Summary
Modifisering av eksisterende multielektrode array eller patch clamp utstyr gjør ex vivo elektroretinogrammet mer allment tilgjengelig. Forbedrede metoder for å registrere og vedlikeholde ex vivo lysresponser letter studiet av fotoreseptor og ON-bipolar cellefunksjon i den sunne netthinnen, dyremodeller av øyesykdommer og humane donor retinas.
Abstract
Målinger av retinale nevronale lysresponser er avgjørende for å undersøke fysiologien til den sunne netthinnen, bestemme patologiske endringer i retinale sykdommer og teste terapeutiske inngrep. Ex vivo elektroretinogrammet (ERG) tillater kvantifisering av bidrag fra individuelle celletyper i den isolerte netthinnen ved tilsetning av spesifikke farmakologiske midler og evaluering av vevsintrinsiske endringer uavhengig av systemiske påvirkninger. Retinale lysresponser kan måles ved hjelp av en spesialisert ex vivo ERG-prøveholder og opptaksoppsett, modifisert fra eksisterende patchklemme eller mikroelektrodeutstyr. Spesielt har studien av ON-bipolare celler, men også av fotoreceptorer, blitt hindret av den langsomme, men progressive nedgangen i lysresponser i ex vivo ERG over tid. Økt perfusjonshastighet og justering av perfusattemperaturen forbedrer ex vivo retinal funksjon og maksimerer responsamplitude og stabilitet. Ex vivo ERG tillater unikt studiet av individuelle retinale nevroncelletyper. I tillegg tillater forbedringer for å maksimere responsamplituder og stabilitet undersøkelse av lysresponser i retinaprøver fra store dyr, så vel som menneskelige donorøyne, noe som gjør ex vivo ERG til et verdifullt tillegg til repertoaret av teknikker som brukes til å undersøke retinal funksjon.
Introduction
Elektroretinografi måler retinal funksjon som respons på lys1. Det er integrert i å studere retinal fysiologi og patofysiologi, og måle suksessen til terapier for retinale sykdommer. In vivo ERG er mye brukt til å vurdere retinal funksjon i intakte organismer, men den har betydelige begrensninger 2,3. Blant disse hindres den kvantitative analysen av individuelle retinale celletyper i in vivo ERG, siden den registrerer summen av potensielle endringer, og dermed overliggende responser, fra alle retinale celler til lysstimuli4. Videre tillater det ikke lett tilsetning av narkotika til netthinnen, er sårbar for systemiske påvirkninger, og har et relativt lavt signal-til-støy-forhold. Disse ulempene elimineres i ex vivo ERG som undersøker funksjonen til den isolerte netthinnen 2,3,5,6. Ex vivo ERG tillater registrering av store og stabile responser fra spesifikke retinale celletyper ved tilsetning av farmakologiske hemmere og enkel evaluering av terapeutiske midler, som kan legges til superfusatet. Samtidig fjerner det påvirkninger av systemiske effekter og eliminerer fysiologisk støy (f.eks. Hjerteslag eller pust).
I ex vivo ERG isoleres netthinner eller retinale prøver og monteres fotoreseptorsiden opp på kuppelen til prøveholderen 3,5. Prøveholderen er montert, koblet til et perfusjonssystem som forsyner netthinnen med oppvarmede, oksygenerte medier, og plassert på scenen i et mikroskop, som er modifisert for å levere datastyrte lysstimuli. For å registrere responsene fremkalt av lys, kobles prøveholderen til en forsterker, digitaliseringsenhet og opptakssystem (figur 1). Denne teknikken tillater isolering av responser fra stang- og kjeglefotoreceptorer, ON-bipolare celler og Müller glia ved å endre parametrene for lysstimuli og legge til farmakologiske midler.
En eksisterende patch clamp eller multi-electrode array (MEA) oppsett kan konverteres til posten ex vivo ERG, enten i forbindelse med en kommersielt tilgjengelig ex vivo ERG adapter eller en tilpasset polykarbonat datamaskin numerisk kontroll (CNC) -maskinert prøveholder, for å måle lysresponser i netthinner fra små dyr modeller, for eksempel mus. Denne modifikasjonen øker tilgjengeligheten til ex vivo ERG samtidig som behovet for spesialutstyr minimeres. Utformingen av prøveholderen forenkler monteringsteknikken og integrerer elektroder, og eliminerer behovet for manipulering av mikroelektroder sammenlignet med tidligere rapporterte transretinale ex vivo ERG-metoder7. Perfusjonshastigheten og temperaturen inne i prøveholderen er viktige faktorer som påvirker responsegenskapene fra fotoreseptorer og ON-bipolare celler. Ved å justere disse forholdene kan ex vivo ERG registreres pålitelig fra den isolerte musehinnen over lengre perioder. Optimaliserte eksperimentelle forhold tillater ex vivo ERG-opptak i retinale slag fra større netthinner, inkludert store dyreøyne og menneskelige donorøyne8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med mus ble utført i samsvar med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og ble godkjent av Institutional Animal Studies Committee ved University of Utah. Griseøyne for demonstrasjon av denne videoen ble hentet postmortem fra slakteriet (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Øyne ble hentet fra menneskelige givere etter hjerne- eller hjertedød med samtykke til forskningsbruk gjennom Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank eller Lifesharing, som er fullt akkreditert av FDA, Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) og Eye Banks of America Association. Bruken av menneskelige donorøyne hadde fritatt status ved University of Utah (IRB nr. 00106658) og ScrippsHealth IRB (IRB nr. 16-6781).
1. Sette opp ex vivo ERG
- For å konvertere et multielektrode-arrayoppsett, koble ex vivo ERG-prøveholderen via et hodetrinn til en differensialforsterker, som er koblet til den analoge inngangen til grensesnittkortet til multielektrode-array-systemet. Bruk opptaksprogramvaren for multielektrodematrisen til å registrere og lagre inngangsdataene fra ex vivo ERG. Still forsterkningen til differensialforsterkeren til 100 og legg til en ekstra 10x spenningsforsterkning avhengig av digitaliseringsspesifikasjonene. Sett lavpassfilteret til 100 Hz.
- For å konvertere et patchklemmeoppsett, koble ex vivo ERG-prøveholderen via et hodetrinn til en differensialforsterker, som er koblet til hovedtrinnet til patchklemmeforsterkeren. Bruk patch clamp system-programvaren og digitaliseringsprogrammet til å registrere og lagre inngangsdataene fra ex vivo ERG. Still forsterkningen til differensialforsterkeren til 100 og påfør en ekstra 10x spenningsforsterkning via patchklemmehodet. Sett lavpassfilteret til 100 Hz.
- Koble lysdioder med passende bølgelengder (f.eks. ca. 530 nm for å fremkalle stangfotoreseptor og ON-bipolar cellerespons) til mikroskopet. Kontroller lysdiodene med opptaksprogramvare som gjør det mulig å utløse lysstimuli. For å kontrollere lysstimuli, bruk en LED-driver styrt av analoge utganger fra en digitaliseringsenhet.
- Kalibrer lyseffekten til lysdiodene ved netthinnens posisjon i prøveholderen ved hjelp av en fotodiode. Sett om nødvendig filtre med nøytral tetthet inn i lysbanen for å dempe lysintensiteten.
- Bruk en kommersielt tilgjengelig eller spesialbygd ex vivo ERG-prøveholder.
MERK: Tegninger for CNC-bearbeiding fra polykarbonat kan fås fra forfatterne på forespørsel. - For å klargjøre elektroden, sett inn en Ag / AgCl pelletselektrode i en gjenget luerkontakt. Fyll innsiden av luerkontakten med varmt lim og sett en 2 mm stikkontakt inn i det varme limet fra den ikke-gjengede siden. Lodd en sølvtråd av EP1-elektroden til 2 mm-kontakten. Skru den ferdige elektroden, med en o-ring på gjengen, inn i elektrodeportene til ex vivo ERG-prøveholderen.
MERK: Elektroder kan brukes i lang tid. Hvis pelletsoverflaten samler smuss og/eller blir mørk (dette kan forårsake høy offsetspenning og/eller elektrisk drift), kan den "poleres" med fint sandpapir. - Minst 1 dag før eksperimentering limer du filterpapirer på kuplene til ex vivo ERG-prøveholderen ved hjelp av epoksylim, slik at limet ikke hindrer elektrodekanalen (se 3 for video).
2. Dyr forberedelse
- Mørk tilpasse dyr i minst 6 timer eller over natten.
3. Forberedelse av utstyr
- Fyll perfusjonslinjen til ex vivo ERG med Ames' medium boblet med 5 % karbondioksid og 95 % oksygen. Koble perfusjonsledningen til et varmeelement med en likestrømskilde eller varmeregulator nær prøveholderen for å varme Ames medium, slik at netthinnen holdes på omtrent 35-38 °C.
- Fyll begge halvdelene av ex vivo ERG-prøveholderen med elektrodeløsning, forsegl perfusjonslinjen med luerpropper, koble elektrodene og monter prøveholderen med fire skruer (se 3 for video).
- Kontroller motstanden og forskyvningsspenningen mellom elektrodene i den monterte prøveholderen ved å sette multimeterprobene inn i elektrodene.
MERK: Hvis det ikke er noen blokkeringer, og elektrodene er i god stand, bør motstanden være under 100 kΩ og forskyvningsspenningen under 5 mV. - Koble den monterte prøveholderen til perfusjonslinjen og sett på scenen til et mikroskop som er satt opp for å levere lysblink. Forsikre deg om at prøveholderen og perfusjonsslangen ikke inneholder luftbobler.
4. Vevspreparasjon
- Ofre dyret med CO2 og umiddelbart enucleate øynene, eller få store dyr eller menneskelige donor øyne.
- Rengjør kloden av gjenværende bindevev og ekstraokulære muskler. Trim av optisk nerve.
- På filterpapir legger du forsiktig et lite snitt med et barberblad langs ora serrata, ca. 1 mm fra limbusen i museøyet. Sett fin vannas saks inn i snittet og kutt langs limbus for å fjerne den fremre delen av øyet med linsen.
- Flytt øyekoppen i et fat som inneholder Ames medium. Ta tak i scleraen med fine tang, pass på at du ikke berører netthinnen. Sett vannas saks mellom netthinnen og sclera og klipp sclera fra periferien mot den sentrale delen. Pass på at du ikke berører eller skader netthinnen.
- Immobiliser scleraen ved å holde den ene siden av snittet med vannassaks mot bunnen av disseksjonsskålen. Ta tak i scleraen med tang på den andre siden av snittet. Fjern sclera uten å berøre eller skade netthinnen ved å trekke fra hverandre sclera på hver side av snittet for å tillate isolering av netthinnen med minimal skade på vevet.
- Fjern det fremre segmentet med linsen fra det andre øyet og oppbevar øyekoppen ved romtemperatur i Ames 'løsning boblet med 5% karbondioksid og 95% oksygen.
MERK: Funksjonelle lysresponser fra øyne lagret på denne måten kan oppnås i flere timer. - I store øyne, inkludert menneskelige donorøyne, rengjør kloden av det gjenværende bindevevet og fjern det fremre segmentet og linsen, på samme måte som prosedyren beskrevet for museøyet. Bruk en skalpell til å lage et kutt ca 3 mm fra limbus. Sett buet disseksjonssaks inn i snittet og kutt langs limbus for å fjerne den fremre delen av øyet med linsen. Oppnå retinale prøver for ex vivo elektroretinografi med en 3-6 mm engangs biopsi punch.
5. Montering av vevet på prøveholderen
- Plasser den nedre halvdelen av prøveholderen i en stor petriskål og fyll med oksygenert Ames 'medium slik at kuppelen på prøveholderen bare er nedsenket.
- Ta forsiktig tak i kanten av netthinnen med fine tang og overfør netthinnen til kuppelen på ex vivo-prøveholderen , fotoreseptorsiden som vender opp.
- Løft prøveholderen fra Ames 'løsning, og pass på at netthinnen holder seg på plass.
- Tørk platen på prøveholderen helt for å minimere støy, elektrisk crosstalk og signal shunting.
- Monter begge halvdelene av prøveholderen med fire skruer og koble perfusjonslinjen. Tørk elektroden i den nedre halvdelen av prøveholderen og koble anodekabelen til den indre retinalsiden og katodekabelen til fotoreseptorsiden.
- Fest prøveholderen med minst 1 ml/min oksygenert Ames' medium i 10-20 minutter for å gi tid til at lysresponsene stabiliserer seg.
6. Opptak av retinal neuronal cellefunksjon
- Registrer responsfamilier ved å utsette netthinnen for lysblink med økende intensitet. For eksempel, registrer musestangfotoreceptorresponsfamilier med lysintensiteter fra ca. 10 til 1000 fotoner / μm 2 og de fra mus ON-bipolare celler med lysintensiteter fra ca. 0,6 til 20 fotoner / μm2.
- Måle fotoreseptorlysresponser (a-bølge) i nærvær av 100 μM bariumklorid, som blokkerer kaliumkanaler i Müller gliaceller, og 40 μM DL-AP4, som blokkerer glutamaterg signaloverføring til ON-bipolare celler (figur 2B).
- For å isolere b-bølgen, som stammer fra funksjonen til ON-bipolare celler, registrerer først kombinerte lysresponser fra både fotoreseptor- og ON-bipolare celler i nærvær av bariumklorid alene (figur 2A). Deretter kan du lese i 5-10 minutter med Ames medium som inneholder bariumklorid, samt DL-AP4, og registrere fotoreseptorresponser på de samme lysstimuliene som før (figur 2B). Trekk fotoreseptorresponser fra kombinerte fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser, og beregn dermed ON-bipolar cellelysrespons alene (figur 2C).
7. Optimalisering av ON-bipolar cellefunksjon
MERK: b-bølgen, som stammer fra ON-bipolare celler, er svært følsom for temperaturen i prøveholderen og perfusjonshastigheten.
- Oppretthold en perfusjonshastighet på minst 0,5 ml/min for å oppnå b-bølgen.
MERK: En høyere perfusjonshastighet på 1-2 ml/min er å foretrekke for å opprettholde en stor og stabil respons fra ON-bipolare celler. - Sørg for at temperaturen i prøveholderen nær netthinnen er nær kroppstemperaturen (dvs. ca. 35-38 °C) for en gitt perfusjonshastighet.
NOTAT: Det er viktig juster temperaturen på perfusatet, som oppvarmes før det når ex vivo ERG-prøveholderen, slik at det er innenfor det optimale temperaturområdet på netthinnen. - Oppbevar øyekopper for senere eksperimentering beskyttet mot lys og i oksygenert Ames 'medium ved romtemperatur for å opprettholde normale a- og b-bølger i flere timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG muliggjør registrering av reproduserbare og stabile fotoreseptor- og ON-bipolare cellelysresponser, for eksempel fra musens netthinne (figur 2A-C). Registrering av fotoreseptorresponser fra humane donor retinas er mulig med opptil 5 timers postmortem forsinkelse av enukleasjon (figur 2D) og av ON-bipolare celleresponser med en forsinkelse på <20 min enukleasjon (figur 2E). Viktige parametere for å oppnå store responser inkluderer en forsiktig disseksjonsteknikk, høy perfusjonshastighet og perfusjonstemperatur nær fysiologiske verdier (35-38 °C i pattedyrs netthinne). Under disse forholdene var responsamplituder og kinetikk i begge celletyper relativt stabile over tid, men avtok sakte ca. 40-45 minutter etter at netthinner ble montert på prøveholderen (figur 3).
Sammenlignet med fotoreceptorer blir ON-bipolar cellefunksjon lettere forstyrret, for eksempel ved skade på netthinnen under disseksjon og montering eller ved fall i temperatur og / eller perfusjonshastighet. Mens redusert temperatur i prøveholderen i stor grad reduserte kinetikken til både fotoreceptorer og ON-bipolare celler, reduserte den amplituden til b-bølgen, men ikke a-bølgen (figur 4A). Omvendt reduserte senking av perfusjonshastigheten fra 2,1 ml / min til 0,6 ml / min amplitudene til både fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser, men påvirket ikke den implisitte tiden (tiden fra stimulusutbrudd til responstopp) for verken a- eller b-bølgen (figur 4B). Seponering av perfusjon i 10 minutter etterfulgt av reperfusjon resulterte i fullstendig tap av ON-bipolar cellefunksjon med bevart fotoreseptorrespons (figur 5).
Figur 1: Ex vivo elektroretinogram prøveholder og opptaksoppsett . (A,B) Ex vivo ERG-prøveholderen består av en kuppel for å montere den isolerte netthinnen, som er koblet til en perfusjonslinje for kontinuerlig å levere Ames medium. Elektroder er koblet gjennom smale kanaler til både fotoreseptorsiden av netthinnen via perfusjonslinjen og den indre netthinnen gjennom filterpapiret limt til kuppelen. Disse elektrodene er koblet til en differensialforsterker, som muliggjør måling av potensielle forskjeller i netthinnen som respons på lysstimuli. (C) Prøveholderen plasseres på scenen til et mikroskop, som er modifisert for å levere lysblink og koblet til perfusjonslinjen, som leverer oppvarmet, oksygenert Ames 'medium ved tyngdekraften. Hele opptaksoppsettet er skjermet av et Faraday-bur for å minimere elektrisk støy. Dette tallet er endret fra 9. Forkortelse: ERG = elektroretinogram. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på spor av ex vivo fotoreseptor og ON-bipolar cellerespons. Tilsetning av farmakologiske midler til perfusatet tillater kvantifisering av bidrag fra individuelle retinale celletyper til ex vivo elektroretinogrammet. Fotoreseptor (PR) lysrespons isoleres i nærvær av 100 μM bariumklorid (BaCl2), en blokkering av K + kanaler uttrykt av Müller gliaceller, samt 40 μM DL-AP4, en glutamatreseptorblokker, som hemmer signaloverføring fra fotoreceptorer til ON-bipolare celler (B). ON-bipolar cellefunksjon (ON-BPC) (C) bestemmes ved å trekke fotoreseptorkomponenten (B) fra den kombinerte fotoreseptoren og ON-bipolar cellerespons i nærvær av bariumklorid alene (A). Fotoreseptorlysrespons kan fås fra humane donor retinas med en død til enukleasjonsforsinkelse på <5 timer (D), mens retinas enukleert innen 20 minutters død ofte også gir ON-bipolar cellerespons (E) (se 8 for ytterligere informasjon). Figur 2A-C er modifisert fra 9. Forkortelser: PR = fotoreseptor; ON-BPC = ON-bipolar celle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Stabilitet av fotoreseptor og ON-bipolar cellefunksjon i ex vivo elektroretinogrammet over tid . (A) Lysrespons ble registrert hvert minutt fra fotoreseptorer alene i nærvær av både 100 μM bariumklorid og 40 μM DL-AP4. (B) Svake lysblink i nærvær av 100 μM bariumklorid alene er sterkt dominert av ON-bipolar cellefunksjon, selv om de inneholder en liten fotoreseptorkomponent. Lysresponser fra isolerte netthinner stabiliserer seg vanligvis etter å ha perfusert ex vivo-prøveholderen i 15-20 minutter, og var stabile i minst 20-25 minutter før de begynte å avta. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kombinerte fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser ved forskjellige temperaturer og perfusjonshastigheter . (A) Senking av temperaturen inne i prøveholderen fra 37 °C til romtemperatur reduserte fotoreseptoren og ON-bipolar cellekinetikken kraftig, men reduserte bare ON-bipolar celleamplituden i den blandede fotoreseptoren og ON-bipolar cellerespons. (B) Reduksjon av perfusjonshastigheten fra 2,1 ml/min til 0,6 ml/min resulterte i redusert fotoreseptor og ON-bipolare celleamplituder, men ingen endring i responskinetikken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: ON-bipolar cellerespons er mer følsom for seponering av perfusjon. (A) Store fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser ble registrert etter perfusjon med 2,1 ml/min i 20 minutter. (B) Etter seponering av perfusjon i 10 minutter etterfulgt av reperfusjon i 10 minutter ved 2,1 ml/min, var fotoreseptorrespons til stede, mens ON-bipolare celleresponser gikk helt tapt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opprinnelig utviklet i 1865 av Holmgren for å måle retinal lysrespons fra amfibie retina10, forhindret tekniske begrensninger i utgangspunktet ERG fra å bli mye brukt. Likevel identifiserte banebrytende studier av Ragnar Granit og andre den cellulære opprinnelsen til ERG og målte fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser ex vivo11,12,13. Siden da har raffinerte metoder tillatt mer utbredt bruk av ex vivo ERG-opptak 14,15, selv om responsamplituder, spesielt de fra ON-bipolare celler, forblir relativt små 16. For å overvinne disse begrensningene måles retinalfunksjonen i dag mer vanlig med in vivo ERG, til tross for eksperimentelle begrensninger og mer komplisert tolkning av de registrerte bølgeformene. Selv om ex vivo ERG forsøker å replikere fysiologiske forhold så nært som mulig, måler det likevel retinal funksjon i et kunstig miljø og i fravær av systemiske faktorer og patologiske forandringer. Når denne begrensningen kombineres med in vivo ERG, kan den imidlertid brukes til å svare på viktige spørsmål, for eksempel om endringer i retinalfunksjonen ved sykdom er iboende i retinale celler eller forårsaket av systemiske endringer17.
Nylig har nydesignede ex vivo ERG-prøveinnehavere forenklet metodikken, noe som gjør ex vivo ERG tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø 2,3,5,18. Modifikasjoner på eksisterende patchklemme eller multielektrode array utstyr beskrevet i denne protokollen vil gjøre det mulig for flere laboratorier å utføre ex vivo ERG med minimale økonomiske investeringer og plassbehov. Spesielt har den siste utviklingen i ex vivo ERG-teknologi forsterket responsen til pattedyrs isolerte netthinner og resultert i et overlegent signal-til-støy-forhold, som forblir bra til tross for ytterligere forsterkningstrinn beskrevet i denne protokollen. Likevel har nedgangen i lysresponsene, hovedsakelig fra ON-bipolare celler19, kanskje hindret den mer utbredte bruken av ex vivo ERG. Bruken av Ames eller Lockes medium resulterer i større fotoreseptor- og ON-bipolare celleresponser, noe som gjør dem å foretrekke fremfor for eksempel HEPES-bufret Ringer-løsning for ex vivo ERG3. Andre laboratorier stabiliserte ex vivo ON-bipolar cellefunksjon ved å supplere med glutamin eller glutamat19. Denne rapporten viser hvordan man oppnår store og stabile lysresponser fra isolerte netthinner, inkludert fra menneskelige donorøyne, som tidligere rapportert8.
Viktige eksperimentelle parametere inkluderer temperaturen på netthinnen, som bør holdes innenfor det fysiologiske området, og en rask perfusjonshastighet. De mest merkbare effektene av å senke temperaturen i ex vivo ERG-prøveholderen er langsommere responskinetikk i både fotoreceptorer og ON-bipolare celler og en svekket ON-bipolar celleamplitude. Selv om senking av temperaturen ser ut til å ha liten effekt på fotoreseptoramplituden i den kombinerte responsen fra fotoreseptorer og ON-bipolare celler, kan dette være en artefakt på grunn av differensielle endringer i responskinetikken fra begge celletyper.
En tilstrekkelig perfusjonshastighet ser ut til å være spesielt kritisk for retinal funksjon, mest sannsynlig å levere oksygen og næringsstoffer og fjerne avfallsprodukter. Mens både fotoreseptor- og ON-bipolare celleamplituder reduseres noe av en moderat reduksjon i perfusjonshastigheten, avskaffet selv en kort opphør av perfusjon ON-bipolar, men ikke fotoreseptorfunksjon. Dette innebærer at fotoreseptorresponsene er mer robuste og lettere kan bevares i øyne som gjennomgår eksperimentering med en betydelig forsinkelse, for eksempel menneskelige donorøyne8. I denne sammenheng er det bemerkelsesverdig at ON-bipolar cellefunksjon ikke reduseres ved å lagre øyekopper i oksygenert Ames 'medium i flere timer. Vi antar derfor at tapet av ON-bipolar cellefunksjon når perfusjonen i ex vivo prøveholderen stoppes, kan skyldes rask uttømming av oksygen og andre næringsstoffer i det lille volumet som omgir netthinnen i prøveholderen. Dette støttes av rapporter om at en kort forsinkelse fra død til enukleasjon er kritisk for å registrere fotoreseptor og spesielt ON-bipolar cellerespons fra humane netthinner, og at postmortemhypoksi er den mest sannsynlige kandidaten for irreversibel skade på retinal neuronal funksjon8. Mens eksperimentelle parametere for ex vivo ERG ble optimalisert i musens netthinne, forbedret de likevel opptaksforholdene for retinale prøver fra store dyr og menneskelige donorøyne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute tilskudd EY02665 og EY031706 og International Retinal Research Foundation til Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), og et ubegrenset stipend fra forskning for å forhindre blindhet, New York, NY, til Institutt for oftalmologi og visuell vitenskap, University of Utah. Dr. Frans Vinberg er også mottaker av en Research to Prevent Blindness / Dr. H. James og Carole Free Career Development Award, og Dr. Silke Becker av en ARVO EyeFind stipend. Vi takker Dr. Anne Hanneken fra Scripps Research Institute for å gi donorøyet som brukes til opptak vist i figur 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
