Summary
A modificação do equipamento de matriz de multieletrodos ou patch clamp existente torna o eletrorretinograma ex vivo mais amplamente acessível. Métodos aprimorados para registrar e manter respostas à luz ex vivo facilitam o estudo da função fotorreceptora e das células ON-bipolar na retina saudável, modelos animais de doenças oculares e retinas de doadores humanos.
Abstract
As medições das respostas à luz neuronal da retina são críticas para investigar a fisiologia da retina saudável, determinar alterações patológicas em doenças da retina e testar intervenções terapêuticas. O eletrorretinograma ex vivo (ERG) permite a quantificação de contribuições de tipos celulares individuais na retina isolada por adição de agentes farmacológicos específicos e avaliação de alterações tecidual intrínsecas independentemente de influências sistêmicas. As respostas à luz da retina podem ser medidas usando um suporte de amostra ERG ex vivo especializado e uma configuração de gravação, modificada a partir do equipamento existente de patch clamp ou microeletrodos. Particularmente, o estudo das células ON-bipolares, mas também dos fotorreceptores, tem sido dificultado pelo declínio lento, mas progressivo, das respostas à luz no ERG ex vivo ao longo do tempo. O aumento da velocidade de perfusão e o ajuste da temperatura do perfusato melhoram a função retiniana ex vivo e maximizam a amplitude e a estabilidade da resposta. O ERG ex vivo permite exclusivamente o estudo de tipos individuais de células neuronais da retina. Além disso, melhorias para maximizar as amplitudes de resposta e a estabilidade permitem a investigação de respostas luminosas em amostras de retina de animais de grande porte, bem como em olhos de doadores humanos, tornando o ERG ex vivo uma adição valiosa ao repertório de técnicas utilizadas para investigar a função retiniana.
Introduction
A eletrorretinografia mede a função retiniana em resposta à luz1. É essencial para estudar a fisiologia e fisiopatologia da retina e medir o sucesso das terapias para doenças da retina. O ERG in vivo é amplamente utilizado para avaliar a função retiniana em organismos intactos, mas apresenta limitações significativas 2,3. Dentre estes, a análise quantitativa de tipos individuais de células da retina no ERG in vivo é dificultada, uma vez que registra a soma das possíveis alterações e, portanto, sobrepondo as respostas, de todas as células da retina aos estímulos luminosos4. Além disso, não permite prontamente a adição de drogas à retina, é vulnerável a influências sistêmicas e tem uma relação sinal-ruído relativamente baixa. Essas desvantagens são eliminadas no ERG ex vivo que investiga a função da retina isolada 2,3,5,6. O ERG ex vivo permite o registro de respostas grandes e estáveis de tipos específicos de células da retina por adição de inibidores farmacológicos e fácil avaliação de agentes terapêuticos, que podem ser adicionados ao superfusato. Ao mesmo tempo, remove influências de efeitos sistêmicos e elimina o ruído fisiológico (por exemplo, batimentos cardíacos ou respiração).
No ERG ex vivo, as retinas ou amostras de retina são isoladas e montadas do lado fotorreceptor na cúpula do suporte do espécime 3,5. O suporte da amostra é montado, conectado a um sistema de perfusão que fornece à retina meios aquecidos e oxigenados e colocado no palco de um microscópio, que foi modificado para fornecer estímulos de luz controlados por computador. Para registrar as respostas provocadas pela luz, o suporte do espécime é conectado a um amplificador, digitalizador e sistema de gravação (Figura 1). Esta técnica permite o isolamento de respostas de fotorreceptores de bastonetes e cones, células ON-bipolares e glia de Müller, alterando os parâmetros dos estímulos de luz e adicionando agentes farmacológicos.
Uma configuração existente de patch clamp ou multi-electrode array (MEA) pode ser convertida para registrar ERG ex vivo, em conjunto com um adaptador ERG ex vivo comercialmente disponível ou um suporte de amostra usinado por controle numérico computadorizado (CNC) de policarbonato personalizado, para medir as respostas à luz em retinas de pequenos modelos animais, como camundongos. Esta modificação aumenta a acessibilidade do ERG ex vivo, minimizando a necessidade de equipamentos especializados. O desenho do suporte do corpo de prova simplifica a técnica de montagem e integra eletrodos, eliminando a necessidade de manipulação de microeletrodos em comparação com os métodos ERG transretinais ex vivo relatados anteriormente7. A taxa de perfusão e a temperatura dentro do suporte da amostra são fatores importantes que afetam as propriedades de resposta dos fotorreceptores e das células ON-bipolares. Ao ajustar essas condições, o ERG ex vivo pode ser registrado de forma confiável a partir da retina isolada do camundongo por períodos prolongados de tempo. Condições experimentais otimizadas permitem registros ex vivo de ERG em socos de retina de retinas maiores, incluindo olhos de animais de grande porte e olhos de doadores humanos8.
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Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram conduzidos de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Estudos em Animais da Universidade de Utah. Olhos de porco para demonstração deste vídeo foram obtidos post-mortem do matadouro (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Os olhos foram obtidos de doadores humanos após morte cerebral ou cardíaca com consentimento para uso em pesquisa através do Utah Lions Eye Bank, do San Diego Eye Bank ou Lifesharing, que são totalmente credenciados pela FDA, pela Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) e pela Eye Banks of America Association. O uso de olhos de doadores humanos teve status de isenção na Universidade de Utah (IRB no. 00106658) e ScrippsHealth IRB (IRB no. 16-6781).
1. Criação do ERG ex vivo
- Para converter uma configuração de matriz de vários eletrodos, conecte o suporte de amostra ERG ex vivo através de um estágio principal a um amplificador diferencial, que é conectado à entrada analógica da placa de interface do sistema de matriz de multieletrodos. Use o software de gravação para a matriz de vários eletrodos para gravar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo. Defina o ganho do amplificador diferencial para 100 e adicione uma amplificação de tensão adicional de 10x , dependendo das especificações do digitalizador. Defina o filtro passa-baixas para 100 Hz.
- Para converter uma configuração de braçadeira de patch, conecte o suporte de amostra ERG ex vivo através de um estágio de cabeça a um amplificador diferencial, que é conectado ao estágio principal do amplificador de grampo de patch. Use o software e o digitalizador do sistema de grampo de patch para registrar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo. Ajuste o ganho do amplificador diferencial para 100 e aplique uma amplificação de tensão adicional de 10x através do estágio de cabeça da braçadeira de patch. Defina o filtro passa-baixas para 100 Hz.
- Conecte os LEDs com os comprimentos de onda apropriados (por exemplo, aproximadamente 530 nm para provocar fotorreceptores de haste e respostas de células ON-bipolares) ao microscópio. Controle os LEDs com um software de gravação que permite o acionamento de estímulos de luz. Para controlar os estímulos de luz, use um driver de LED controlado por saídas analógicas de um digitalizador.
- Calibre a saída de luz dos LEDs na posição da retina no suporte da amostra usando um fotodiodo. Se necessário, insira filtros de densidade neutra no caminho da luz para diminuir a intensidade da luz.
- Use um suporte de espécime ERG ex vivo comercialmente disponível ou personalizado.
NOTA: Desenhos para usinagem CNC a partir de policarbonato podem ser obtidos dos autores mediante solicitação. - Para preparar o eletrodo, insira um eletrodo de pellet Ag/AgCl em um conector luer roscado. Preencha o interior do conector luer com cola quente e insira um soquete de 2 mm na cola quente do lado não roscado. Solde um fio de prata do eletrodo EP1 ao soquete de 2 mm. Parafusar o eléctrodo acabado, com um o-ring na rosca, nas portas do eléctrodo do suporte da amostra ERG ex vivo.
NOTA: Os eletrodos podem ser usados por um longo tempo. Se a superfície do pellet acumular sujeira e/ou escurecer (isso pode causar alta tensão de deslocamento e/ou desvio elétrico), ela pode ser "polida" usando lixa fina. - Pelo menos 1 dia antes da experimentação, cole papéis de filtro nas cúpulas do suporte de amostra ERG ex vivo usando cola epóxi, garantindo que a cola não obstrua o canal do eletrodo (ver 3 para vídeo).
2. Preparação animal
- Animais escuros adaptam por pelo menos 6 h ou durante a noite.
3. Preparação do equipamento
- Preencha a linha de perfusão do ERG ex vivo com o meio de Ames borbulhado com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Ligue a linha de perfusão a um elemento de aquecimento com uma fonte de corrente CC ou um controlador de calor perto do suporte da amostra para aquecer o meio de Ames, de modo a que a retina seja mantida a aproximadamente 35-38 °C.
- Encha ambas as metades do suporte da amostra ERG ex vivo com solução de eléctrodo, sele a linha de perfusão com rolhas luer, ligue os eléctrodos e monte o suporte da amostra com quatro parafusos (ver vídeo 3).
- Verifique a resistência e a tensão de deslocamento entre os eletrodos no suporte da amostra montada inserindo as sondas do multímetro nos eletrodos.
NOTA: Se não houver bloqueios e os eletrodos estiverem em boas condições, a resistência deve ser inferior a 100 kΩ e a tensão de deslocamento inferior a 5 mV. - Conecte o suporte do espécime montado à linha de perfusão e coloque no palco de um microscópio configurado para fornecer flashes de luz. Certifique-se de que o suporte da amostra e a linha de perfusão não contêm bolhas de ar.
4. Preparação de tecidos
- Sacrificar o animal com CO2 e enuclear imediatamente os olhos, ou obter grandes olhos de doadores animais ou humanos.
- Limpe o globo do tecido conjuntivo restante e dos músculos extraoculares. Corte o nervo óptico.
- Em papel de filtro, coloque cuidadosamente uma pequena incisão com uma lâmina de barbear ao longo da ora serrata, a aproximadamente 1 mm do limbo no olho do rato. Insira uma tesoura fina de vannas na incisão e corte ao longo do limbo para remover a porção anterior do olho com a lente.
- Mova o copo para os olhos em um prato contendo o meio de Ames. Segure a esclera com fórceps fina, tomando cuidado para não tocar na retina. Insira a tesoura vannas entre a retina e a esclera e corte a esclera da parte periférica em direção à parte central. Tome cuidado para não tocar ou danificar a retina.
- Imobilize a esclera segurando um lado da incisão com uma tesoura vannas contra o fundo do prato de dissecção. Segure a esclera com fórceps do outro lado da incisão. Remova a esclera sem tocar ou danificar a retina, separando a esclera em ambos os lados da incisão para permitir o isolamento da retina com danos mínimos ao tecido.
- Remova o segmento anterior com a lente do olho e armazene o copo do olho à temperatura ambiente na solução de Ames borbulhada com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.
NOTA: As respostas funcionais à luz dos olhos armazenados desta forma podem ser obtidas durante várias horas. - Em olhos grandes, incluindo olhos de doadores humanos, limpe o globo do tecido conjuntivo restante e remova o segmento anterior e a lente, de forma semelhante ao procedimento descrito para o olho do rato. Use um bisturi para fazer um corte a aproximadamente 3 mm do limbo. Insira uma tesoura de dissecção curva na incisão e corte ao longo do limbo para remover a porção anterior do olho com a lente. Obter amostras de retina para eletrorretinografia ex vivo com um punch de biópsia descartável de 3-6 mm.
5. Montagem do tecido no suporte do provete
- Coloque a metade inferior do suporte do espécime em uma placa de Petri grande e preencha com o meio oxigenado de Ames para que a cúpula do suporte do espécime fique apenas submersa.
- Agarre cuidadosamente a borda da retina com pinça fina e transfira a retina para a cúpula do suporte da amostra ex vivo , o lado do fotorreceptor voltado para cima.
- Levante o suporte da amostra da solução de Ames, tomando cuidado para que a retina permaneça no lugar.
- Seque completamente a placa do suporte da amostra para minimizar o ruído, o crosstalk elétrico e o desvio de sinal.
- Monte ambas as metades do suporte do corpo de prova com quatro parafusos e conecte a linha de perfusão. Secar o eléctrodo na metade inferior do suporte da amostra e ligar o cabo do ânodo ao lado interno da retina e o cabo do cátodo ao lado do fotorreceptor.
- Perfundir o suporte do espécime com pelo menos 1 mL/min de meio oxigenado de Ames por 10-20 min para dar tempo para que as respostas à luz se estabilizem.
6. Gravação da função das células neuronais da retina
- Registre as famílias de resposta expondo a retina a flashes de luz de intensidade crescente. Por exemplo, registre famílias de resposta fotorreceptora de bastonetes de camundongos com intensidades de luz variando de aproximadamente 10 a 1.000 fótons/μm 2 e aquelas de células ON-bipolares de camundongos com intensidades de luz variando de aproximadamente 0,6 a 20 fótons/μm2.
- Medir as respostas de luz fotorreceptora (onda a) na presença de cloreto de bário de 100 μM, que bloqueia os canais de potássio nas células gliais de Müller, e DL-AP4 de 40 μM, que bloqueia a transmissão do sinal glutamatérgico para as células ON-bipolares (Figura 2B).
- Para isolar a onda b, que se origina da função das células ON-bipolares, primeiro registre as respostas combinadas à luz de células fotorreceptoras e ON-bipolares na presença de cloreto de bário isolado (Figura 2A). Em seguida, perfundir por 5-10 min com o meio de Ames contendo cloreto de bário, bem como DL-AP4, e registrar as respostas fotorreceptoras aos mesmos estímulos de luz de antes (Figura 2B). Subtraia as respostas fotorreceptoras das respostas combinadas das células fotorreceptoras e ON-bipolares, calculando-se assim apenas as respostas à luz das células ON-bipolar (Figura 2C).
7. Otimizando a função celular ON-bipolar
NOTA: A onda b, que se origina das células ON-bipolares, é altamente sensível à temperatura no suporte da amostra e à taxa de perfusão.
- Mantenha uma taxa de perfusão de pelo menos 0,5 mL/min para obter a onda b.
NOTA: Uma taxa de perfusão mais elevada de 1-2 ml/min é preferível para manter uma resposta grande e estável das células ON-bipolares. - Certifique-se de que, para uma determinada taxa de perfusão, a temperatura no suporte da amostra perto da retina esteja próxima da temperatura corporal (ou seja, aproximadamente 35-38 °C).
NOTA: É importante ajustar a temperatura do perfusato, que é aquecido antes de atingir o suporte da amostra ERG ex vivo , de modo que esteja dentro da faixa de temperatura ideal na retina. - Armazene copos oculares para experimentação posterior protegidos da luz e em meio oxigenado de Ames à temperatura ambiente para manter as ondas a e b normais por várias horas.
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Representative Results
Ex vivo O ERG permite o registro de fotorreceptores reprodutíveis e estáveis e respostas de luz de células ON-bipolares, por exemplo, da retina do camundongo (Figura 2A-C). O registro das respostas fotorreceptoras das retinas dos doadores humanos é possível com até 5 h de atraso post-mortem da enucleação (Figura 2D) e das respostas das células ON-bipolares com um atraso de enucleação de <20 min (Figura 2E). Parâmetros importantes para a obtenção de grandes respostas incluem uma técnica de dissecção cuidadosa, alta taxa de perfusão e temperatura de perfusão próxima aos valores fisiológicos (35-38 °C na retina de mamíferos). Nessas condições, as amplitudes de resposta e a cinética em ambos os tipos celulares permaneceram relativamente estáveis ao longo do tempo, mas diminuíram lentamente aproximadamente 40-45 min após a montagem das retinas no suporte do espécime (Figura 3).
Em comparação com os fotorreceptores, a função celular ON-bipolar é mais facilmente interrompida, por exemplo, por danos à retina durante a dissecção e montagem ou por uma queda na temperatura e / ou velocidade de perfusão. Embora a temperatura reduzida no suporte da amostra tenha retardado muito a cinética de ambos os fotorreceptores e células ON-bipolares, diminuiu a amplitude da onda b, mas não da onda A (Figura 4A). Por outro lado, a desaceleração da taxa de perfusão de 2,1 mL/min para 0,6 mL/min reduziu as amplitudes das respostas das células fotorreceptoras e ON-bipolares, mas não afetou o tempo implícito (tempo desde o início do estímulo até o pico de resposta) da onda a ou B (Figura 4B). A cessação da perfusão por 10 min seguida de reperfusão resultou em uma perda completa da função celular ON-bipolar com respostas fotorreceptoras preservadas (Figura 5).
Figura 1: Suporte de espécime de eletrorretinograma ex vivo e configuração de registro . (A,B) O suporte de amostra ERG ex vivo compreende uma cúpula para montar a retina isolada, que é conectada a uma linha de perfusão para fornecer continuamente o meio de Ames. Os eletrodos são conectados através de canais estreitos ao lado fotorreceptor da retina através da linha de perfusão e à retina interna através do papel de filtro colado à cúpula. Esses eletrodos são conectados a um amplificador diferencial, que permite a medição de diferenças de potencial na retina em resposta a estímulos luminosos. (C) O suporte da amostra é colocado no palco de um microscópio, que foi modificado para fornecer flashes de luz e conectado à linha de perfusão, que fornece o meio de Ames aquecido e oxigenado por gravidade. Toda a configuração de gravação é protegida por uma gaiola de Faraday para minimizar o ruído elétrico. Este valor foi modificado de 9. Abreviação: ERG = eletrorretinograma. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de vestígios de fotorreceptores ex vivo e respostas celulares ON-bipolares. A adição de agentes farmacológicos ao perfusato permite quantificar as contribuições de tipos individuais de células da retina para o eletrorretinograma ex vivo. As respostas de luz do fotorreceptor (RP) são isoladas na presença de cloreto de bário de 100 μM (BaCl2), um bloqueador de canais K+ expressos pelas células gliais de Müller, bem como de 40 μM de DL-AP4, um bloqueador do receptor de glutamato, que inibe a transmissão de sinal dos fotorreceptores para as células ON-bipolares (B). A função (C) da célula bipolar ON (ON-BPC) é determinada subtraindo o componente fotorreceptor (B) do fotorreceptor combinado e da resposta celular bipolar ON na presença de cloreto de bário isolado (A). As respostas de luz dos fotorreceptores podem ser obtidas de retinas de doadores humanos com um atraso de morte por enucleação de <5 h (D), enquanto as retinas enucleadas dentro de 20 minutos após a morte frequentemente também dão respostas de células ON-bipolares (E) (ver 8 para mais informações). A Figura 2A-C é modificada a partir de 9. Abreviaturas: PR = fotorreceptor; ON-BPC = célula ON-bipolar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estabilidade do fotorreceptor e da função das células ON-bipolar no eletrorretinograma ex vivo ao longo do tempo . (A) As respostas à luz foram registradas a cada minuto a partir dos fotorreceptores isolados na presença de cloreto de bário de 100 μM e DL-AP4 de 40 μM. (B) Flashes de luz fraca na presença de cloreto de bário de 100 μM sozinhos são fortemente dominados pela função celular ON-bipolar, embora contenham um pequeno componente fotorreceptor. As respostas à luz das retinas isoladas geralmente se estabilizam após a perfusão do suporte da amostra ex vivo por 15-20 min, e permaneceram estáveis por pelo menos 20-25 min antes de começarem a declinar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Respostas combinadas de fotorreceptores e células ON-bipolares em diferentes temperaturas e velocidades de perfusão . (A) A redução da temperatura dentro do suporte da amostra de 37 °C para temperatura ambiente diminuiu muito a cinética fotorreceptora e celular ON-bipolar, mas apenas reduziu a amplitude da célula ON-bipolar no fotorreceptor misto e na resposta celular ON-bipolar. (B) A redução da taxa de perfusão de 2,1 mL/min para 0,6 mL/min resultou em diminuição das amplitudes fotorreceptoras e das células ON-bipolares, mas nenhuma alteração na cinética de resposta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: As respostas das células ON-bipolar são mais sensíveis à cessação da perfusão. (A) Grandes respostas fotorreceptoras e células ON-bipolar foram registradas após a perfusão com 2,1 mL/min por 20 min. (B) Após a cessação da perfusão por 10 min seguida de reperfusão por 10 min a 2,1 mL/min, as respostas fotorreceptoras estavam presentes, enquanto as respostas das células ON-bipolares foram completamente perdidas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Originalmente desenvolvido em 1865 por Holmgren para medir as respostas de luz da retina a partir da retina do anfíbio10, restrições técnicas inicialmente impediram que o ERG fosse amplamente utilizado. No entanto, estudos seminais de Ragnar Granit e outros identificaram as origens celulares do ERG e mediram as respostas fotorreceptoras e celulares ON-bipolar ex vivo11,12,13. Desde então, métodos refinados têm permitido o uso mais difundido de registros ERG ex vivo 14,15, embora as amplitudes de resposta, particularmente as de células ON-bipolares, tenham permanecido comparativamente pequenas 16. Para superar essas limitações, a função da retina é hoje mais comumente medida com ERG in vivo, apesar das restrições experimentais e da interpretação mais complicada das formas de onda registradas. Embora o ERG ex vivo tente replicar as condições fisiológicas o mais próximo possível, ele mede a função da retina em um ambiente artificial e na ausência de fatores sistêmicos e alterações patológicas. No entanto, quando combinada com o ERG in vivo, essa limitação pode ser utilizada para responder a questões importantes, como se as alterações na função retiniana na doença são intrínsecas às células da retina ou causadas por alterações sistêmicas17.
Recentemente, os recém-projetados detentores de espécimes ex vivo do ERG simplificaram a metodologia, tornando o ERG ex vivo acessível a uma comunidade de pesquisa mais ampla 2,3,5,18. As modificações nos equipamentos existentes de patch clamp ou multieletrodos descritos neste protocolo permitirão que mais laboratórios realizem ERG ex vivo com investimentos financeiros mínimos e requisitos de espaço. Em particular, os recentes desenvolvimentos na tecnologia ERG ex vivo amplificaram a capacidade de resposta das retinas isoladas de mamíferos e resultaram em uma relação sinal-ruído superior, que permanece boa, apesar das etapas adicionais de amplificação descritas neste protocolo. No entanto, o declínio das respostas à luz, principalmente das células ON-bipolares19, talvez tenha dificultado o uso mais difundido do ERG ex vivo. O uso do meio de Ames ou Locke resulta em maiores respostas fotorreceptoras e células ON-bipolares, tornando-os preferíveis a, por exemplo, solução de Ringer tamponada com HEPES para ERG3 ex vivo. Outros laboratórios estabilizaram a função celular ON-bipolar ex vivo por suplementação com glutamina ou glutamato19. Este relato demonstra como obter respostas luminosas grandes e estáveis de retinas isoladas, inclusive de olhos de doadores humanos, conforme relatado anteriormente8.
Parâmetros experimentais importantes incluem a temperatura da retina, que deve ser mantida dentro da faixa fisiológica, e uma rápida taxa de perfusão. Os efeitos mais perceptíveis da redução da temperatura no suporte da amostra ERG ex vivo são cinética de resposta mais lenta em ambos os fotorreceptores e células ON-bipolares e uma amplitude celular ON-bipolar atenuada. Embora a redução da temperatura pareça ter pouco efeito sobre a amplitude do fotorreceptor na resposta combinada de fotorreceptores e células ON-bipolares, isso pode ser um artefato devido a mudanças diferenciais na cinética de resposta de ambos os tipos de células.
Uma taxa de perfusão suficiente parece ser especialmente crítica para a função da retina, com maior probabilidade de fornecer oxigênio e nutrientes e remover resíduos. Embora as amplitudes das células fotorreceptoras e ON-bipolar sejam um pouco diminuídas por uma redução moderada na taxa de perfusão, mesmo uma curta cessação da perfusão aboliu a função ON-bipolar, mas não fotorreceptora. Isso implica que as respostas fotorreceptoras são mais robustas e podem ser mais facilmente preservadas em olhos que sofrem experimentação com atraso significativo, como os olhos de doadores humanos8. Neste contexto, é notável que a função celular ON-bipolar não é diminuída pelo armazenamento de copos oculares em meio oxigenado de Ames por várias horas. Portanto, levantamos a hipótese de que a perda da função das células ON-bipolares quando a perfusão no suporte da amostra ex vivo é interrompida pode ser devido ao rápido esgotamento de oxigênio e outros nutrientes no pequeno volume ao redor da retina no suporte da amostra. Isso é apoiado por relatos de que um pequeno atraso da morte para a enucleação é fundamental para registrar as respostas fotorreceptoras e, particularmente, das células ON-bipolares das retinas humanas, e que a hipóxia post-mortem é o candidato mais provável para danos irreversíveis à função neuronal da retina8. Embora os parâmetros experimentais para o ERG ex vivo tenham sido otimizados na retina de camundongos, eles melhoraram com sucesso as condições de registro de espécimes de retina de grandes animais e olhos de doadores humanos.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do National Eye Institute EY02665 e EY031706 e pela International Retinal Research Foundation para o Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800) e uma Concessão Irrestrita de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Nova York, NY, para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Utah. O Dr. Frans Vinberg também recebeu um Prêmio de Pesquisa para Prevenir a Cegueira / Dr. H. James e Carole Free Career Development e a Dra. Silke Becker de uma bolsa ARVO EyeFind. Agradecemos à Dra. Anne Hanneken, do Instituto de Pesquisa Scripps, por fornecer o olho doador usado para gravações mostradas na Figura 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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