기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막 신경 광 반응의 측정은 건강한 망막의 생리학을 조사하고, 망막 질환의 병리학 적 변화를 결정하고, 치료 적 개입을 테스트하는 데 중요합니다. 생체 외 망막 전도(ERG)를 사용하면 특정 약리학적 제제를 추가하고 전신 영향과 독립적으로 조직 내재적 변화를 평가하여 분리된 망막의 개별 세포 유형에서 기여도를 정량화할 수 있습니다. 망막 광 반응은 기존 패치 클램프 또는 미세 전극 어레이 장비에서 수정된 특수 생체 외 ERG 시편 홀더 및 기록 설정을 사용하여 측정할 수 있습니다. 특히, ON- 양극성 세포뿐만 아니라 광 수용체에 대한 연구는 시간이 지남에 따라 생체 외 ERG에서 빛 반응의 느리지 만 점진적인 감소로 인해 방해를 받았다. 관류 속도 증가 및 관류액 온도 조정은 생체 외 망막 기능을 향상시키고 응답 진폭과 안정성을 극대화합니다. 생체 외 ERG는 개별 망막 신경 세포 유형에 대한 연구를 독특하게 허용합니다. 또한 반응 진폭과 안정성을 최대화하기 위한 개선을 통해 대형 동물의 망막 샘플과 인간 기증자의 눈에서 빛 반응을 조사할 수 있으므로 생체 외 ERG는 망막 기능을 조사하는 데 사용되는 기술의 레퍼토리에 귀중한 추가 기능이 됩니다.
서론
전기 망막 촬영은 빛에 대한 반응으로 망막 기능을 측정합니다1. 망막 생리학 및 병태생리학을 연구하고 망막 질환 치료의 성공을 측정하는 데 필수적입니다. 생체 내 ERG는 손상되지 않은 유기체에서 망막 기능을 평가하는 데 널리 사용되지만 상당한 한계가 있습니다 2,3. 이 중 생체 내 ERG에서 개별 망막 세포 유형의 정량 분석은 모든 망막 세포에서 빛 자극4에 이르는 잠재적 변화의 합을 기록하고 따라서 반응을 오버레이하기 때문에 방해를 받습니다. 또한 망막에 약물을 쉽게 첨가 할 수 없으며 전신 영향에 취약하며 신호 대 잡음비가 상대적으로 낮습니다. 이러한 단점은 단리된 망막 2,3,5,6의 기능을 조사하는 생체외 ERG에서 제거된다. ex vivo ERG는 약리학적 억제제를 첨가하고 과염기에 첨가할 수 있는 치....
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프로토콜
마우스를 사용한 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었으며 유타 대학의 기관 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다. 이 비디오의 시연을 위한 돼지 눈은 도축장(지속 가능한 돼지 자원, 존슨빌)에서 사후 검시를 받았습니다. 눈은 FDA, 장기 조달 기관 협회 (AOPO) 및 미국 안구 은행 협회의 정식 인증을받은 유타 라이온스 안구 은행, 샌디에이고 안구 은행 또는 Lifesharing을 통해 연구 사용에 대한 동의를 받아 뇌 또는 심장사 후 인간 기증자로부터 얻었습니다. 인간 기증자 눈의 사용은 유타 대학교 (IRB 번호 00106658)와 ScrippsHealth IRB (IRB 번호 16-6781)에서 면제 상태였습니다.
1. 생체 외 ERG 설정
- 다중 전극 어레이 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 게인을 100으로 설....
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결과
생체 외 ERG를 사용하면 예를 들어 마우스 망막에서 재현 가능하고 안정적인 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있습니다(그림 2A-C). 인간 기증자 망막의 광수용체 반응 기록은 핵 제거의 사후 최대 5시간 지연(그림 2D) 및 <20분의 핵 제거 지연(그림 2E)으로 ON-양극성 세포 반응의 기록이 가능합니다. 큰 반응을 얻기 위한 중요한 파라미터에는 신중한 해부 기술, 높은 관류 속도 및 생리학적 값(포유류 망막에서 35-38°C)에 가까운 관류 온도가 포함됩니다. 이러한 조건에서 두 세포 유형의 반응 진폭과 동역학은 시간이 지남에 따라 비교적 안정적이었지만 망막이 표본 홀더에 장착된 후 약 40-45분 후에 천천히 감소했습니다(그.......
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토론
원래 Holmgren이 양서류 망막10의 망막 빛 반응을 측정하기 위해 1865년에 개발한 이 제품은 기술적 제약으로 인해 ERG가 널리 사용되지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 Ragnar Granit과 다른 사람들의 획기적인 연구는 ERG의 세포 기원을 확인하고 생체 외11,12,13에서 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응을 측정했습니다. 그 이후로, 정제된 방법은 생체외 ERG 기록(14,15)의 보다 광범위한 사용을 허용했지만, 응답 진폭, 특히 ON-양극성 세포의 반응 진폭은 비교적 작게 유지되었습니다16. 이러한 한계를 극복하기 위.......
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공개 사항
저자 중 누구도 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 National Eye Institute 보조금 EY02665 및 EY031706 및 국제 망막 연구 재단 Vinberg 박사, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), 실명 예방 연구, 뉴욕, 뉴욕, 유타 대학교 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금. Frans Vinberg 박사는 또한 실명 예방 연구 / H. James 박사 및 Carole Free Career Development Award와 ARVO EyeFind 보조금의 Silke Becker 박사를 수상했습니다. 그림 2E에 표시된 기록에 사용되는 기증자 눈을 제공 한 스크립스 연구소의 Anne Hanneken 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 준비를 위한 | 2mm 소켓 | WPI | 2026-10 |
| 전극 World | Precision Instruments | EP1 | 전극 준비를 위한 재료 |
| Ames의 매체 | Sigma Aldrich | A1420 | 관류 매체 |
| 염화바륨 | Sigma Aldrich | B0750 | 칼륨 채널 차단제 |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | 브로드 스펙트럼 글루타메이터 길항제 |
| OcuScience Ex Vivo ERG 어댑터 | OcuScience | 해당 사항 없음 | ex vivo ERG 표본 홀더 |
| 나사산 루어 커넥터 | McMaster-Carr | 51525K222 또는 51525K223 | 전극 준비를 위한 재료 |
참고문헌
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 ....
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재인쇄 및 허가
