优化实验装置与条件 离体 用于研究大小眼视网膜功能的视网膜电图

摘要

对现有的多电极阵列或膜片钳设备进行改造可实现 离体 使视网膜电图更广泛可及。改进的记录与维持方法 离体 光反应有助于研究健康视网膜、眼病动物模型以及人类供体视网膜中光感受器和ON-双极细胞的功能。

摘要

视网膜神经元光反应的测量对于研究健康视网膜的生理功能、确定视网膜疾病的病理变化以及评估治疗干预效果至关重要。ex vivo 视网膜电图（ERG）可通过添加特异性药理学试剂，独立于系统性影响，量化离体视网膜中各类细胞的贡献，并评估组织内在的变化。视网膜光反应可使用一种专用的ex vivo ERG标本夹持装置和记录系统进行测量，该装置由现有的膜片钳或微电极阵列设备改装而成。特别是ON-双极细胞以及光感受器的研究，长期以来受到ex vivo ERG记录过程中光反应随时间缓慢但持续衰退的限制。提高灌流速度并调节灌流液温度可改善ex vivo视网膜功能，最大限度地提升反应幅度和稳定性。ex vivo ERG技术能够独特地研究视网膜中特定神经元细胞类型。此外，为最大化反应幅度和稳定性的技术改进，使得对大型动物以及人类供体眼球视网膜样本的光反应研究成为可能，从而使ex vivo ERG成为研究视网膜功能的技术体系中一项重要的补充手段。

引言

视网膜电图通过光刺激来测量视网膜功能¹。它在研究视网膜生理学和病理生理学以及评估视网膜疾病治疗效果方面具有重要作用。体内视网膜电图被广泛用于完整生物体中视网膜功能的评估，但存在显著局限性^2,3。其中，在体内视网膜电图中对单个视网膜细胞类型的定量分析受到限制，因为它记录的是所有视网膜细胞对光刺激所产生的电位变化总和，因而导致不同细胞反应相互叠加⁴。此外，该方法难以向视网膜直接施加药物，易受全身性因素影响，且信噪比较低。这些缺点在离体视网膜电图中得以消除，后者用于研究分离视网膜的功能^2,3,5,6。离体视网膜电图可通过添加药理学抑制剂记录到来自特定视网膜细胞类型的强而稳定的反应，并可方便地评估治疗药物——药物可直接加入灌流液中。同时，该方法排除了全身效应的干扰，并消除了生理噪声（如心跳或呼吸）。

在离体（ex vivo）视网膜电图（ERG）实验中，视网膜或视网膜样本被分离出来，并将感光细胞层朝上固定在标本架的穹顶上^3,5。将标本架组装好后，连接至灌流系统，该系统向视网膜提供加热且充氧的培养基，并将整个装置置于显微镜载物台上，该显微镜经过改装，可传递计算机控制的光刺激。为了记录光刺激引发的反应，标本架连接至放大器、数字化仪和记录系统（图1）。通过改变光刺激参数并添加药理学试剂，该技术可分别分离出视杆细胞和视锥细胞、ON-双极细胞以及穆勒胶质细胞的反应。

现有的膜片钳或微电极阵列（MEA）装置可通过商用ex vivo ERG适配器或定制的聚碳酸酯数控加工（CNC-machined）样品 holder，改装用于记录ex vivo ERG，以检测小动物模型（如小鼠）视网膜的光反应。该改装方式提高了ex vivo ERG技术的可及性，同时最大限度减少了对专用设备的需求。样品 holder 的设计简化了样品安装技术，并集成了电极，与此前报道的经视网膜ex vivo ERG方法相比，无需操作微电极⁷。样品 holder 内的灌流速率和温度是影响光感受器和ON双极细胞反应特性的关键因素。通过调节这些条件，可在较长时间内稳定地从小鼠离体视网膜记录到ex vivo ERG信号。优化的实验条件还可使ex vivo ERG记录应用于较大视网膜的视网膜穿孔样本，包括大型动物眼球和人供体眼球⁸。

方案

所有使用小鼠的实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物的护理和使用指南》进行，并经犹他大学机构动物研究委员会批准。本视频演示所用猪眼来自屠宰场（Sustainable Swine Resources, Johnsonville）的死后获取。人眼供体来自脑死亡或心脏死亡后经亲属同意用于科研的捐献者，获取机构为犹他州狮子眼科库、圣地亚哥眼科库或Lifesharing，这些机构均获得美国食品药品监督管理局（FDA）、器官获取组织协会（AOPO）以及美国眼库协会的全面认证。在犹他大学（IRB编号：00106658）和ScrippsHealth IRB（IRB编号：16-6781）中，使用人眼供体的研究被认定为豁免研究。

1. 建立离体视网膜电图（ex vivo ERG）系统

1. 将多电极阵列系统进行转换时，连接 离体 ERG 标本架 通过 将头端连接至差分放大器，差分放大器插入多电极阵列系统接口板的模拟输入端。使用多电极阵列系统的记录软件来记录并存储输入数据 离体 ERG。设置 增益 差分放大器的 100 并根据数字化仪的规格额外增加10倍电压放大。将低通滤波器设置为100 Hz。
2. 要改装膜片钳装置，需连接 离体 ERG 样品架 通过 将头级连接至差分放大器，该差分放大器与膜片钳放大器的头级相连。使用膜片钳系统软件和数据采集器记录并存储输入数据 离体 ERG。设置 增益 差分放大器的 100 并施加额外的10倍电压放大 通过 膜片钳头阶段。将低通滤波器设置为100 Hz。
3. 将具有适当波长（例如约530 nm，用于激发视杆光感受器和ON-双极细胞反应）的LED连接至显微镜。使用能够触发光刺激的记录软件控制LED。通过由数模转换器模拟输出控制的LED驱动器来调控光刺激。
4. 使用光电二极管校准LED在样本架视网膜位置处的光输出。如有必要，插入中性密度滤光片 进入光路以减弱光强。
5. 使用市售或定制的 离体 ERG 标本架
   注意：聚碳酸酯材料的数控加工图纸可向作者索取。
6. 准备电极时，将 Ag/AgCl 球状电极插入带螺纹的鲁尔接头中。用热熔胶填充鲁尔接头内部，并从无螺纹一侧将一个 2 mm 插座插入热熔胶中。将 EP1 电极的银导线焊接到 2 mm 插座上。将已完成的电极（螺纹处装有 O 形圈）旋入电极接口中 离体 ERG 标本架
   ​注意：电极可长期使用。若电极表面积累污垢和/或变暗（可能导致偏移电压升高和/或电漂移），可进行清洁处理 "抛光的" 使用细砂纸。
7. 至少在实验前1天，将滤纸粘贴到穹顶上 离体 使用环氧胶将ERG标本固定器粘合，确保胶水不堵塞电极通道（参见 ³ 用于视频。

2.  动物准备

1. 将动物在暗处适应至少 6 小时或过夜。

3. 仪器设备准备

1. 用通入5%二氧化碳和95%氧气的Ames培养基填充 ex vivo ERG的灌流管路。将灌流管路连接至靠近标本夹持器的直流电源或温度控制器加热元件，以加热Ames培养基，使视网膜保持在约35–38 °C。
2. 用记录电极液填充 ex vivo ERG标本夹持器的两个半部，用鲁尔封堵头密封灌流管路，连接电极，并用四颗螺丝组装夹持器（参见 ³ 中的视频）。
3. 将万用表探针插入电极，检测组装好的标本夹持器中两个电极之间的电阻和偏移电压。
   注意：若无堵塞且电极状态良好，电阻应低于100 kΩ，偏移电压应低于5 mV。
4. 将组装好的标本夹持器连接至灌流管路，并置于可提供闪光刺激的显微镜载物台上。确保标本夹持器和灌流管路中无任何气泡。

4. 组织制备

1. 用 CO₂ 处死动物后立即摘除眼球，或获取大型动物或人类供体眼球。
2. 清除眼球上残留的结缔组织和眼外肌，并剪除视神经。
3. 在滤纸上，用刀片在锯齿缘处小心地做一小切口，小鼠眼球切口位置距角膜缘约 1 mm。将精细的Vannas剪刀插入切口，沿角膜缘剪开，去除包含晶状体的眼前段。
4. 将眼杯转移至含有Ames培养基的培养皿中。用精细镊子夹住巩膜，注意避免接触视网膜。将Vannas剪刀插入视网膜与巩膜之间，从周边向中央方向剪开巩膜。操作过程中注意避免触碰或损伤视网膜。
5. 用Vannas剪刀将切口一侧的巩膜固定在解剖皿底部，用镊子夹住切口另一侧的巩膜。通过向两侧拉开切口处的巩膜，去除巩膜组织，从而在不接触或损伤视网膜的前提下实现视网膜的分离，最大限度减少组织损伤。
6. 从对侧眼去除包含晶状体的眼前段，并将眼杯置于室温下、经 5% 二氧化碳和 95% 氧气混合气体饱和的Ames溶液中保存。
   注意：以该方式保存的眼球可在数小时内获得功能性的光反应。
7. 对于包括人类供体眼球在内的大眼球，清除眼球上残留的结缔组织，去除眼前段和晶状体，操作方法与小鼠眼球类似。使用手术刀在距角膜缘约 3 mm 处做一切口。将弯头解剖剪插入切口，沿角膜缘剪开，去除包含晶状体的眼前段。使用 3–6 mm 一次性活检打孔器获取用于离体视网膜电图（ex vivo electroretinography）的视网膜样本。

5. 将组织安装到样本支架上

1. 将标本夹的下半部分放入一个大培养皿中，并加入充氧的Ames培养基，使标本夹的圆顶部分刚好浸没。
2. 用精细镊子小心夹住视网膜边缘，将视网膜转移至穹顶状结构上 离体 标本托盘，感光细胞侧朝上。
3. 从Ames溶液中取出标本架，注意保持视网膜位置不变。
4. 彻底干燥样品台以尽量减少噪声、电串扰和信号分流。
5. 将标本夹的两半用四颗螺丝组装在一起，并连接灌注管路。将电极在标本夹下半部分干燥，然后将阳极导线连接至视网膜内侧，阴极导线连接至光感受器侧。
6. 以每分钟至少1 mL的速度向标本架灌注含氧Ames培养基，持续10至20分钟，以使光反应有足够时间达到稳定。

6. 记录视网膜神经细胞功能

1. 通过逐渐增加光照强度刺激视网膜，记录其反应家族。例如，记录小鼠视杆细胞的反应家族时使用约10至1,000个光子/µm²的光强，记录小鼠ON-双极细胞的反应家族时使用约0.6至20个光子/µm²的光强。
2. 在含有100 µM氯化钡（可阻断Müller胶质细胞中的钾通道）和40 µM DL-AP4（可阻断谷氨酸能信号向ON-双极细胞的传递）的条件下，测量光感受器的光反应（a波）（图2B）。
3. 为分离源自ON-双极细胞功能的b波，首先在仅含氯化钡的条件下记录光感受器与ON-双极细胞的联合光反应（图2A）。然后，用含有氯化钡和DL-AP4的Ames培养基灌流5-10分钟，再次施加与之前相同的光刺激并记录光感受器的反应（图2B）。将光感受器反应从联合反应中减去，从而单独计算出ON-双极细胞的光反应（图2C）。

7. 优化ON-双极细胞功能

注意：起源于ON-双极细胞的b波对样本架的温度和灌流速率高度敏感。

1. 保持灌注速率至少为0.5 mL/min以获得b波。
   注意：较高的灌流速率（1-2 mL/min）更有利于维持ON-双极细胞的强而稳定反应。
2. 确保在给定灌注速率下，视网膜附近标本 holder 内的温度接近体温（即约 35–38 °C）。
   注意：在灌注液到达之前需对其温度进行调节，加热至适宜温度 离体 ERG 标本架，使其处于视网膜的最佳温度范围内。
3. 将眼杯置于室温下避光保存于充氧的Ames培养基中，以维持数小时内的正常a波和b波，供后续实验使用。

结果

离体 ERG 能够记录可重复且稳定的光感受器和 ON-双极细胞的光反应，例如来自小鼠视网膜的记录图 2A-C）。利用人尸体供体视网膜记录光感受器反应，在眼球摘除后最长可达5小时的死后延迟时间内仍可实现图 2D以及ON-双极细胞反应的 <20分钟去核延迟（图2E）。获得大反应幅度的重要参数包括精细的解剖技术、较高的灌注速率，以及接近生理值的灌注温度（哺乳动物视网膜为35–38 °C）。在这些条件下，两种细胞类型的反应幅度和动力学随时间相对稳定，但在视网膜安装到样品支架上约40–45分钟后逐渐下降（图3).

与光感受器相比，ON-双极细胞的功能更容易受到干扰，例如在解剖和安装过程中对视网膜的损伤，或温度和/或灌注速度的下降。虽然样本槽中温度降低显著减缓了光感受...

讨论

最初由Holmgren于1865年开发，用于测量两栖动物视网膜的视网膜光反应¹⁰，技术限制最初阻碍了视网膜电图（ERG）的广泛应用。然而，Ragnar Granit 等人的开创性研究确定了 ERG 的细胞来源，并测量了光感受器和ON-双极细胞的反应 离体^11,12,13此后，经过改进的方法使得其应用更加广泛 离体 ERG 记录^14,15，尽管反应幅度，尤其是来自ON双极细胞的反应幅度，仍然相对较小¹⁶为了克服这些局限性，目前视网膜功能更多地通过 体内 ERG，尽管存在实验限制且记录波形的解释更为复杂。尽管 离体 ERG 尽管尽可能地模拟生理条件，但它仍是在人工环境中测量视...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mm 套筒	WPI	2026-10	制备电极所需材料
Ag/AgCl 电极	World Precision Instruments	EP1	制备电极所需材料
Ames 培养基	Sigma Aldrich	A1420	灌流培养基
氯化钡	Sigma Aldrich	B0750	钾通道阻滞剂
DL-AP4	Tocris	0101	广谱谷氨酸能拮抗剂
OcuScience 离体 ERG 适配器	OcuScience	n/a	离体 ERG 标本固定装置
螺纹鲁尔接头	McMaster-Carr	51525K222 或 51525K223	制备电极所需材料