Summary
La modification de l’équipement existant de réseau multiélectrodes ou de pince patch rend l’électrorétinogramme ex vivo plus largement accessible. Des méthodes améliorées pour enregistrer et maintenir les réponses lumineuses ex vivo facilitent l’étude du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans la rétine saine, des modèles animaux de maladies oculaires et des rétines de donneurs humains.
Abstract
Les mesures des réponses lumineuses neuronales rétiniennes sont essentielles pour étudier la physiologie de la rétine saine, déterminer les changements pathologiques dans les maladies de la rétine et tester les interventions thérapeutiques. L’électrorétinogramme ex vivo (ERG) permet de quantifier les contributions de types cellulaires individuels dans la rétine isolée par l’ajout d’agents pharmacologiques spécifiques et l’évaluation des changements tissulaires intrinsèques indépendamment des influences systémiques. Les réponses lumineuses rétiniennes peuvent être mesurées à l’aide d’un porte-échantillon ERG ex vivo spécialisé et d’une installation d’enregistrement, modifiés à partir d’un équipement de pince patch ou de réseau de microélectrodes existant. En particulier, l’étude des cellules ON-bipolaires, mais aussi des photorécepteurs, a été entravée par le déclin lent mais progressif des réponses lumineuses dans l’ERG ex vivo au fil du temps. L’augmentation de la vitesse de perfusion et l’ajustement de la température du perfusat améliorent la fonction rétinienne ex vivo et maximisent l’amplitude et la stabilité de la réponse. L’ERG ex vivo permet uniquement l’étude de types individuels de cellules neuronales rétiniennes. En outre, les améliorations visant à maximiser les amplitudes de réponse et la stabilité permettent d’étudier les réponses lumineuses dans des échantillons de rétine de grands animaux, ainsi que dans des yeux de donneurs humains, faisant de l’ERG ex vivo un ajout précieux au répertoire des techniques utilisées pour étudier la fonction rétinienne.
Introduction
L’électrorétinographie mesure la fonction rétinienne en réponse à la lumière1. Il fait partie intégrante de l’étude de la physiologie et de la physiopathologie rétiniennes et de la mesure du succès des thérapies pour les maladies de la rétine. L’ERG in vivo est largement utilisé pour évaluer la fonction rétinienne dans les organismes intacts, mais il présente des limites importantes 2,3. Parmi ceux-ci, l’analyse quantitative des différents types de cellules rétiniennes dans l’ERG in vivo est entravée, car elle enregistre la somme des changements potentiels, et donc des réponses superposées, de toutes les cellules rétiniennes aux stimuli lumineux4. En outre, il ne permet pas facilement l’ajout de médicaments à la rétine, est vulnérable aux influences systémiques et a un rapport signal sur bruit relativement faible. Ces inconvénients sont éliminés dans l’ERG ex vivo qui étudie la fonction de la rétine isolée 2,3,5,6. L’ERG ex vivo permet l’enregistrement de réponses importantes et stables de types de cellules rétiniennes spécifiques par l’ajout d’inhibiteurs pharmacologiques et l’évaluation facile des agents thérapeutiques, qui peuvent être ajoutés au superfusat. En même temps, il élimine les influences des effets systémiques et élimine les bruits physiologiques (par exemple, le rythme cardiaque ou la respiration).
Dans l’ERG ex vivo, les rétines ou les échantillons rétiniens sont isolés et montés côté photorécepteur vers le haut sur le dôme du porte-échantillon 3,5. Le porte-échantillon est assemblé, connecté à un système de perfusion qui alimente la rétine en milieux oxygénés chauffés, et placé sur la scène d’un microscope, qui a été modifié pour délivrer des stimuli lumineux contrôlés par ordinateur. Pour enregistrer les réponses suscitées par la lumière, le porte-échantillon est connecté à un amplificateur, un numériseur et un système d’enregistrement (Figure 1). Cette technique permet d’isoler les réponses des photorécepteurs des bâtonnets et des cônes, des cellules ON-bipolaires et de la glie de Müller en modifiant les paramètres des stimuli lumineux et en ajoutant des agents pharmacologiques.
Une pince patch existante ou une configuration MEA (multi-électrodes array) peut être convertie pour enregistrer l’ERG ex vivo, soit en conjonction avec un adaptateur ERG ex vivo disponible dans le commerce, soit avec un porte-échantillon personnalisé usiné par commande numérique par ordinateur (CNC) en polycarbonate, pour mesurer les réponses lumineuses dans les rétines à partir de petits modèles animaux, tels que des souris. Cette modification augmente l’accessibilité des GRE ex vivo tout en minimisant le besoin d’équipement spécialisé. La conception du porte-échantillon simplifie la technique de montage et intègre des électrodes, éliminant ainsi le besoin de manipuler des microélectrodes par rapport aux méthodes ERG ex vivo transrétiniennes précédemment signalées7. Le taux de perfusion et la température à l’intérieur du porte-échantillon sont des facteurs importants qui affectent les propriétés de réponse des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. En ajustant ces conditions, l’ERG ex vivo peut être enregistré de manière fiable à partir de la rétine isolée de la souris sur des périodes prolongées. Des conditions expérimentales optimisées permettent des enregistrements ERG ex vivo dans des poinçons rétiniens provenant de rétines plus grandes, y compris de grands yeux d’animaux et des yeux de donneurs humains8.
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Protocol
Toutes les expériences utilisant des souris ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel d’études animales de l’Université de l’Utah. Des yeux de porc pour la démonstration de cette vidéo ont été obtenus post-mortem de l’abattoir (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Les yeux ont été obtenus de donneurs humains après une mort cérébrale ou cardiaque avec le consentement à des fins de recherche par l’intermédiaire de l’Utah Lions Eye Bank, de la San Diego Eye Bank ou de Lifesharing, qui sont entièrement accrédités par la FDA, l’Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) et l’Eye Banks of America Association. L’utilisation d’yeux de donneurs humains avait le statut d’exemption à l’Université de l’Utah (IRB no. 00106658) et ScrippsHealth IRB (IRB no. 16-6781).
1. Mise en place du GRE ex vivo
- Pour convertir une configuration de réseau multiélectrode, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un étage de tête à un amplificateur différentiel, qui est branché sur l’entrée analogique de la carte d’interface du système multiélectrode. Utilisez le logiciel d’enregistrement du réseau multiélectrodes pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo . Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et ajoutez une amplification de tension supplémentaire de 10x en fonction des spécifications du numériseur. Réglez le filtre passe-bas sur 100 Hz.
- Pour convertir une configuration de pince patch, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un étage de tête à un amplificateur différentiel, qui est connecté à l’étage de tête de l’amplificateur de pince patch. Utilisez le logiciel de système de pince patch et le numériseur pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo . Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et appliquez une amplification de tension 10x supplémentaire via la platine de la tête de pince. Réglez le filtre passe-bas sur 100 Hz.
- Connectez des LED avec les longueurs d’onde appropriées (par exemple, environ 530 nm pour provoquer des réponses du photorécepteur des bâtonnets et des cellules ON-bipolaires) au microscope. Contrôlez les LED avec un logiciel d’enregistrement qui permet le déclenchement de stimuli lumineux. Pour contrôler les stimuli lumineux, utilisez un pilote LED contrôlé par des sorties analogiques d’un numériseur.
- Calibrer le flux lumineux des LED à la position de la rétine dans le porte-échantillon à l’aide d’une photodiode. Si nécessaire, insérez des filtres de densité neutre dans le trajet lumineux pour atténuer l’intensité lumineuse.
- Utilisez un porte-spécimen ERG ex vivo disponible dans le commerce ou fabriqué sur mesure.
NOTE: Les dessins pour l’usinage CNC à partir de polycarbonate peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande. - Pour préparer l’électrode, insérez une électrode à granulés Ag/AgCl dans un connecteur luer fileté. Remplissez l’intérieur du connecteur luer avec de la colle chaude et insérez une douille de 2 mm dans la colle chaude du côté non fileté. Souder un fil argenté de l’électrode EP1 à la douille de 2 mm. Vissez l’électrode finie, avec un joint torique sur le filetage, dans les orifices d’électrode du porte-échantillon ERG ex vivo .
REMARQUE: Les électrodes peuvent être utilisées pendant une longue période. Si la surface de la pastille accumule de la saleté et/ou devient sombre (cela peut provoquer une tension de décalage élevée et/ou une dérive électrique), elle peut être « polie » à l’aide de papier de verre fin. - Au moins 1 jour avant l’expérimentation, collez des papiers filtres sur les dômes du porte-échantillon ERG ex vivo à l’aide de colle époxy, en veillant à ce que la colle n’obstrue pas le canal d’électrode (voir 3 pour la vidéo).
2. Préparation des animaux
- Animaux sombres adaptatifs pendant au moins 6 h ou toute la nuit.
3. Préparation de l’équipement
- Remplissez la ligne de perfusion de l’ERG ex vivo avec le milieu d’Ames barboté avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’oxygène. Connectez la conduite de perfusion à un élément chauffant avec une source de courant continu ou un contrôleur de chaleur près du porte-échantillon pour réchauffer le milieu d’Ames, de sorte que la rétine soit maintenue à environ 35-38 ° C.
- Remplissez les deux moitiés du porte-échantillon ERG ex vivo avec une solution d’électrode, scellez la ligne de perfusion avec des bouchons luer, connectez les électrodes et assemblez le porte-échantillon avec quatre vis (voir 3 pour la vidéo).
- Vérifiez la résistance et la tension de décalage entre les électrodes dans le porte-échantillon assemblé en insérant les sondes du multimètre dans les électrodes.
REMARQUE: S’il n’y a pas de blocages et que les électrodes sont en bon état, la résistance doit être inférieure à 100 kΩ et la tension de décalage inférieure à 5 mV. - Connectez le porte-échantillon assemblé à la ligne de perfusion et placez-le sur la scène d’un microscope configuré pour délivrer des éclairs lumineux. Assurez-vous que le porte-échantillon et la conduite de perfusion ne contiennent pas de bulles d’air.
4. Préparation des tissus
- Sacrifiez l’animal avec du CO2 et énucléez immédiatement les yeux, ou obtenez de grands yeux de donneurs animaux ou humains.
- Nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et des muscles extraoculaires. Coupez le nerf optique.
- Sur du papier filtre, placez soigneusement une petite incision avec une lame de rasoir le long de l’ora serrata, à environ 1 mm du limbe dans l’œil de souris. Insérez de fins ciseaux vannas dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin.
- Déplacez la coupe pour les yeux dans un plat contenant le médium d’Ames. Saisissez la sclérotique avec une pince fine, en prenant soin de ne pas toucher la rétine. Insérez des ciseaux vannas entre la rétine et la sclérotique et coupez la sclérotique de la partie périphérique vers la partie centrale. Veillez à ne pas toucher ou endommager la rétine.
- Immobiliser la sclérotique en tenant un côté de l’incision avec des ciseaux vannas contre le fond du plat de dissection. Saisissez la sclérotique avec une pince de l’autre côté de l’incision. Retirez la sclérotique sans toucher ou endommager la rétine en écartant la sclérotique de chaque côté de l’incision pour permettre l’isolement de la rétine avec un minimum de dommages au tissu.
- Retirez le segment antérieur avec la lentille de l’œil et conservez l’œilleton à température ambiante dans la solution d’Ames contenant 5% de dioxyde de carbone et 95% d’oxygène.
REMARQUE: Les réponses lumineuses fonctionnelles des yeux stockés de cette manière peuvent être obtenues pendant plusieurs heures. - Dans les grands yeux, y compris les yeux de donneurs humains, nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et retirez le segment antérieur et le cristallin, de la même manière que la procédure décrite pour l’œil de souris. Utilisez un scalpel pour faire une coupe à environ 3 mm du limbe. Insérez des ciseaux de dissection incurvés dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin. Obtenir des échantillons rétiniens pour l’électrorétinographie ex vivo avec un poinçon de biopsie jetable de 3 à 6 mm.
5. Montage du tissu sur le porte-échantillon
- Placez la moitié inférieure du porte-échantillon dans une grande boîte de Petri et remplissez-la de milieu d’Ames oxygéné de sorte que le dôme du porte-spécimen soit simplement submergé.
- Saisissez soigneusement le bord de la rétine avec une pince fine et transférez la rétine sur le dôme du porte-échantillon ex vivo , côté photorécepteur tourné vers le haut.
- Soulevez le porte-échantillon de la solution d’Ames, en veillant à ce que la rétine reste en place.
- Séchez complètement la plaque du porte-échantillon pour minimiser le bruit, la diaphonie électrique et le shunt de signal.
- Assemblez les deux moitiés du porte-échantillon avec quatre vis et connectez la ligne de perfusion. Sécher l’électrode dans la moitié inférieure du porte-échantillon et connecter le câble anodique au côté interne de la rétine et le câble cathodique au côté photorécepteur.
- Perfuser le porte-échantillon avec au moins 1 mL/min de milieu d’Ames oxygéné pendant 10 à 20 minutes pour laisser le temps aux réponses lumineuses de se stabiliser.
6. Enregistrement de la fonction des cellules neuronales rétiniennes
- Enregistrez les familles de réponse en exposant la rétine à des éclairs lumineux d’intensité croissante. Par exemple, enregistrer les familles de photorécepteurs de bâtonnets de souris avec des intensités lumineuses allant d’environ 10 à 1 000 photons/μm 2 et celles de cellules ON-bipolaires de souris avec des intensités lumineuses allant d’environ 0,6 à 20 photons/μm2.
- Mesurer les réponses lumineuses des photorécepteurs (ondes a) en présence de chlorure de baryum de 100 μM, qui bloque les canaux potassiques dans les cellules gliales de Müller, et de DL-AP4 de 40 μM, qui bloque la transmission du signal glutamatergique aux cellules bipolaires ON (Figure 2B).
- Pour isoler l’onde b, qui provient de la fonction des cellules ON-bipolaires, enregistrez d’abord les réponses lumineuses combinées des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires en présence de chlorure de baryum seul (Figure 2A). Ensuite, perfuser pendant 5 à 10 minutes avec le milieu d’Ames contenant du chlorure de baryum, ainsi que DL-AP4, et enregistrer les réponses des photorécepteurs aux mêmes stimuli lumineux qu’auparavant (Figure 2B). Soustrayez les réponses des photorécepteurs des réponses combinées des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires, calculant ainsi uniquement les réponses lumineuses des cellules ON-bipolaires (Figure 2C).
7. Optimisation de la fonction des cellules on-bipolaires
REMARQUE: L’onde b, qui provient des cellules bipolaires ON, est très sensible à la température dans le porte-échantillon et au taux de perfusion.
- Maintenir un taux de perfusion d’au moins 0,5 mL/min pour obtenir l’onde B.
REMARQUE: Un taux de perfusion plus élevé de 1-2 mL / min est préférable pour maintenir une réponse importante et stable des cellules ON-bipolaires. - S’assurer que, pour un taux de perfusion donné, la température dans le porte-échantillon près de la rétine est proche de la température corporelle (c.-à-d. environ 35 à 38 °C).
REMARQUE: Il est important d’ajuster la température du perfusat, qui est chauffé avant qu’il n’atteigne le porte-échantillon ERG ex vivo , afin qu’il se situe dans la plage de température optimale au niveau de la rétine. - Conservez les œillets pour une expérimentation ultérieure à l’abri de la lumière et dans un milieu d’Ames oxygéné à température ambiante pour maintenir les ondes A et B normales pendant plusieurs heures.
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Representative Results
Ex vivo L’ERG permet d’enregistrer les réponses reproductibles et stables du photorécepteur et de la lumière des cellules ON-bipolaires, par exemple à partir de la rétine de la souris (Figure 2A-C). L’enregistrement des réponses des photorécepteurs des rétines des donneurs humains est possible avec un délai d’énucléation post-mortem allant jusqu’à 5 heures (Figure 2D) et des réponses des cellules ON-bipolaires avec un délai d’énucléation de <20 min (Figure 2E). Les paramètres importants pour obtenir des réponses importantes comprennent une technique de dissection minutieuse, un taux de perfusion élevé et une température de perfusion proche des valeurs physiologiques (35-38 ° C dans la rétine des mammifères). Dans ces conditions, les amplitudes de réponse et la cinétique dans les deux types de cellules étaient relativement stables au fil du temps, mais diminuaient lentement environ 40 à 45 minutes après le montage de la rétine sur le porte-échantillon (figure 3).
Par rapport aux photorécepteurs, la fonction des cellules ON-bipolaires est plus facilement perturbée, par exemple par des dommages à la rétine lors de la dissection et du montage ou par une baisse de la température et/ou de la vitesse de perfusion. Bien que la température réduite dans le porte-échantillon ait considérablement ralenti la cinétique des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires, elle a diminué l’amplitude de l’onde b mais pas celle de l’onde a (Figure 4A). À l’inverse, le ralentissement du taux de perfusion de 2,1 mL/min à 0,6 mL/min a réduit les amplitudes des réponses des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires, mais n’a pas affecté le temps implicite (temps entre le début du stimulus et le pic de réponse) de l’onde a ou b (figure 4B). L’arrêt de la perfusion pendant 10 minutes suivi d’une reperfusion a entraîné une perte complète de la fonction des cellules ON-bipolaires avec des réponses photorécepteurs préservées (Figure 5).
Figure 1 : Support d’échantillon d’électrorétinogramme ex vivo et installation d’enregistrement. (A,B) Le porte-échantillon ERG ex vivo comprend un dôme pour monter la rétine isolée, qui est reliée à une ligne de perfusion pour délivrer en continu le milieu d’Ames. Les électrodes sont reliées par des canaux étroits à la fois au côté photorécepteur de la rétine via la ligne de perfusion et à la rétine interne par le papier filtre collé au dôme. Ces électrodes sont connectées à un amplificateur différentiel, ce qui permet de mesurer les différences de potentiel dans la rétine en réponse à des stimuli lumineux. (C) Le porte-échantillon est placé sur la platine d’un microscope, qui a été modifié pour délivrer des éclairs lumineux et connecté à la ligne de perfusion, qui délivre le milieu d’Ames chauffé et oxygéné par gravité. L’ensemble de la configuration d’enregistrement est protégé par une cage de Faraday pour minimiser le bruit électrique. Ce chiffre a été modifié par rapport à 9. Abréviation : ERG = électrorétinogramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemple de traces de réponses ex vivo des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. L’ajout d’agents pharmacologiques au perfusat permet de quantifier les contributions des différents types de cellules rétiniennes à l’électrorétinogramme ex vivo. Les réponses lumineuses des photorécepteurs (PR) sont isolées en présence de chlorure de baryum 100 μM (BaCl2), un bloqueur des canaux K+ exprimé par les cellules gliales de Müller, ainsi que de 40 μM DL-AP4, un bloqueur des récepteurs du glutamate, qui inhibe la transmission du signal des photorécepteurs aux cellules ON-bipolaires (B). La fonction (C) de la cellule ON-bipolaire (ON-BPC) est déterminée en soustrayant la composante photoréceptrice (B) du photorécepteur combiné et la réponse des cellules ON-bipolaires en présence de chlorure de baryum seul (A). Les réponses lumineuses des photorécepteurs peuvent être obtenues à partir de rétines de donneurs humains avec un délai de mort à énucléation de <5 h (D), tandis que les rétines énucléées dans les 20 minutes suivant la mort donnent fréquemment des réponses des cellules ON-bipolaires (E) (voir 8 pour plus d’informations). La figure 2A-C est modifiée à partir de 9. Abréviations : PR = photorécepteur; ON-BPC = cellule ON-bipolaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stabilité du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans l’électrorétinogramme ex vivo au fil du temps. (A) Des réponses lumineuses ont été enregistrées chaque minute à partir de photorécepteurs seuls en présence de chlorure de baryum de 100 μM et de DL-AP4 de 40 μM. (B) Les éclairs de faible luminosité en présence de chlorure de baryum de 100 μM seuls sont fortement dominés par la fonction des cellules ON-bipolaires, bien qu’ils contiennent un petit composant photorécepteur. Les réponses lumineuses des rétines isolées se stabilisent généralement après avoir perfusé le porte-échantillon ex vivo pendant 15 à 20 minutes et sont restées stables pendant au moins 20 à 25 minutes avant de commencer à décliner. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Réponses combinées des photorécepteurs et des cellules bipolaires ON à différentes températures et vitesses de perfusion. (A) L’abaissement de la température à l’intérieur du porte-échantillon de 37 °C à température ambiante a considérablement ralenti la cinétique des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires, mais n’a réduit que l’amplitude de la cellule ON-bipolaire dans le photorécepteur mixte et la réponse des cellules ON-bipolaires. (B) La réduction du taux de perfusion de 2,1 mL/min à 0,6 mL/min a entraîné une diminution des amplitudes des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires, mais aucun changement dans la cinétique de réponse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les réponses des cellules bipolaires ON sont plus sensibles à l’arrêt de la perfusion. (A) Des réponses de grands photorécepteurs et de cellules ON-bipolaires ont été enregistrées après perfusion avec 2,1 mL/min pendant 20 min. (B) Après arrêt de la perfusion pendant 10 minutes suivi d’une reperfusion pendant 10 minutes à 2,1 mL/min, les réponses des photorécepteurs étaient présentes, tandis que les réponses des cellules ON-bipolaires étaient complètement perdues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Développé à l’origine en 1865 par Holmgren pour mesurer les réponses lumineuses rétiniennes de la rétineamphibienne 10, des contraintes techniques ont initialement empêché l’ERG d’être largement utilisé. Néanmoins, des études fondamentales menées par Ragnar Granit et d’autres ont identifié les origines cellulaires de l’ERG et mesuré les réponses des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires ex vivo11,12,13. Depuis lors, des méthodes perfectionnées ont permis une utilisation plus répandue des enregistrements ex vivo ERG 14,15, bien que les amplitudes de réponse, en particulier celles des cellules ON-bipolaires, soient restées relativement faibles16. Pour pallier ces limitations, la fonction rétinienne est aujourd’hui plus couramment mesurée avec l’ERG in vivo, malgré des contraintes expérimentales et une interprétation plus compliquée des formes d’onde enregistrées. Bien que l’ERG ex vivo tente de reproduire le plus fidèlement possible les conditions physiologiques, il mesure néanmoins la fonction rétinienne dans un environnement artificiel et en l’absence de facteurs systémiques et de changements pathologiques. Cependant, lorsqu’elle est combinée avec l’ERG in vivo, cette limitation peut être utilisée pour répondre à des questions importantes, telles que si les changements dans la fonction rétinienne dans la maladie sont intrinsèques aux cellules rétiniennes ou causés par des changements systémiques17.
Récemment, les nouveaux détenteurs d’échantillons d’ERG ex vivo ont simplifié la méthodologie, rendant le GRE ex vivo accessible à une communauté de recherche plus large 2,3,5,18. Les modifications apportées à l’équipement existant de pince patch ou de réseau multiélectrode décrites dans ce protocole permettront à un plus grand nombre de laboratoires d’effectuer des ERG ex vivo avec un minimum d’investissements financiers et d’espace. En particulier, les développements récents de la technologie ERG ex vivo ont amplifié la réactivité des rétines isolées de mammifères et ont abouti à un rapport signal sur bruit supérieur, qui reste bon malgré les étapes d’amplification supplémentaires décrites dans ce protocole. Néanmoins, le déclin des réponses lumineuses, provenant principalement des cellules ON-bipolaires19, a peut-être entravé l’utilisation plus répandue de l’ERG ex vivo. L’utilisation du milieu d’Ames ou de Locke entraîne des réponses plus importantes des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires, ce qui les rend préférables, par exemple, à la solution de sonnerie tamponnée HEPES pour ERG3 ex vivo. D’autres laboratoires ont stabilisé ex vivo la fonction des cellules ON-bipolaires en complétant avec de la glutamine ou du glutamate19. Ce rapport montre comment obtenir des réponses lumineuses importantes et stables à partir de rétines isolées, y compris d’yeux de donneurs humains, comme indiqué précédemment8.
Les paramètres expérimentaux importants comprennent la température de la rétine, qui doit être maintenue dans la plage physiologique, et un taux de perfusion rapide. Les effets les plus notables de l’abaissement de la température dans le porte-échantillon ERG ex vivo sont une cinétique de réponse plus lente dans les photorécepteurs et les cellules ON-bipolaires et une amplitude atténuée des cellules ON-bipolaires. Bien que l’abaissement de la température semble avoir peu d’effet sur l’amplitude du photorécepteur dans la réponse combinée des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires, cela peut être un artefact dû aux changements différentiels dans la cinétique de réponse des deux types de cellules.
Un taux de perfusion suffisant semble être particulièrement critique pour la fonction rétinienne, plus susceptible de fournir de l’oxygène et des nutriments et d’éliminer les déchets. Alors que les amplitudes des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires sont quelque peu diminuées par une réduction modérée du taux de perfusion, même un arrêt court de la perfusion a aboli la fonction ON-bipolaire mais pas la fonction photoréceptrice. Cela implique que les réponses des photorécepteurs sont plus robustes et peuvent être plus facilement préservées dans les yeux qui subissent une expérimentation avec un retard important, tels que les yeux de donneurs humains8. Dans ce contexte, il est à noter que la fonction des cellules ON-bipolaires n’est pas diminuée en stockant les œillets dans le milieu oxygéné d’Ames pendant plusieurs heures. Nous émettons donc l’hypothèse que la perte de la fonction des cellules ON-bipolaires lorsque la perfusion dans le porte-échantillon ex vivo est arrêtée peut être due à un épuisement rapide de l’oxygène et d’autres nutriments dans le petit volume entourant la rétine dans le porte-échantillon. Ceci est soutenu par des rapports selon lesquels un court délai entre la mort et l’énucléation est essentiel pour enregistrer les réponses des photorécepteurs et, en particulier, des cellules ON-bipolaires de la rétine humaine, et que l’hypoxie post-mortem est le candidat le plus probable pour des dommages irréversibles à la fonction neuronale rétinienne8. Bien que les paramètres expérimentaux de l’ERG ex vivo aient été optimisés dans la rétine de la souris, ils ont néanmoins amélioré avec succès les conditions d’enregistrement des échantillons rétiniens provenant de grands animaux et d’yeux de donneurs humains.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions EY02665 et EY031706 du National Eye Institute et de l’International Retinal Research Foundation au Dr Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), et une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY, au Département d’ophtalmologie et des sciences visuelles, Université de l’Utah. Le Dr Frans Vinberg est également récipiendaire d’une bourse de développement de carrière de recherche pour prévenir la cécité/Dr H. James et Carole Free, et la Dre Silke Becker d’une subvention ARVO EyeFind. Nous remercions la Dre Anne Hanneken du Scripps Research Institute d’avoir fourni l’œil du donneur utilisé pour les enregistrements illustrés à la figure 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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