM20)) (Рисунок 2C).
Описанный протокол позволяет исследователям выполнять биоэнергетическое профилирование органоидов мозга. Используя эту процедуру, можно измерить как митохондриальный метаболизм с использованием скорости потребления кислорода (OCR) (рисунок 2D), так и гликолитический метаболизм с использованием скорости внеклеточного подкисления (ECAR) (рисунок 2E). Биоэнергетическое профилирование позволяет контролировать, как клетки могут модифицировать свои профили OCR и ECAR в ответ на последовательное введение митохондриальных ингибиторов.
Во-первых, может применяться ингибитор АТФ-синтазы, олигомицин. Олигомицин вызывает падение профиля OCR (рисунок 2D) и, следовательно, идентифицирует OCR, необходимый для производства АТФ. При лечении олигомицином также может наблюдаться компенсаторное увеличение ECAR (рисунок 2E), предполагающее, что клетки могут повышать гликолиз, чтобы предотвратить метаболический стресс, вызванный снижением митохондриального метаболизма. Последующее двойное применение протонного ионофора, карбонильного цианида-p-трифторметоксифенилгидразона (FCCP), вызывает потерю митохондриального мембранного потенциала. Поскольку молекулы кислорода теперь могут свободно двигаться, это вызывает быстрое увеличение OCR (рисунок 2D).
Эти изменения в профиле OCR определяют максимальную дыхательную способность клеток. Конечное введение ротенона плюс антимицин А вызывает блокирование переноса электронов и, следовательно, резкое снижение OCR (рисунок 2D). ECAR может демонстрировать колебания после лечения FCCP и ротеноном плюс антимицин А (Рисунок 2Е) в зависимости от остаточной гликолитической емкости клеток. Профили OCR и ECAR могут быть резко изменены в органоидах головного мозга, полученных от митохондриальных пациентов.
Рисунок 1: Генерация органоидов мозга из человеческих ИПСК. (А) Схематическое представление протокола, используемого для получения органоидов мозга с соответствующими изображениями передачи. День 0 соответствует диссоциации ИПСК и посеву в 96-луночную пластину с V-дном с использованием CDMI, дополненного ингибитором ROCK, ингибитором WNT и SB431542. На 18-й день невросферы переносят с 96-луночных пластин на 100 мм клеточных культур с CDMII, дополненным N2. С этого момента культуры позиционируются на орбитальном шейкере. На 35-й день среда переключается с CDMII на CDMIII, которая также содержит растворенный компонент матрицы (таблица 1). С 70-го дня CDMIII переключается на CDMIV, дополненный B27. Репрезентативное изображение нейросферы было сделано на 12-й день с помощью камеры микроскопа с 10-кратным увеличением. Раннее органоидное изображение было сделано на 22-й день с использованием камеры микроскопа с 4-кратным увеличением. Зрелое органоидное изображение было сделано на 40-й день с помощью камеры микроскопа с 4-кратным увеличением. (B) Общую структуру и клеточную организацию органоидов мозга можно визуализировать с помощью широкоугольной микроскопии. Показаны репрезентативные сшитые широкоугольные изображения для визуализации отношений между дендритами (MAP2-положительными) и аксонами (SMI312-положительными), а также между нейронными клетками (MAP2-положительными) и предполагаемыми астроцитами (S100ß-положительными). Клетки были контрокрашены с Хёхстом, чтобы выявить ядра. Все снимки были сделаны с использованием 78-дневных органоидов мозга. В правом столбце показано наложение трех каналов (слияние). Шкала стержней = 500 мкм. Сокращения: iPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; CDM = кортикальная дифференцирующая среда; ROCK = Рокиназа; MAP2 = белок, ассоциированный с микротрубочками 2; S100ß= S100 кальций-связывающий белок B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация и биоэнергетическое профилирование органоидов головного мозга для моделирования митохондриальных заболеваний. Детальная организация и архитектура органоидов могут быть проанализированы с помощью конфокальной микроскопии. Все изображения были сделаны с использованием 78-дневных органоидов мозга и контрокрашены с Помощью Hoechst, чтобы выявить ядра. В правом столбце показано наложение трех каналов (слияние). Шкала баров = 50 мкм. (A) Репрезентативные проекции с расширенным фокусом (44-48 оптических плоскостей, по 0,6 мкм каждая), направленные на взаимодействие между дендритами (MAP2-положительными, наконечниками стрел) и аксонами (SMI312-положительные, стрелки), а также между нейронными клетками (MAP2-положительные, наконечники стрел) и предполагаемыми астроцитами (S100ß-положительные, стрелки). (B) Репрезентативные проекции с расширенным фокусом (14-31 оптическая плоскость, по 0,6 мкм каждая), показывающие распределение нейронов (TUJ1-положительные, наконечники стрел) относительно нейронных предшественников (SOX2-положительные, стрелки). (C) Репрезентативные проекции с расширенным фокусом (20 оптических плоскостей, по 0,6 мкм каждая), показывающие распределение внутри нейронов (TUJ1-положительные, наконечники стрел) митохондрий (визуализируются с использованием антител против белка внешней митохондриальной мембраны TOM20, стрелки). (D) Митохондриальное дыхание органоидов головного мозга можно контролировать на основе профиля OCR после последовательного введения различных митохондриальных ингибиторов (см. текст для деталей). (E) Гликолитическая активность органоидов головного мозга может контролироваться на основе ECAR при последовательном введении митохондриальных ингибиторов (см. текст для деталей). Для биоэнергетического профилирования примерно 10-15 органоидов мозга были диссоциированы, чтобы получить достаточное количество клеток для повторного нанесения на 96-луночную микропластину. Полосы обозначают SEM на основе результатов, полученных в двух независимых экспериментах. Сокращения: MAP2 = микротрубочки-ассоциированный белок 2; S100ß = S100 кальций-связывающий белок B; TUJ1 = бета-III тубулин; SOX2 = (область, определяющая пол Y) box-2; TOM20 = транслоказ наружной мембраны 20 кДа субъединицы; OCR = норма потребления кислорода; ECAR = скорость внеклеточного подкисления; Олигом. = олигомицин; FCCP = карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; R = ротенон; AntA = антимицин А; SEM = стандартная погрешность средних значений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Медиа Композиция | |||
| CDMI (День 0-18) | Окончательный конспект. | ||
| Глазго-MEM | Гибко | 11710-035 | [1:1] |
| Замена нокаутирующей сыворотки (KSR) | Гибко | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (раствор заменимых аминокислот MEM) | Гибко | 11140-050 | 0.1 мМ |
| Пируват натрия | Гибко | 11360070 | 1 мМ |
| 2-меркаптанол | Гибко | 31350-010 | 0.1 мМ |
| Пенициллин и стрептомицин | Гибко | 15140-122 | 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл |
| CDMII (День 18-35) | Окончательный конспект. | ||
| ДМЭМ/Ф12 | Гибко | 31330038 | [1:1] |
| Глутамакс | Гибко | 35050-061 | 2 мМ |
| Добавка N-2 (100x) | Гибко | 17502-048 | 1% |
| Химически определенный липидный концентрат | Гибко | 11905031 | 1% |
| Пенициллин и стрептомицин | Гибко | 15140-122 | 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл |
| CDMIII (День 35-70) | Окончательный конспект. | ||
| ДМЭМ/Ф12 | Гибко | 31330038 | [1:1] |
| Глутамакс | Гибко | 35050-061 | 2 мМ |
| Добавка N-2 (100x) | Гибко | 17502-048 | 1% |
| Химически определенный липидный концентрат | Гибко | 11905031 | 1% |
| Пенициллин и стрептомицин | Гибко | 15140-122 | 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Гибко | 10270-106 | 10% |
| Гепарин | Мерк | Н3149-25КУ | 5 мкг/мл |
| Матригель | Корнинг | 356231 | 1% |
| CDMIV(День 70+) | Окончательный конспект. | ||
| ДМЭМ/Ф12 | Гибко | 31330038 | [1:1] |
| Глутамакс | Гибко | 35050-061 | 2 мМ |
| Добавка N-2 (100x) | Гибко | 17502-048 | 1% |
| Химически определенный липидный концентрат | Гибко | 11905031 | 1% |
| Пенициллин и стрептомицин | Гибко | 15140-122 | 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Гибко | 10270-106 | 10% |
| Гепарин | Мерк | Н3149-25КУ | 5 мкг/мл |
| Матригель | Корнинг | 356231 | 2% |
| Добавка B-27 с витамином A 50x | Гибко | 17504044 | 2% |
| Нейронная среда | Окончательный конспект. | ||
| ДМЭМ/Ф12 | Гибко | 31330038 | [1:1] |
| Дополнение N-2 | Гибко | 17502048 | [1х] |
| Добавка B-27 с витамином A 50x | Гибко | 17504044 | [1х] |
| L-аскорбиновая кислота | Сигма Олдрич | А92902 | [200 мкМ] |
| db-цАМФ (дибутирилциклический аденозинмонофосфат) | Сигма Олдрич | Д0627 | 500 мкМ |
| BDNF (нейротрофический фактор) | MACS Мильтеньи | 130-093-811 | [10 нг/мл] |
| GDNF (нейротрофический фактор, полученный из глиальной клеточной линии) | MACS Мильтеньи | 130-096-290 | [10 нг/мл] |
| Человеческий TGF-β3 (трансформирующий фактор роста-бета3) | MACS Мильтеньи | 130-094-007 | [1 нг/мл] |
| Пробирная среда | Окончательный конспект. | ||
| Морской конёк XF DMEM средний | Бионаука о морском коньке | 103680-100 | 500 мл |
| Пируват натрия | Гибко | 11360070 | 1 мМ |
| L-глютамин | Лонза | БЕБП17-605Е | 2 мМ |
| Глюкоза | Сигма Олдрич | 50-99-7 | 10 мМ |
| Решение для блокировки | Окончательный конспект. | ||
| PBS-Анимация | [1:1] 0.1% Анимация движения | ||
| Ослиная сыворотка | Сигма Олдрич | Д9663 | 10% |
| Тритон-Х | Мерк | X100-5МЛ | 1% |
Таблица 1: Подробная информация о средах и растворах, используемых для генерации органоидов.
| Инициализация | Базовый уровень (X3) | Олигомицин для инъекций (X3) | Инъекция FCCP (X3) | Инъекция FCCP (X3) | Анти А + Гниль инъекция (X3) |
| Калибровать | Смешивать | Смешивать | Смешивать | Смешивать | Смешивать |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Уравновешивание (12:00) | Ждать | Ждать | Ждать | Ждать | Ждать |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Мера (03:00) | Мера (03:00) | Мера (03:00) | Измерять | Мера (03:00) | |
| (03:00) |
Таблица 2: Настройка протокола для биоэнергетического профилирования. Описание шагов и их продолжительность в минутах с помощью программного обеспечения Seahorse Wave Desktop. Сокращения: FCCP = карбонильный цианид-p-трифторметоксифенилгидразон; Гниль = ротенон; Анти А = Антимицин А.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается воспроизводимая генерация органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использование для моделирования митохондриальных заболеваний. Протокол, описанный здесь, модифицирован на основе ранее опубликованной работы20. Одним из основных преимуществ настоящего протокола является то, что он не требует ручного встраивания каждого органоида в матрицу строительных лесов. По сути, матричный раствор просто растворяется в клеточной культуральной среде. Кроме того, нет необходимости использовать дорогостоящие биореакторы, так как органоиды могут быть культивированы в стандартных тканевых культурах 6-луночных пластин, расположенных на орбитальном шейкере внутри инкубатора. Эта процедура также позволяет параллельно культивировать несколько пластин, содержащих различные органоиды, полученные из различных отдельных линий, тем самым увеличивая пропускную способность экспериментов и позволяя контролировать разности потенциалов, возникающие в профилях роста различных органоидов. Мы протестировали этот протокол, используя различные IPSCs, полученные от здоровых контрольных групп и людей, страдающих митохондриальными заболеваниями, с последовательными результатами.
Для моделирования митохондриальных заболеваний важно использовать различные маркеры для визуализации морфологии и организации митохондриальной сети. Эта процедура позволяет исследовать, могут ли митохондриальное число, морфология или распределение быть изменены в органоидах головного мозга, полученных от пациентов с митохондриальными заболеваниями. Наличие и организация нейронных предшественников в органоидах мозга может иметь решающее значение для моделирования митохондриальных расстройств. Недавно мы обнаружили, что мутации, вызывающие митохондриальное заболевание, синдром Ли, нарушают клеточную архитектуру и распределение нейронных клеток-предшественников в органоидах мозга, полученных от пациента18.
Для выполнения биоэнергетического профилирования мы адаптировали метод, который был ранее описан для оценки биоэнергетики плюрипотентных стволовых клеток21. Недавний протокол описывал, как проводить биоэнергетическое профилирование органоидов, полученных из тонкой кишки мыши, толстой кишки человека и колоректальных опухолей22. Тем не менее, эти органоиды довольно малы по сравнению с органоидами мозга, и поэтому для органоидов мозга необходим другой протокол, такой как тот, о котором сообщается здесь. Недавно мы использовали этот протокол для оценки биоэнергетического профиля органоидов головного мозга человека, несущих мутации в гене белка 1 локуса избытка (SURF1), который вызывает тяжелое митохондриальное заболевание, синдром Ли18. Мы обнаружили, что профиль OCR особенно влияет на органоиды синдрома Ли, о чем свидетельствует значительное снижение базального уровня OCR, скорости производства АТФ и максимальной скорости дыхания18.
В заключение мы представляем здесь подробный протокол для надежной генерации органоидов головного мозга человека и описываем, как проводить эксперименты, которые были бы важны для исследования механизмов заболевания, лежащих в основе митохондриальных заболеваний. Органоиды человеческого мозга также могут иметь решающее значение для выяснения митохондриального разнообразия в человеческом мозге и его роли в здоровье и заболеваниях человека23. Важно уточнить, что органоиды мозга, генерируемые с помощью доступных в настоящее время протоколов, включая описанный здесь, по-прежнему имеют ограничения. К ним относятся, например, отсутствие васкуляризации и отсутствие микроглии популяции24. Эти аспекты необходимо учитывать, чтобы правильно интерпретировать результаты.
Например, отсутствие сосудистой системы и микроглии может ограничить компенсаторные механизмы, которые могут быть на месте in vivo. Таким образом, органоиды головного мозга, полученные от пациентов, могут демонстрировать дефекты, которые сильнее, чем те, которые наблюдаются у пациентов17,18. Более того, несмотря на общую воспроизводимость этого протокола20, может наблюдаться межстрочная гетерогенность. С этой целью при проведении исследований по моделированию заболеваний всегда важно систематически количественно оценивать однородность контрольных и органоидов пациента путем оценки закономерностей морфологии (размер, слой) и распределения молекулярных маркеров по различным органоидам.
Наконец, невозможно генерировать органоиды мозга из одного iPSC, что ограничивает возможность крупномасштабного генетического скрининга с помощью CRISPR / Cas9. Учитывая темпы исследований, вполне вероятно, что некоторые из нынешних ограничений протокола, описанных здесь, вскоре будут преодолены. Станут доступны оптимизированные протоколы. Мы надеемся, что эти 3D-модели митохондриальных заболеваний позволят в конечном итоге открыть осуществимые методы лечения митохондриальных заболеваний, которые наносят ущерб, и неизлечимых заболеваний с крайне неудовлетворенными медицинскими потребностями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или нефинансовых интересов.
Acknowledgments
Благодарим Мириам Бюннинг за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark и Берлинского института здравоохранения (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), Объединенного фонда митохондриальных заболеваний (UMDF) (грант Международного консорциума синдрома Ли для A.P.), Университетской больницы Дюссельдорфа (Forschungskommission UKD to A.P.) и Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (e: Грант био молодого исследователя AZ 031L0211 для A.P.). Работа в лаборатории C.R.R. была поддержана DFG (ЗА 2795 «Синапсы в состоянии стресса», Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A.
- Gorman, G. S., et al.
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J.
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
