Summary
기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.
Abstract
망막 신경 광 반응의 측정은 건강한 망막의 생리학을 조사하고, 망막 질환의 병리학 적 변화를 결정하고, 치료 적 개입을 테스트하는 데 중요합니다. 생체 외 망막 전도(ERG)를 사용하면 특정 약리학적 제제를 추가하고 전신 영향과 독립적으로 조직 내재적 변화를 평가하여 분리된 망막의 개별 세포 유형에서 기여도를 정량화할 수 있습니다. 망막 광 반응은 기존 패치 클램프 또는 미세 전극 어레이 장비에서 수정된 특수 생체 외 ERG 시편 홀더 및 기록 설정을 사용하여 측정할 수 있습니다. 특히, ON- 양극성 세포뿐만 아니라 광 수용체에 대한 연구는 시간이 지남에 따라 생체 외 ERG에서 빛 반응의 느리지 만 점진적인 감소로 인해 방해를 받았다. 관류 속도 증가 및 관류액 온도 조정은 생체 외 망막 기능을 향상시키고 응답 진폭과 안정성을 극대화합니다. 생체 외 ERG는 개별 망막 신경 세포 유형에 대한 연구를 독특하게 허용합니다. 또한 반응 진폭과 안정성을 최대화하기 위한 개선을 통해 대형 동물의 망막 샘플과 인간 기증자의 눈에서 빛 반응을 조사할 수 있으므로 생체 외 ERG는 망막 기능을 조사하는 데 사용되는 기술의 레퍼토리에 귀중한 추가 기능이 됩니다.
Introduction
전기 망막 촬영은 빛에 대한 반응으로 망막 기능을 측정합니다1. 망막 생리학 및 병태생리학을 연구하고 망막 질환 치료의 성공을 측정하는 데 필수적입니다. 생체 내 ERG는 손상되지 않은 유기체에서 망막 기능을 평가하는 데 널리 사용되지만 상당한 한계가 있습니다 2,3. 이 중 생체 내 ERG에서 개별 망막 세포 유형의 정량 분석은 모든 망막 세포에서 빛 자극4에 이르는 잠재적 변화의 합을 기록하고 따라서 반응을 오버레이하기 때문에 방해를 받습니다. 또한 망막에 약물을 쉽게 첨가 할 수 없으며 전신 영향에 취약하며 신호 대 잡음비가 상대적으로 낮습니다. 이러한 단점은 단리된 망막 2,3,5,6의 기능을 조사하는 생체외 ERG에서 제거된다. ex vivo ERG는 약리학적 억제제를 첨가하고 과염기에 첨가할 수 있는 치료제를 쉽게 평가하여 특정 망막 세포 유형에서 크고 안정적인 반응을 기록할 수 있습니다. 동시에 전신 효과의 영향을 제거하고 생리적 소음 (예 : 심장 박동 또는 호흡)을 제거합니다.
생체외 ERG에서, 망막 또는 망막 샘플은 단리되고, 시편 홀더(3,5)의 돔 상에 광수용체-측이 위로 향하도록 장착된다. 시편 홀더를 조립하고 망막에 가열되고 산소가 공급되는 매체를 공급하는 관류 시스템에 연결하고 컴퓨터로 제어되는 빛 자극을 전달하도록 수정된 현미경 스테이지에 놓습니다. 빛에 의해 유도된 응답을 기록하기 위해 시편 홀더는 증폭기, 디지타이저 및 기록 시스템에 연결됩니다(그림 1). 이 기술은 빛 자극의 매개 변수를 변경하고 약리학 적 약제를 추가하여 막대 및 원뿔 광 수용체, ON- 양극성 세포 및 Müller glia에서 반응을 분리 할 수 있습니다.
기존 패치 클램프 또는 다중 전극 어레이(MEA) 설정은 상용 생체 외 ERG 어댑터 또는 맞춤형 폴리카보네이트 컴퓨터 수치 제어(CNC) 가공 시편 홀더와 함께 생체 외 ERG를 기록하도록 변환하여 마우스와 같은 작은 동물 모델의 망막에서 광 반응을 측정할 수 있습니다. 이 수정은 생체 외 ERG의 접근성을 높이는 동시에 특수 장비의 필요성을 최소화합니다. 시편 홀더의 설계는 장착 기술을 단순화하고 전극을 통합하여 이전에 보고된 경망막 ex vivo ERG 방법7에 비해 미세 전극을 조작할 필요가 없습니다. 시편 홀더 내부의 관류 속도와 온도는 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 반응 특성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이러한 조건을 조정함으로써, 생체외 ERG는 장기간에 걸쳐 분리된 마우스 망막으로부터 신뢰성 있게 기록될 수 있다. 최적화된 실험 조건은 큰 동물의 눈과 인간 기증자의 눈을 포함한 더 큰 망막의 망막 펀치에서 생체 외 ERG 기록을 가능하게 합니다8.
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Protocol
마우스를 사용한 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었으며 유타 대학의 기관 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다. 이 비디오의 시연을 위한 돼지 눈은 도축장(지속 가능한 돼지 자원, 존슨빌)에서 사후 검시를 받았습니다. 눈은 FDA, 장기 조달 기관 협회 (AOPO) 및 미국 안구 은행 협회의 정식 인증을받은 유타 라이온스 안구 은행, 샌디에이고 안구 은행 또는 Lifesharing을 통해 연구 사용에 대한 동의를 받아 뇌 또는 심장사 후 인간 기증자로부터 얻었습니다. 인간 기증자 눈의 사용은 유타 대학교 (IRB 번호 00106658)와 ScrippsHealth IRB (IRB 번호 16-6781)에서 면제 상태였습니다.
1. 생체 외 ERG 설정
- 다중 전극 어레이 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 게인을 100으로 설정하고 디지타이저 사양에 따라 10x 전압 증폭을 추가합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다.
- 패치 클램프 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 패치 클램프 시스템 소프트웨어 및 디지타이저를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 이득을 100으로 설정하고 패치 클램프 헤드 스테이지를 통해 추가 10x 전압 증폭을 적용합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다.
- 적절한 파장(예: 막대 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응을 유도하기 위해 약 530nm)의 LED를 현미경에 연결합니다. 빛 자극을 트리거할 수 있는 녹음 소프트웨어로 LED를 제어합니다. 광 자극을 제어하려면 디지타이저의 아날로그 출력으로 제어되는 LED 드라이버를 사용하십시오.
- 포토다이오드를 사용하여 시편 홀더의 망막 위치에서 LED의 광 출력을 보정합니다. 필요한 경우 중성 밀도 필터를 광 경로에 삽입하여 광도를 어둡게 합니다.
- 상업적으로 이용 가능하거나 맞춤 제작된 생체 외 ERG 시편 홀더를 사용하십시오.
알림: 폴리 카보네이트의 CNC 가공 도면은 요청시 저자로부터 얻을 수 있습니다. - 전극을 준비하려면 Ag/AgCl 펠릿 전극을 나사산 루어 커넥터에 삽입합니다. 루어 커넥터 내부를 뜨거운 접착제로 채우고 나사산이 없는 쪽에서 뜨거운 접착제에 2mm 소켓을 삽입합니다. EP1 전극의 은선을 2mm 소켓에 납땜합니다. 나사산에 O-링이 있는 완성된 전극을 생체 외 ERG 시편 홀더의 전극 포트에 나사로 고정합니다.
알림: 전극은 오랫동안 사용할 수 있습니다. 펠릿 표면에 먼지가 쌓이거나 어두워지면 (높은 오프셋 전압 및 / 또는 전기 드리프트가 발생할 수 있음) 미세한 사포를 사용하여 "연마"할 수 있습니다. - 실험 최소 1일 전에 에폭시 접착제를 사용하여 ex vivo ERG 시편 홀더의 돔에 여과지를 접착하여 접착제가 전극 채널을 방해하지 않도록 합니다(비디오는 3 참조).
2. 동물 준비
- 어두운 적응 동물 최소 6 시간 또는 하룻밤.
3. 장비 준비
- 생체 외 ERG의 관류 라인을 5% 이산화탄소와 95% 산소로 버블링된 Ames의 배지로 채웁니다. 관류 라인을 시편 홀더 근처의 DC 전류원 또는 열 컨트롤러가있는 발열체에 연결하여 Ames의 매체를 따뜻하게하여 망막이 약 35-38 ° C로 유지되도록합니다.
- 생체 외 ERG 시편 홀더의 양쪽 절반을 전극 용액으로 채우고 루어 스토퍼로 관류 라인을 밀봉하고 전극을 연결하고 4개의 나사로 시편 홀더를 조립합니다(비디오는 3개 참조).
- 멀티 미터의 프로브를 전극에 삽입하여 조립 된 시편 홀더의 전극 사이의 저항 및 오프셋 전압을 확인하십시오.
알림: 막힘이없고 전극 상태가 양호한 경우 저항은 100kΩ 미만이고 오프셋 전압은 5mV 미만이어야합니다. - 조립된 시편 홀더를 관류 라인에 연결하고 빛을 전달하도록 설정된 현미경 스테이지에 놓습니다. 시편 홀더와 관류 라인에 기포가 없는지 확인하십시오.
4. 조직 준비
- 동물을CO2 로 희생시키고 즉시 눈을 핵 처리하거나, 큰 동물 또는 인간 공여자의 눈을 얻는다.
- 나머지 결합 조직과 외안근의 지구본을 청소하십시오. 시신경을 잘라냅니다.
- 여과지에 마우스 눈의 윤부에서 약 1mm 떨어진 오라 세라 타를 따라 면도날로 작은 절개를 조심스럽게 놓습니다. 미세한 반나 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다.
- 아이컵을 Ames의 배지가 들어 있는 접시에 옮깁니다. 망막에 닿지 않도록주의하면서 미세한 집게로 공막을 잡으십시오. 망막과 공막 사이에 vannas 가위를 삽입하고 공막을 주변에서 중앙 부분으로 자릅니다. 망막을 만지거나 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 해부 접시의 바닥에 vannas 가위로 절개의 한쪽을 잡고 공막을 고정하십시오. 절개 부위의 다른쪽에있는 집게로 공막을 잡으십시오. 조직 손상을 최소화하면서 망막을 분리할 수 있도록 절개 부위의 양쪽에 있는 공막을 당겨 망막을 건드리거나 손상시키지 않고 공막을 제거합니다.
- 동료 눈에서 렌즈가 있는 앞쪽 부분을 제거하고 5% 이산화탄소와 95% 산소가 함유된 Ames의 용액에 아이 컵을 실온에서 보관하십시오.
알림: 이러한 방식으로 저장된 눈의 기능적 빛 반응은 몇 시간 동안 얻을 수 있습니다. - 인간 기증자의 눈을 포함한 큰 눈에서는 마우스 눈에 대해 설명된 절차와 유사하게 나머지 결합 조직의 지구를 청소하고 앞쪽 세그먼트와 수정체를 제거합니다. 메스를 사용하여 윤부에서 약 3mm 정도 자릅니다. 구부러진 해부 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 3-6mm 일회용 생검 펀치로 생체 외 전기 망막 조영술을 위한 망막 표본을 얻습니다.
5. 표본 홀더에 조직 장착
- 시편 홀더의 아래쪽 절반을 큰 페트리 접시에 넣고 산소가 공급된 Ames의 배지로 채워 시편 홀더의 돔이 잠기도록 합니다.
- 미세한 집게로 망막의 가장자리를 조심스럽게 잡고 망막을 생체 외 시편 홀더의 돔으로 옮기고 광 수용체 쪽이 위를 향하게합니다.
- Ames의 용액에서 표본 홀더를 들어 올려 망막이 제자리에 유지되도록 주의하십시오.
- 소음, 전기 누화 및 신호 션트를 최소화하기 위해 시편 홀더의 플레이트를 완전히 건조시킵니다.
- 시편 홀더의 양쪽 절반을 4 개의 나사로 조립하고 관류 라인을 연결하십시오. 시편 홀더의 하반부에있는 전극을 건조시키고 양극 케이블을 내부 망막 측에 연결하고 음극 케이블을 광 수용체 측에 연결합니다.
- 검체 홀더에 최소 1mL/min의 산소가 함유된 Ames' 배지를 10-20분 동안 관류하여 빛 반응이 안정화될 시간을 허용합니다.
6. 망막 신경 세포 기능 기록
- 망막을 점점 더 강렬한 섬광에 노출시켜 반응 가족을 기록합니다. 예를 들어, 약 10 - 1,000 광자/μm2 범위의 광도를 갖는 마우스 막대 광수용체 반응 패밀리와 약 0.6 - 20 광자/μm2 범위의 광도를 갖는 마우스 ON-양극성 세포의 반응 패밀리를 기록한다.
- Müller 신경교 세포의 칼륨 채널을 차단하는 100μM 염화바륨과 ON-양극성 세포로의 글루타메이트성 신호 전달을 차단하는 40μM DL-AP4가 있는 상태에서 광수용체 광 반응(a-wave)을 측정합니다(그림 2B).
- ON- 양극성 세포의 기능에서 비롯된 b- 파를 분리하려면 먼저 염화 바륨 단독의 존재하에 광 수용체와 ON- 양극성 세포 모두의 결합 된 광 반응을 기록합니다 (그림 2A). 그런 다음 염화바륨과 DL-AP4가 포함된 Ames의 배지로 5-10분 동안 관류하고 이전과 동일한 광 자극에 대한 광수용체 반응을 기록합니다(그림 2B). 결합된 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응에서 광수용체 반응을 빼서 ON-양극성 세포 광 반응만 계산합니다(그림 2C).
7. ON-양극성 세포 기능 최적화
참고: ON-양극성 세포에서 발생하는 b-wave는 시편 홀더의 온도와 관류 속도에 매우 민감합니다.
- b-wave를 얻기 위해 최소 0.5mL/분의 관류 속도를 유지하십시오.
참고: ON-양극성 세포에서 크고 안정적인 반응을 유지하려면 1-2mL/min의 더 높은 관류 속도가 바람직합니다. - 주어진 관류 속도에 대해 망막 근처의 시편 홀더의 온도가 체온에 가깝도록하십시오 (즉, 약 35-38 ° C).
알림: 생체 외 ERG 시편 홀더에 도달하기 전에 가열되는 관류액의 온도를 조정하여 망막에서 최적의 온도 범위 내에 있도록 하는 것이 중요합니다. - 나중에 실험을 위해 빛으로부터 보호되고 실온에서 산소가 공급된 Ames의 배지에 아이 컵을 보관하여 몇 시간 동안 정상적인 a-파 및 b-파를 유지하십시오.
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Representative Results
생체 외 ERG를 사용하면 예를 들어 마우스 망막에서 재현 가능하고 안정적인 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있습니다(그림 2A-C). 인간 기증자 망막의 광수용체 반응 기록은 핵 제거의 사후 최대 5시간 지연(그림 2D) 및 <20분의 핵 제거 지연(그림 2E)으로 ON-양극성 세포 반응의 기록이 가능합니다. 큰 반응을 얻기 위한 중요한 파라미터에는 신중한 해부 기술, 높은 관류 속도 및 생리학적 값(포유류 망막에서 35-38°C)에 가까운 관류 온도가 포함됩니다. 이러한 조건에서 두 세포 유형의 반응 진폭과 동역학은 시간이 지남에 따라 비교적 안정적이었지만 망막이 표본 홀더에 장착된 후 약 40-45분 후에 천천히 감소했습니다(그림 3).
광수용체와 비교하여, ON-양극성 세포 기능은 예를 들어 해부 및 장착 중 망막의 손상 또는 온도 및/또는 관류 속도의 저하에 의해 더 쉽게 중단됩니다. 시편 홀더의 온도가 감소하면 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 동역학이 크게 느려지지만 b- 파의 진폭은 감소했지만 a- 파는 감소하지 않았습니다 (그림 4A). 반대로, 관류 속도를 2.1mL/min에서 0.6mL/min으로 늦추면 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응의 진폭이 감소했지만 a- 또는 b-파의 암시적 시간(자극 시작에서 반응 피크까지의 시간)에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 4B). 10분 동안 관류를 중단한 후 재관류를 하면 광수용체 반응이 보존된 ON-양극성 세포 기능이 완전히 상실되었습니다(그림 5).
그림 1: 생체 외 망막전기 시편 홀더 및 기록 설정 . (ᄀ,ᄂ) 생체 외 ERG 시편 홀더는 격리된 망막을 장착하기 위한 돔으로 구성되며, 이 돔은 관류 라인에 연결되어 Ames의 배지를 지속적으로 전달합니다. 전극은 좁은 채널을 통해 관류 라인을 통해 망막의 광 수용체 쪽과 돔에 붙어있는 여과지를 통해 망막 내부에 연결됩니다. 이 전극은 차동 증폭기에 연결되어 광 자극에 대한 반응으로 망막의 전위차를 측정 할 수 있습니다. (C) 표본 홀더는 빛의 섬광을 전달하도록 수정되고 중력에 의해 가열되고 산소가 공급된 Ames의 매체를 전달하는 관류 라인에 연결된 현미경 스테이지에 배치됩니다. 전체 녹음 설정은 전기 노이즈를 최소화하기 위해 패러데이 케이지로 차폐됩니다. 이 수치는 9에서 수정되었습니다. 약어 : ERG = 망막 전도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생체 외 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응의 추적 예. 관류액에 약리학적 제제를 첨가하면 개별 망막 세포 유형에서 생체 외 망막 전전도로의 기여도를 정량화할 수 있습니다. 광수용체(PR) 광 반응은 뮐러 신경교세포에서 발현되는 K+ 채널 차단제인 100μM 염화바륨(BaCl2)과 광수용체에서 ON-양극성 세포로의 신호 전달을 억제하는 글루타메이트 수용체 차단제인 40μM DL-AP4의 존재 하에서 분리됩니다(B). ON-양극성 전지(ON-BPC) 기능(C)은 염화바륨 단독(A)의 존재 하에서 결합된 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응으로부터 광수용체 성분(B)을 뺀 것에 의해 결정된다. 광 수용체 광 반응은 <5 h (D)의 핵 제거 지연으로 사망 한 인간 기증자 망막에서 얻을 수있는 반면, 사망 후 20 분 이내에 핵이 제거 된 망막은 종종 ON- 양극성 세포 반응 (E)을 제공합니다 (자세한 내용은 8 참조). 도 2A-C는 도 9에서 변형된 것이다. 약어 : PR = 광 수용체; ON-BPC = ON-양극성 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시간 경과에 따른 생체 외 망막전도에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 안정성 . (A) 광 반응은 100μM 염화바륨 및 40μM DL-AP4 모두의 존재하에 광수용체 단독으로부터 매분 기록되었다. (B) 100μM 염화 바륨 단독의 존재하에 희미한 빛이 깜박이는 것은 작은 광 수용체 성분을 포함하지만 ON- 양극성 세포 기능에 의해 크게 지배됩니다. 분리된 망막으로부터의 광 반응은 일반적으로 생체외 시편 홀더를 15-20분 동안 관류한 후 안정화되고, 감소하기 시작하기 전에 적어도 20-25분 동안 안정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 서로 다른 온도와 관류 속도에서 결합된 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응. (A) 시편 홀더 내부의 온도를 37°C에서 실온으로 낮추면 광수용체 및 ON-양극성 세포 동역학이 크게 느려지지만 혼합된 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응에서 ON-양극성 세포 진폭만 감소했습니다. (B) 관류 속도를 2.1mL / 분에서 0.6mL / 분으로 감소시킨 결과 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 진폭이 감소했지만 반응 역학에는 변화가 없었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ON-양극성 세포 반응은 관류 중단에 더 민감합니다. (A) 큰 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응은 20 분 동안 2.1 mL / min으로 관류 후 기록되었다. (B) 10 분 동안 관류를 중단 한 후 2.1 mL / min에서 10 분 동안 재관류를 한 후 광 수용체 반응이 존재했지만 ON- 양극성 세포 반응은 완전히 사라졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
원래 Holmgren이 양서류 망막10의 망막 빛 반응을 측정하기 위해 1865년에 개발한 이 제품은 기술적 제약으로 인해 ERG가 널리 사용되지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 Ragnar Granit과 다른 사람들의 획기적인 연구는 ERG의 세포 기원을 확인하고 생체 외11,12,13에서 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응을 측정했습니다. 그 이후로, 정제된 방법은 생체외 ERG 기록(14,15)의 보다 광범위한 사용을 허용했지만, 응답 진폭, 특히 ON-양극성 세포의 반응 진폭은 비교적 작게 유지되었습니다16. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막 기능은 실험적 제약과 기록된 파형의 더 복잡한 해석에도 불구하고 오늘날 in vivo ERG로 더 일반적으로 측정됩니다. 생체 외 ERG는 생리적 조건을 가능한 한 가깝게 복제하려고 시도하지만 그럼에도 불구하고 인공 환경과 전신 요인 및 병리학 적 변화가없는 상태에서 망막 기능을 측정합니다. 그러나, 생체내 ERG와 조합될 때, 이러한 제한은 질환에서 망막 기능의 변화가 망막 세포에 내재되어 있는지 또는 전신 변화에 의해 야기되는지와 같은 중요한 질문에 답하기 위해 사용될 수 있다(17).
최근에, 새롭게 설계된 생체외 ERG 표본 홀더는 방법론을 단순화하여 생체외 ERG를 더 광범위한 연구 공동체 2,3,5,18에서 이용할 수 있게 하였다. 이 프로토콜에 설명된 기존 패치 클램프 또는 다중 전극 어레이 장비를 수정하면 더 많은 실험실에서 최소한의 재정적 투자와 공간 요구 사항으로 생체 외 ERG를 수행할 수 있습니다. 특히, 생체 외 ERG 기술의 최근 개발은 포유류 분리 망막의 반응성을 증폭시켜 우수한 신호 대 잡음비를 초래했으며, 이는 이 프로토콜에 설명된 추가 증폭 단계에도 불구하고 여전히 양호합니다. 그럼에도 불구하고, 주로 ON-양극성 세포(19)로부터의 광 반응의 감소는 아마도 생체외 ERG의 보다 광범위한 사용을 방해했을 것이다. Ames' 또는 Locke's 배지의 사용은 더 큰 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응을 초래하므로, 예를 들어 생체 외 ERG3에 대한 HEPES-완충 링거 용액보다 바람직하다. 다른 실험실에서는 글루타민 또는 글루타메이트19를 보충하여 생체 외 ON-양극성 세포 기능을 안정화했습니다. 이 보고서는이전에 보고된 바와 같이 인간 기증자의 눈을 포함하여 분리된 망막에서 크고 안정적인 빛 반응을 얻는 방법을 보여줍니다8.
중요한 실험 매개 변수에는 생리 학적 범위 내에서 유지되어야하는 망막의 온도와 빠른 관류 속도가 포함됩니다. 생체 외 ERG 검체 홀더에서 온도를 낮추는 가장 눈에 띄는 효과는 광수용체와 ON-양극성 세포 모두에서 느린 반응 역학과 감쇠된 ON-양극성 세포 진폭입니다. 온도를 낮추는 것이 광 수용체 및 ON- 양극성 세포로부터의 결합 된 반응에서 광 수용체 진폭에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보이지만, 이는 두 세포 유형 모두에서 반응 동역학의 차등 변화로 인한 인공물 일 수있다.
충분한 관류 속도는 망막 기능에 특히 중요한 것으로 보이며 산소와 영양분을 공급하고 노폐물을 제거 할 가능성이 가장 높습니다. 광수용체와 ON-양극성 세포 진폭은 관류 속도의 적당한 감소에 의해 다소 감소하지만, 관류의 짧은 중단조차도 ON-양극성 기능을 폐지했지만 광수용체 기능은 폐지하지 않았습니다. 이것은 광수용체 반응이 더 강력하고, 인간 공여자의 눈과 같이 상당한 지연으로 실험을 거치는 눈에서 더 쉽게 보존될 수 있음을 의미한다.8. 이러한 맥락에서, ON- 양극성 세포 기능은 몇 시간 동안 산소가 함유 된 Ames의 배지에 아이 컵을 보관함으로써 감소되지 않는다는 것이 주목할 만하다. 따라서 우리는 생체 외 검체 홀더의 관류가 중단될 때 ON-양극성 세포 기능의 손실이 표본 홀더의 망막을 둘러싼 작은 부피의 산소 및 기타 영양소의 급속한 고갈로 인한 것일 수 있다고 가정합니다. 이것은 죽음에서 핵 제거까지의 짧은 지연이 광 수용체, 특히 인간 망막의 ON-양극성 세포 반응을 기록하는 데 중요하며 사후 저산소증이 망막 신경 기능에 돌이킬 수없는 손상의 가장 가능성있는 후보라는 보고서에 의해 뒷받침됩니다8. 생체 외 ERG에 대한 실험 파라미터가 마우스 망막에서 최적화되었지만, 그럼에도 불구하고 큰 동물과 인간 기증자 눈의 망막 표본에 대한 기록 조건을 성공적으로 개선했습니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 National Eye Institute 보조금 EY02665 및 EY031706 및 국제 망막 연구 재단 Vinberg 박사, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), 실명 예방 연구, 뉴욕, 뉴욕, 유타 대학교 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금. Frans Vinberg 박사는 또한 실명 예방 연구 / H. James 박사 및 Carole Free Career Development Award와 ARVO EyeFind 보조금의 Silke Becker 박사를 수상했습니다. 그림 2E에 표시된 기록에 사용되는 기증자 눈을 제공 한 스크립스 연구소의 Anne Hanneken 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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