Summary
Ændring af eksisterende multielektrode array eller patch clamp udstyr gør ex vivo elektroretinogram mere tilgængeligt. Forbedrede metoder til at registrere og vedligeholde ex vivo-lysresponser letter undersøgelsen af fotoreceptor og ON-bipolar cellefunktion i den sunde nethinde, dyremodeller af øjenlidelser og humane donornethinder.
Abstract
Målinger af retinale neuronale lysresponser er afgørende for at undersøge fysiologien i den sunde nethinde, bestemme patologiske ændringer i retinale sygdomme og teste terapeutiske interventioner. Ex vivo-elektroretinogrammet (ERG) gør det muligt at kvantificere bidrag fra individuelle celletyper i den isolerede nethinde ved tilsætning af specifikke farmakologiske midler og evaluere vævsindtrængende ændringer uafhængigt af systemiske påvirkninger. Retinale lysresponser kan måles ved hjælp af en specialiseret ex vivo ERG-prøveholder og optagelsesopsætning, modificeret fra eksisterende patch clamp eller microelectrode array-udstyr. Især undersøgelsen af ON-bipolære celler, men også af fotoreceptorer, er blevet hæmmet af det langsomme, men progressive fald i lysresponser i ex vivo ERG over tid. Øget perfusionshastighed og justering af perfusattemperaturen forbedrer ex vivo retinal funktion og maksimerer responsamplitude og stabilitet. Ex vivo ERG tillader unikt undersøgelse af individuelle retinale neuronale celletyper. Derudover gør forbedringer for at maksimere responsamplituder og stabilitet det muligt at undersøge lysresponser i nethindeprøver fra store dyr samt menneskelige donorøjne, hvilket gør ex vivo ERG til en værdifuld tilføjelse til repertoiret af teknikker, der bruges til at undersøge retinal funktion.
Introduction
Elektroretinografi måler retinal funktion som reaktion på lys1. Det er integreret i at studere retinal fysiologi og patofysiologi og måle succesen med terapier til retinale sygdomme. In vivo ERG bruges i vid udstrækning til at vurdere retinal funktion i intakte organismer, men den har betydelige begrænsninger 2,3. Blandt disse hæmmes den kvantitative analyse af individuelle nethindecelletyper i in vivo ERG, da den registrerer summen af potentielle ændringer og derfor overlejringsresponser fra alle nethindeceller til lysstimuli4. Desuden tillader det ikke let tilsætning af lægemidler til nethinden, er sårbar over for systemiske påvirkninger og har et relativt lavt signal-støj-forhold. Disse ulemper elimineres i ex vivo ERG, der undersøger funktionen af den isolerede nethinde 2,3,5,6. Ex vivo ERG gør det muligt at registrere store og stabile reaktioner fra specifikke nethindecelletyper ved tilsætning af farmakologiske hæmmere og let evaluering af terapeutiske midler, som kan tilsættes superfusatet. Samtidig fjerner det påvirkninger af systemiske virkninger og eliminerer fysiologisk støj (f.eks. Hjerteslag eller vejrtrækning).
I ex vivo ERG isoleres nethindeprøver eller nethindeprøver og monteres fotoreceptorsiden opad på prøveholderens kuppel 3,5. Prøveholderen er samlet, forbundet til et perfusionssystem, der forsyner nethinden med opvarmede, iltede medier og placeret på scenen i et mikroskop, som er blevet modificeret til at levere computerstyrede lysstimuli. For at registrere de svar, der fremkaldes af lys, er prøveholderen forbundet til en forstærker, digitalisering og optagesystem (figur 1). Denne teknik tillader isolering af reaktioner fra stang- og keglefotoreceptorer, ON-bipolære celler og Müller glia ved at ændre parametrene for lysstimuli og tilføje farmakologiske midler.
En eksisterende patch clamp eller multi-electrode array (MEA) opsætning kan konverteres til at optage ex vivo ERG, enten i forbindelse med en kommercielt tilgængelig ex vivo ERG-adapter eller en brugerdefineret polycarbonat computer numerisk kontrol (CNC) -bearbejdet prøveholder, til at måle lysresponser i nethinden fra smådyrsmodeller, såsom mus. Denne ændring øger tilgængeligheden af ex vivo ERG, samtidig med at behovet for specialudstyr minimeres. Prøveholderens design forenkler monteringsteknikken og integrerer elektroder, hvilket eliminerer behovet for manipulation af mikroelektroder sammenlignet med tidligere rapporterede transretinale ex vivo ERG-metoder7. Perfusionshastigheden og temperaturen inde i prøveholderen er vigtige faktorer, der påvirker responsegenskaberne fra fotoreceptorer og ON-bipolære celler. Ved at justere disse forhold kan ex vivo ERG registreres pålideligt fra den isolerede musenethinde over længere tid. Optimerede eksperimentelle forhold tillader ex vivo ERG-optagelser i nethindeslag fra større nethinder, herunder store dyreøjne og menneskelige donorøjne8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af Institutional Animal Studies Committee ved University of Utah. Griseøjne til demonstration af denne video blev hentet postmortem fra slagteriet (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Øjne blev opnået fra menneskelige donorer efter hjerne- eller hjertedød med samtykke til forskningsbrug gennem Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank eller Lifesharing, som er fuldt akkrediteret af FDA, Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) og Eye Banks of America Association. Brugen af menneskelige donorøjne havde undtagelsesstatus ved University of Utah (IRB nr. 00106658) og ScrippsHealth IRB (IRB nr. 16-6781).
1. Oprettelse af ex vivo ERG
- For at konvertere en multielektrode array-opsætning skal du tilslutte ex vivo ERG-prøveholderen via et hovedtrin til en differentiel forstærker, som er tilsluttet den analoge indgang på interfacekortet i multielektrode array-systemet. Brug optagelsessoftwaren til multielektrodearrayet til at optage og gemme inputdata fra ex vivo ERG. Indstil forstærkningen af differentialforstærkeren til 100, og tilføj en yderligere 10x spændingsforstærkning afhængigt af digitaliseringsspecifikationerne. Indstil lavpasfilteret til 100 Hz.
- For at konvertere en patch clamp opsætning, tilslut ex vivo ERG prøveholderen via et hovedtrin til en differentiel forstærker, som er forbundet til hovedtrinnet af patch clamp forstærkeren. Brug patch clamp systemsoftwaren og digitaliseringsenheden til at registrere og gemme inputdata fra ex vivo ERG. Indstil forstærkningen af differentialforstærkeren til 100, og anvend en yderligere 10x spændingsforstærkning via patch clamp head stage. Indstil lavpasfilteret til 100 Hz.
- Forbind lysdioder med de passende bølgelængder (f.eks. Ca. 530 nm for at fremkalde stangfotoreceptor og ON-bipolære celleresponser) til mikroskopet. Styr LED'erne med optagelsessoftware, der muliggør udløsning af lysstimuli. For at styre lysstimuli skal du bruge en LED-driver styret af analoge udgange fra en digitizer.
- Kalibrer lysdiodernes lysudgang på nethindens position i prøveholderen ved hjælp af en fotodiode. Indsæt om nødvendigt neutrale tæthedsfiltre i lysbanen for at dæmpe lysintensiteten.
- Brug en kommercielt tilgængelig eller specialbygget ex vivo ERG-prøveholder.
BEMÆRK: Tegninger til CNC-bearbejdning fra polycarbonat kan fås fra forfatterne efter anmodning. - For at forberede elektroden skal du indsætte en Ag / AgCl pilleelektrode i et gevindskåret luer-stik. Fyld indersiden af luer-stikket med varm lim, og indsæt en 2 mm stikkontakt i den varme lim fra den ikke-gevindside. Lod en sølvtråd af EP1-elektroden til 2 mm-stikket. Skru den færdige elektrode med en o-ring på gevindet ind i elektrodearportene på ex vivo ERG-prøveholderen.
BEMÆRK: Elektroder kan bruges i lang tid. Hvis pelletoverfladen akkumulerer snavs og / eller bliver mørk (dette kan forårsage høj forskydningsspænding og / eller elektrisk drift), kan den "poleres" ved hjælp af fint sandpapir. - Mindst 1 dag før forsøg limefiltreres papirer på kuplerne på ex vivo ERG-prøveholderen ved hjælp af epoxylim, hvilket sikrer, at limen ikke blokerer elektrodekanalen (se video 3).
2. Tilberedning af dyr
- Mørke tilpasse dyr i mindst 6 timer eller natten over.
3. Forberedelse af udstyr
- Fyldningslinjen i ex vivo ERG fyldes med Ames' medium boblet med 5% kuldioxid og 95% oxygen. Tilslut perfusionsledningen til et varmeelement med en jævnstrømskilde eller varmeregulator nær prøveholderen for at opvarme Ames' medium, så nethinden holdes ved ca. 35-38 °C.
- Fyld begge halvdele af ex vivo ERG-prøveholderen med elektrodeopløsning, forsegl perfusionsledningen med luerpropper, tilslut elektroderne, og saml prøveholderen med fire skruer (se video 3).
- Kontroller modstanden og forskydningsspændingen mellem elektroderne i den samlede prøveholder ved at indsætte sonderne på multimeteret i elektroderne.
BEMÆRK: Hvis der ikke er blokeringer, og elektroderne er i god stand, skal modstanden være under 100 kΩ og forskydningsspænding under 5 mV. - Tilslut den samlede prøveholder til perfusionslinjen og læg den på scenen i et mikroskop, der er oprettet for at levere lysglimt. Sørg for, at prøveholderen og perfusionslinjen ikke indeholder luftbobler.
4. Vævspræparation
- Ofr dyret med CO2 og opmuntr straks øjnene, eller få store dyre- eller menneskelige donorøjne.
- Rens kloden for det resterende bindevæv og ekstraokulære muskler. Trim af synsnerven.
- På filterpapir anbringes forsigtigt et lille snit med et barberblad langs ora serrata, ca. 1 mm fra limbus i museøjet. Indsæt fine vannas saks i snittet og skær langs limbus for at fjerne den forreste del af øjet med linsen.
- Flyt øjenkoppen over i et fad, der indeholder Ames' medium. Tag fat i scleraen med fine tang, og pas på ikke at røre nethinden. Indsæt vannas saks mellem nethinden og sclera og skær sclera fra periferien mod den centrale del. Pas på ikke at røre ved eller beskadige nethinden.
- Immobiliser sclera ved at holde den ene side af snittet med vannas saks mod bunden af dissektionsskålen. Tag fat i sclera med tang på den anden side af snittet. Fjern sclera uden at røre ved eller beskadige nethinden ved at trække sclera fra hinanden på hver side af snittet for at tillade isolering af nethinden med minimal skade på vævet.
- Fjern det forreste segment med linsen fra det andet øje, og opbevar øjenkoppen ved stuetemperatur i Ames 'opløsning boblet med 5% kuldioxid og 95% ilt.
BEMÆRK: Funktionelle lysresponser fra øjne, der opbevares på denne måde, kan opnås i flere timer. - I store øjne, herunder menneskelige donorøjne, skal du rense kloden for det resterende bindevæv og fjerne det forreste segment og linsen på samme måde som den procedure, der er beskrevet for museøjet. Brug en skalpel til at lave et snit ca. 3 mm fra limbus. Indsæt buet dissektionssaks i snittet og skær langs limbus for at fjerne den forreste del af øjet med linsen. Få retinale prøver til ex vivo elektroretinografi med en 3-6 mm engangsbiopsistans.
5. Montering af vævet på prøveholderen
- Placer den nederste halvdel af prøveholderen i en stor petriskål og fyld med iltet Ames 'medium, så prøveholderens kuppel bare er nedsænket.
- Tag forsigtigt fat i nethindens kant med fin tang, og overfør nethinden til kuplen på ex vivo-prøveholderen med fotoreceptorsiden opad.
- Løft prøveholderen fra Ames 'opløsning, og sørg for, at nethinden forbliver på plads.
- Tør pladen på prøveholderen helt for at minimere støj, elektrisk krydstale og signalrangering.
- Saml begge halvdele af prøveholderen med fire skruer, og tilslut perfusionsledningen. Tør elektroden i den nederste halvdel af prøveholderen, og tilslut anodekablet til den indre nethindeside og katodekablet til fotoreceptorsiden.
- Gennemgå prøveholderen med mindst 1 ml / min iltet Ames 'medium i 10-20 minutter for at give tid til lysresponser at stabilisere.
6. Optagelse af retinal neuronal cellefunktion
- Optag responsfamilier ved at udsætte nethinden for lysglimt af stigende intensitet. For eksempel registreres musestangsfotoreceptorresponsfamilier med lysintensiteter fra ca. 10 til 1.000 fotoner / μm 2 og dem fra mus ON-bipolære celler med lysintensiteter fra ca. 0,6 til 20 fotoner / μm2.
- Mål fotoreceptorlysresponser (a-bølge) i nærværelse af 100 μM bariumchlorid, som blokerer kaliumkanaler i Müller gliaceller, og 40 μM DL-AP4, som blokerer glutamatergisk signaloverførsel til ON-bipolære celler (figur 2B).
- For at isolere b-bølgen, der stammer fra funktionen af de ON-bipolære celler, registreres først kombinerede lysresponser fra både fotoreceptor- og ON-bipolære celler i nærværelse af bariumchlorid alene (figur 2A). Derefter perfuse i 5-10 minutter med Ames 'medium indeholdende bariumchlorid samt DL-AP4 og optage fotoreceptorresponser på de samme lysstimuli som før (figur 2B). Træk fotoreceptorresponser fra kombinerede fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser og beregner således ON-bipolære cellelysresponser alene (figur 2C).
7. Optimering af ON-bipolar cellefunktion
BEMÆRK: B-bølgen, der stammer fra de ON-bipolære celler, er meget følsom over for temperaturen i prøveholderen og perfusionshastigheden.
- Oprethold en perfusionshastighed på mindst 0,5 ml / min for at opnå b-bølgen.
BEMÆRK: En højere perfusionshastighed på 1-2 ml / min foretrækkes for at opretholde et stort og stabilt respons fra ON-bipolære celler. - Sørg for, at temperaturen i prøveholderen nær nethinden for en given perfusionshastighed er tæt på kropstemperaturen (dvs. ca. 35-38 °C).
BEMÆRK: Det er vigtigt at justere temperaturen på perfusatet, som opvarmes, før det når ex vivo ERG-prøveholderen, så det er inden for det optimale temperaturområde ved nethinden. - Opbevar øjenkopper til senere eksperimenter beskyttet mod lys og i iltet Ames 'medium ved stuetemperatur for at opretholde normale a- og b-bølger i flere timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG muliggør optagelse af reproducerbare og stabile fotoreceptor- og ON-bipolære cellelysresponser, for eksempel fra musens nethinde (figur 2A-C). Registrering af fotoreceptorresponser fra humane donornethinder er mulig med op til 5 timers postmortemforsinkelse af enukleation (figur 2D) og af ON-bipolære celleresponser med en <20 minutters enukleationsforsinkelse (figur 2E). Vigtige parametre for at opnå store reaktioner omfatter en omhyggelig dissektionsteknik, høj perfusionshastighed og perfusionstemperatur tæt på fysiologiske værdier (35-38 ° C i pattedyrs nethinde). Under disse forhold var responsamplituder og kinetik i begge celletyper relativt stabile over tid, men faldt langsomt ca. 40-45 minutter efter, at nethinden var monteret på prøveholderen (figur 3).
Sammenlignet med fotoreceptorer forstyrres ON-bipolar cellefunktion lettere, for eksempel ved beskadigelse af nethinden under dissektion og montering eller ved et fald i temperaturen og / eller perfusionshastigheden. Mens reduceret temperatur i prøveholderen i høj grad bremsede kinetikken af både fotoreceptorer og ON-bipolære celler, reducerede den amplituden af b-bølgen, men ikke a-bølgen (figur 4A). Omvendt reducerede langsommere perfusionshastigheden fra 2,1 ml / min til 0,6 ml / min amplituderne af både fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser, men påvirkede ikke den implicitte tid (tid fra stimulusstart til responstop) for hverken a- eller b-bølgen (figur 4B). Ophør af perfusion i 10 minutter efterfulgt af reperfusion resulterede i et fuldstændigt tab af ON-bipolar cellefunktion med bevarede fotoreceptorresponser (figur 5).
Figur 1: Ex vivo elektroretinogramprøveholder og optagelsesopsætning . (A,B) Ex vivo ERG-prøveholderen består af en kuppel til montering af den isolerede nethinde, som er forbundet til en perfusionslinje for kontinuerligt at levere Ames' medium. Elektroder er forbundet via smalle kanaler til både fotoreceptorsiden af nethinden via perfusionslinjen og den indre nethinde gennem filterpapiret limet til kuplen. Disse elektroder er forbundet til en differentiel forstærker, som muliggør måling af potentielle forskelle i nethinden som reaktion på lysstimuli. (C) Prøveindehaveren placeres på scenen i et mikroskop, som er blevet modificeret til at levere lysglimt og forbundet til perfusionslinjen, som leverer opvarmet, iltet Ames 'medium ved tyngdekraften. Hele optagelsesopsætningen er afskærmet af et Faraday-bur for at minimere elektrisk støj. Dette tal er ændret fra 9. Forkortelse: ERG = elektroretinogram. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på spor af ex vivo-fotoreceptor og ON-bipolære celleresponser. Tilsætning af farmakologiske midler til perfusatet muliggør kvantificering af bidrag fra individuelle retinale celletyper til ex vivo-elektroretinogrammet. Fotoreceptor (PR) lysresponser isoleres i nærværelse af 100 μM bariumchlorid (BaCl2), en blokering af K + kanaler udtrykt af Müller gliaceller, samt 40 μM DL-AP4, en glutamatreceptorblokker, som hæmmer signaloverførsel fra fotoreceptorer til ON-bipolære celler (B). ON-bipolar celle (ON-BPC) funktion (C) bestemmes ved at trække fotoreceptorkomponenten (B) fra den kombinerede fotoreceptor og ON-bipolære cellerespons i nærværelse af bariumchlorid alene (A). Fotoreceptorlysresponser kan opnås fra humane donor nethinder med en død til enukleation forsinkelse på <5 h (D), mens nethinder enukleeret inden for 20 minutter efter døden ofte også giver ON-bipolære celleresponser (E) (se 8 for yderligere information). Figur 2A-C er ændret fra 9. Forkortelser: PR = fotoreceptor; ON-BPC = ON-bipolar celle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Stabilitet af fotoreceptor og ON-bipolar cellefunktion i ex vivo-elektroretinogrammet over tid . (A) Lysresponser blev registreret hvert minut fra fotoreceptorer alene i nærværelse af både 100 μM bariumchlorid og 40 μM DL-AP4. (B) Svage lysglimt i nærværelse af 100 μM bariumchlorid alene er stærkt domineret af ON-bipolar cellefunktion, selv om de indeholder en lille fotoreceptorkomponent. Lysresponser fra isolerede nethinder stabiliseres typisk efter perfusering af ex vivo-prøveholderen i 15-20 minutter og var stabile i mindst 20-25 minutter, før de begyndte at falde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kombinerede fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser ved forskellige temperaturer og perfusionshastigheder. (A) Sænkning af temperaturen inde i prøveholderen fra 37 °C til stuetemperatur bremsede i høj grad fotoreceptor- og ON-bipolarcellekinetik, men reducerede kun ON-bipolarcelleamplituden i den blandede fotoreceptor og ON-bipolar cellerespons. (B) Reduktion af perfusionshastigheden fra 2,1 ml / min til 0,6 ml / min resulterede i nedsat fotoreceptor og ON-bipolære celleamplituder, men ingen ændring i responskinetikken. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: ON-bipolære celleresponser er mere følsomme over for ophør af perfusion. (A) Store fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser blev registreret efter perfusion med 2,1 ml/min i 20 min. (B) Efter ophør af perfusion i 10 minutter efterfulgt af reperfusion i 10 minutter ved 2,1 ml / min var fotoreceptorresponser til stede, mens ON-bipolære cellers respons var helt tabt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oprindeligt udviklet i 1865 af Holmgren til at måle retinale lysresponser fra amfibie nethinde10, forhindrede tekniske begrænsninger oprindeligt ERG i at blive udbredt. Ikke desto mindre identificerede skelsættende undersøgelser af Ragnar Granit og andre ERG's cellulære oprindelse og målte fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser ex vivo11,12,13. Siden da har raffinerede metoder muliggjort en mere udbredt anvendelse af ex vivo ERG-optagelser 14,15, selv om responsamplituder, især dem fra ON-bipolære celler, forblev forholdsvis små 16. For at overvinde disse begrænsninger måles retinalfunktionen i dag mere almindeligt med in vivo ERG på trods af eksperimentelle begrænsninger og mere kompliceret fortolkning af de registrerede bølgeformer. Selv om ex vivo ERG forsøger at replikere fysiologiske tilstande så tæt som muligt, måler den ikke desto mindre nethindefunktionen i et kunstigt miljø og i fravær af systemiske faktorer og patologiske ændringer. Når denne begrænsning kombineres med in vivo ERG, kan den imidlertid bruges til at besvare vigtige spørgsmål, såsom om ændringer i nethindefunktionen i sygdom er iboende i retinale celler eller forårsaget af systemiske ændringer17.
For nylig har nydesignede ex vivo ERG-prøveindehavere forenklet metoden, hvilket gør ex vivo ERG tilgængelig for et bredere forskningssamfund 2,3,5,18. Ændringer af eksisterende patch clamp eller multielektrode array udstyr beskrevet i denne protokol vil gøre det muligt for flere laboratorier at udføre ex vivo ERG med minimale finansielle investeringer og pladsbehov. Den seneste udvikling inden for ex vivo ERG-teknologi har især forstærket reaktionsevnen hos pattedyrs isolerede nethinder og resulteret i et overlegent signal/støj-forhold, som fortsat er godt på trods af yderligere forstærkningstrin, der er beskrevet i denne protokol. Ikke desto mindre har faldet i lysresponserne, hovedsagelig fra ON-bipolære celler19, måske hæmmet den mere udbredte anvendelse af ex vivo ERG. Brugen af Ames' eller Lockes medium resulterer i større fotoreceptor- og ON-bipolære celleresponser, hvilket gør dem at foretrække frem for f.eks. HEPES-bufferet Ringer-opløsning til ex vivo ERG3. Andre laboratorier stabiliserede ex vivo ON-bipolar cellefunktion ved at supplere med glutamin eller glutamat19. Denne rapport viser, hvordan man opnår store og stabile lysresponser fra isolerede nethinder, herunder fra menneskelige donorøjne, som tidligere rapporteret8.
Vigtige eksperimentelle parametre omfatter nethindens temperatur, som skal holdes inden for det fysiologiske område og en hurtig perfusionshastighed. De mest mærkbare virkninger af at sænke temperaturen i ex vivo ERG-prøveholderen er langsommere responskinetik i både fotoreceptorer og ON-bipolære celler og en svækket ON-bipolar celleamplitude. Selvom sænkning af temperaturen ser ud til at have ringe effekt på fotoreceptoramplituden i det kombinerede respons fra fotoreceptorer og ON-bipolære celler, kan dette være en artefakt på grund af differentielle ændringer i responskinetikken fra begge celletyper.
En tilstrækkelig perfusionshastighed synes at være særlig kritisk for nethindefunktionen, der sandsynligvis leverer ilt og næringsstoffer og fjerner affaldsprodukter. Mens både fotoreceptor- og ON-bipolære celleamplituder er noget formindsket af en moderat reduktion i perfusionshastigheden, afskaffede selv et kort ophør af perfusion ON-bipolar, men ikke fotoreceptorfunktion. Dette indebærer, at fotoreceptorresponser er mere robuste og lettere kan bevares i øjne, der gennemgår eksperimenter med en betydelig forsinkelse, såsom humane donorøjne8. I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at ON-bipolar cellefunktion ikke mindskes ved at opbevare øjenkopper i iltet Ames 'medium i flere timer. Vi antager derfor, at tabet af ON-bipolar cellefunktion, når perfusionen i ex vivo-prøveholderen stoppes, kan skyldes hurtig udtømning af ilt og andre næringsstoffer i det lille volumen, der omgiver nethinden i prøveholderen. Dette understøttes af rapporter om, at en kort forsinkelse fra død til enukleation er afgørende for at registrere fotoreceptor og især ON-bipolære celleresponser fra humane nethinder, og at postmortem hypoxi er den mest sandsynlige kandidat til irreversibel skade på retinal neuronal funktion8. Mens eksperimentelle parametre for ex vivo ERG blev optimeret i musens nethinde, forbedrede de ikke desto mindre registreringsbetingelserne for nethindeprøver fra store dyr og menneskelige donorøjne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute-tilskud EY02665 og EY031706 og International Retinal Research Foundation til Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800) og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness, New York, NY, til Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah. Dr. Frans Vinberg er også modtager af en Research to Prevent Blindness / Dr. H. James og Carole Free Career Development Award, og Dr. Silke Becker af et ARVO EyeFind-tilskud. Vi takker Dr. Anne Hanneken fra The Scripps Research Institute for at levere donorøjet, der blev brugt til optagelser vist i figur 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
