Summary
Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.
Abstract
Der durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte immunogene Zelltod von Tumoren kann tumorspezifische T-Zell-Reaktionen auslösen, indem er gefahrenassoziierte molekulare Muster freisetzt und die Produktion von Typ-I-Interferon induziert. Immuntherapien, einschließlich der Checkpoint-Hemmung, sind in erster Linie auf bereits vorhandene tumorspezifische T-Zellen angewiesen, um eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Daher können synergistische Therapieansätze, die den immunogenen Zelltod als intrinsischen Krebsimpfstoff nutzen, ihre Reaktionsfähigkeit verbessern. Das Spektrum immunogener Faktoren, die von Zellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, bleibt jedoch unvollständig charakterisiert, insbesondere in Bezug auf extrazelluläre Vesikel (EVs). EVs, nanoskalige membranöse Partikel, die von praktisch allen Zellen emittiert werden, sollen die interzelluläre Kommunikation erleichtern und bei Krebs nachweislich Cross-Priming gegen Tumorantigene vermitteln. Um die immunogene Wirkung von EVs aus Tumoren unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, werden anpassungsfähige, skalierbare und valide Methoden gesucht. Daher wird hierin ein relativ einfacher und robuster Ansatz zur Beurteilung der In-vivo-Immunogenität von Elektrofahrzeugen vorgestellt. Das Protokoll basiert auf der Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen nach In-vivo-Immunisierung von Mäusen mit EVs, isoliert durch fällungsbasierte Assays aus Tumorzellkulturen unter Therapie oder stationären Bedingungen. Zum Beispiel zeigt diese Arbeit, dass die Oxaliplatin-Exposition von B16-OVA-murinen Melanomzellen zur Freisetzung immunogener EVs führte, die die Aktivierung tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellen vermitteln können. Daher identifiziert das Screening von EVs durch In-vivo-Immunisierung und Durchflusszytometrie Bedingungen, unter denen immunogene EVs entstehen können. Die Identifizierung der Bedingungen der immunogenen EV-Freisetzung ist eine wesentliche Voraussetzung, um die therapeutische Wirksamkeit von EVs gegen Krebs zu testen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, um letztendlich neue Erkenntnisse über die Rolle von EVs in der Krebsimmunologie zu gewinnen.
Introduction
Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle im Kampf gegen Krebs, sowohl wenn es durch Immun-Checkpoint-Hemmung angeregt wird, als auch für die Wirksamkeit konventioneller Krebstherapien. Tumorzellen, die genotoxischen Therapien wie den Chemotherapeutika Oxaliplatin und Doxorubicin oder der ionisierenden Strahlenbehandlung erliegen, können Antigene und gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) freisetzen, die möglicherweise eine adaptive Antitumor-Immunantwort auslösen1. Zu den bekanntesten DAMPs im Zusammenhang mit dem immunogenen Zelltod gehören Find-me-Signale wie chemotaktisches ATP, Eat-Me-Signale wie die Exposition von Calreticulin, das die Aufnahme von Tumorzellen durch Antigen-präsentierende Zellen fördert, und die Freisetzung von HMGB1, das Mustererkennungsrezeptoren aktiviert und dadurch die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen verbessert2. Darüber hinaus werden Typ-I-Interferone (IFN-I), die über tumorabgeleitete immunogene Nukleinsäuren oder andere Reize induziert werden, von dendritischen Zellen wahrgenommen, so dass sie tumorspezifische zytotoxische T-Zellen effektiv primieren können3,4. Klinisch, aktivierte und proliferierende CD8+ T-Zellen, die den Tumor infiltrieren, bieten bei vielen Krebspatienten einen unabhängigen prognostischen Faktor für ein verlängertes Überleben. IFN-γ wird aus solchen aktivierten T-Zellen freigesetzt und vermittelt direkte antiproliferative Wirkungen auf Krebszellen und treibt die Th1-Polarisation und die zytotoxische T-Zell-Differenzierung voran, wodurch es zu einer wirksamen Immunüberwachung gegen Krebs beiträgt5,6. Oxaliplatin ist ein echter immunogener Zelltodinduktor, der eine solche adaptive Immunantwort gegen Krebs vermittelt7. Die Fülle der anfänglichen immunogenen Signale, die von Tumorzellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, muss jedoch noch vollständig enthüllt werden. Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsimmuntherapie bleibt die Ausweitung des Nutzens auf einen größeren Teil der Patienten eine Herausforderung. Ein detaillierteres Verständnis der immunogenen Signale, die die T-Zell-Aktivierung initiieren, könnte die Entwicklung neuartiger Therapien leiten.
Eine heterogene Gruppe von membranumschlossenen Strukturen, die als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt sind, scheinen als interzelluläre Kommunikationsgeräte zu dienen. EVs, die von praktisch allen Zelltypen emittiert werden, transportieren funktionelle Proteine, RNA, DNA und andere Moleküle zu einer Empfängerzelle oder können den Funktionszustand einer Zelle verändern, indem sie einfach an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Ihre biologisch aktive Fracht variiert erheblich je nach Art und Funktionszustand der erzeugenden Zelle8. In der Krebsimmunologie wurden EVs, die aus Tumorzellen freigesetzt werden, überwiegend als Gegner der Immuntherapie angesehen, da sie schließlich das invasive Wachstum fördern, metastasierende Nischen9 präformen und die Immunantwort unterdrücken10. Im Gegensatz dazu haben einige Studien gezeigt, dass EVs Tumorantigene auf dendritische Zellen übertragen können, um eine effektive Kreuzpräsentation zu ermöglichen11,12. EVs können immunstimulierende Nukleinsäuren liefern, wenn sie unter therapieinduziertem Stress entstehen, was eine Anti-Tumor-Immunantwort ermöglicht13,14. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Erfassung solcher RNA- und DNA-angeborenen Immunliganden in der Tumormikroumgebung die Reaktionsfähigkeit auf die Checkpoint-Blockade signifikant moduliert15,16,17. Daher muss die immunogene Rolle von EVs, die von Tumorzellen unter verschiedenen therapieinduzierten Belastungen freigesetzt werden, weiter aufgeklärt werden. Da EVs ein junges, aber wachsendes Forschungsfeld darstellen, ist die Standardisierung der Methoden noch nicht abgeschlossen. Daher ist der Austausch von Wissen unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit der Forschung über Wechselwirkungen zwischen EVs und Krebsimmunologie zu verbessern. Vor diesem Hintergrund beschreibt dieses Manuskript ein einfaches Protokoll zur Beurteilung der immunogenen Wirkung von tumorabgeleiteten EVs in vivo.
Diese Bewertung wird durchgeführt, indem tumorabgeleitete EVs erzeugt, Empfängermäuse mit diesen EVs immunisiert und Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Die EV-Erzeugung erfolgt idealerweise durch die Aussaat muriner Tumorzellen in einem EV-freien Zellkulturmedium für einen hohen Reinheitsgrad. Zellen werden mit einem spezifischen Zellstressreiz wie einer Chemotherapie behandelt, um die Wirkung von therapieinduzierten EVs mit der Ausgangsimmunogenität der jeweiligen tumorabgeleiteten EVs zu vergleichen. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen kann durchaus durch verschiedene Techniken erfolgen, die je nach In-vivo-Anwendbarkeit und lokaler Verfügbarkeit ausgewählt werden sollten. Das folgende Protokoll beschreibt einen niederschlagsbasierten Assay mit einem kommerziellen Kit zur EV-Reinigung. Mäuse werden zweimal mit diesen EVs immunisiert. Vierzehn Tage nach der ersten Injektion werden T-Zellen aus der Milz extrahiert und mittels Durchflusszytometrie auf die IFN-γ-Produktion analysiert, um eine systemische Immunantwort zu bewerten. Auf diese Weise wird das Potenzial von tumorabgeleiteten EVs, die unter verschiedenen therapeutischen Therapieschemata entstehen, relativ einfach, schnell und mit hoher Validität bewertet13. Daher eignet sich diese Methode für ein immunologisches Screening von EVs aus Krebszellen unter verschiedenen Bedingungen.
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Protocol
Zu Beginn der Experimente waren die Mäuse mindestens 6 Wochen alt und wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das vorliegende Protokoll entspricht den institutionellen ethischen Standards und den geltenden lokalen Vorschriften. Tierversuche wurden von der örtlichen Zulassungsbehörde (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Mögliche geschlechtsspezifische Verzerrungen wurden in diesen Studien nicht untersucht.
1. Erzeugung und Isolierung von EVs aus Tumorzellen nach Chemotherapie-Exposition
- Kultur murine B16-Melanomzellen, die Ovalbumin (B16-OVA) in DMEM (mit 4 mM L-Glutamin und 4,5 g/L D-Glukose) exprimieren, ergänzt mit FCS (10% v/v), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) bei 37 °C, bis die Zellen stetig wachsen und zu etwa 90% konfluieren.
HINWEIS: Führen Sie diesen Abschnitt des Protokolls vollständig unter sterilen Bedingungen mit einer Zellkulturhaube durch. Für die Analyse anderer Krebsentitäten sind Zelllinien, die ein starkes Antigen exprimieren, vorzuziehen, um antigenspezifische T-Zell-Antworten zu bewerten, da sie eine spezifische Ex-vivo-Antigenrestimulation ermöglichen. - Um die für die EV-Erzeugung erforderlichen Zellkulturmedien vorzubereiten, entleeren Sie Rinder-EVs innerhalb von FCS durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 24 h bei 4 ° C und entsorgen Sie dann das Pellet. Alternativ können Sie vorher eine handelsübliche Zubereitung mit wenig tierischen Elektrofahrzeugen wählen.
- Ernten Sie B16-OVA-Zellen und waschen Sie sie zweimal in PBS und säen Sie sie dann in einer Konzentration von 400.000 Zellen / ml in EV-erschöpften Medien.
HINWEIS: Passen Sie die Zellkonzentration an die Wachstumsdynamik der untersuchten Zelllinie an, damit die Zellen nicht überwachsen. - Behandeln Sie B16-OVA-Zellen durch Zugabe von 30 μg Oxaliplatin pro ml und inkubieren Sie 24 h bei 37 °C. Lassen Sie die Kontrollbedingungen unbehandelt. Bei der ersten Verwendung einer genotoxischen Substanz titrieren Sie die gewünschte zytotoxische Wirksamkeit unter Verwendung von Zelllebensfähigkeitstests wie Trypan Blue Exclusion18.
HINWEIS: Dieser Assay kann auch EVs bewerten, die in Zellkulturen erzeugt werden, die neben Chemotherapeutika mit anderen immunmodulierenden Substanzen oder ionisierender Bestrahlung behandelt wurden.
ACHTUNG: Oxaliplatin verursacht Haut- und schwere Augenreizungen und kann eine allergische Hautreaktion und Atemwegsreizungen verursachen. Oxaliplatin steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Verwenden Sie vorsichtshalber persönliche Schutzausrüstung, einschließlich angemessener Handschuhe, Schutzbrillen, Masken und Kleidung, die vor der Wiederverwendung gereinigt werden. Vermeiden Sie das Einatmen und waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Vermeiden Sie die Freisetzung in die Umwelt und entsorgen Sie Oxaliplatin gemäß den geltenden Vorschriften. Informieren Sie sich ausführlich über das Sicherheitsdatenblatt. - Sammeln Sie Zellkulturüberstände. Zentrifugieren Sie zuerst bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und dann bei 2.000 x g für 30 min bei 4 °C, wobei jedes Mal das Pellet entsorgt wird. Zum Schluss filtern Sie durch eine 220 nm PVDF-Membran. Verwenden Sie für jeden Schritt ein frisches Rohr, um Zelltrümmer zu entfernen.
HINWEIS: In diesem Stadium kann der EV-haltige Überstand einen Tag lang bei 4 °C gelagert werden, bevor das Protokoll fortgesetzt wird. Es wird jedoch dringend empfohlen, den beschriebenen Zeitplan mit sofortiger EV-Reinigung einzuhalten. - Mischen Sie 1 ml Überstand mit 0,5 ml eines bestimmten kommerziell erhältlichen Exosom-Isolationsreagenzes (siehe Materialtabelle) in einem V-förmigen 1,5-ml-Rohr. Pipettieren Sie gründlich auf und ab oder wirbeln Sie, um eine homogene Lösung zu erhalten. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 60 min bei 4 °C. Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Entfernen Sie die verbleibenden Tropfen, indem Sie das 1,5-ml-Rohr kopfüber auf ein Papiertuch klopfen und durch eine Pipette mit einer feinen Spitze absaugen, ohne das EV-Pellet am Boden zu berühren.
- Entfernen Sie gründlich alle Flüssigkeiten, um eine unkontrollierte Verdünnung des EV-Pellets zu verhindern. Führen Sie diese Aufgaben auch schnell aus, um zu verhindern, dass das Pellet austrocknet.
- Suspendieren Sie die EVs in kaltem PBS, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne das Pellet mit der Spitze von der Rohrwand zu kratzen. Übertragen Sie nun die Aufhängung Schritt für Schritt von der ersten auf die letzte Röhre, um die EVs zu bündeln.
HINWEIS: Verwenden Sie ein PBS-Volumen, das 5 μL multipliziert mit der Anzahl der Röhrchen entspricht. 5 μL der endgültigen Suspension enthalten die isolierten EVs, die aus 400.000 Zellen unter Chemotherapie oder in einem stabilen Zustand freigesetzt werden. - Verwenden Sie vorzugsweise Elektrofahrzeuge direkt. Wenn dies nicht möglich ist, lagern Sie EV-Suspensionen bei -80 °C in silikonisierten Gefäßen bis zu 28 Tage bis zur Anwendung.
HINWEIS: Die hier und in mehreren anderen Publikationen beschriebenen EVs verlieren ihre jeweilige biologische Funktion nicht, wenn sie für diesen Zeitraum bei -80 °C gelagert werden19. - Quantifizierung und Charakterisierung von EV-Isolaten gemäß den MISEV2018-Richtlinien20.
HINWEIS: Mögliche Methoden zur Quantifizierung sind die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)21 und der Nachweis der membrangebundenen Proteine von EV22. Mögliche Ansätze zur weiteren Charakterisierung von EVs sind die Elektronenmikroskopie23 und Western Blot20.
2. Immunisierung von Mäusen mit EVs
- Planen Sie das In-vivo-Experiment mit C57BL/6-Mäusen (oder anderen syngenen Mäusen, die der Tumorzelllinie entsprechen), einschließlich Behandlungsgruppen, die EVs erhalten, die von behandelten Zellen, unbehandelten Zellen bzw. PBS (Vehikel) abgeleitet sind.
HINWEIS: Verwenden Sie vorzugsweise Mäuse im Alter von 6-8 Wochen, um zu verhindern, dass physiologische Seneszenz die Immunantwort verringert24. - Mischen Sie 5 μL EV-Suspension mit 55 μL kaltem PBS für jede Maus innerhalb der jeweiligen Behandlungsgruppe, um sie mit EVs zu immunisieren, die aus 4,0 x 105 B16-OVA-Zellen isoliert wurden.
HINWEIS: Diese Menge an Elektrofahrzeugen entspricht etwa 2 x 109 Partikeln, die durch eine Nanopartikel-Tracking-Analyse gemessen wurden (Daten nicht gezeigt). OVA-Protein, gemischt mit einem Adjuvans (z. B. LPS), kann als potente Impfstoff-Positivkontrolle angewendet werden.- Spritzen (Nadelgröße 26-30 G) mit 60 μL der verdünnten EVs bzw. PBS füllen und sofort auf Eis legen.
HINWEIS: Im Protokoll wird die Menge der injizierten EVs auf die Anzahl der EV-freisetzenden Tumorzellen normalisiert, um sowohl qualitative als auch quantitative Wirkungen von Oxaliplatin auf die Biogenese von Tumorzell-EV experimentell zu berücksichtigen. Für einige Leser kann die Normalisierung auf eine bestimmte Konzentration von produzierten Elektrofahrzeugen je nach wissenschaftlicher Fragestellung besser zu ihrem Versuchsaufbau passen.
- Spritzen (Nadelgröße 26-30 G) mit 60 μL der verdünnten EVs bzw. PBS füllen und sofort auf Eis legen.
- Impfen Sie EVs oder PBS subkutan in den medialen Aspekt des Oberschenkels der Mäuse und wiederholen Sie die Immunisierung nach 7 Tagen. Vierzehn Tage nach der ersten Behandlung opfern Sie Mäuse, z.B. durch Zervixdislokation, um die Immunantwort zu analysieren.
HINWEIS: Alternative subkutane Injektionswege können gemäß den lokalen Standards verwendet werden.
3. Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen
- Bereiten Sie das komplette RPMI (cRPMI) vor und kühlen Sie es ab und ergänzen Sie RPMI-1640 mit FCS (10% v/v), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 μg/ml), L-Glutamin (2 mM) und β-Mercaptoethanol (50 μM).
- Sezieren Sie die Milz aus der geöffneten Bauchhöhle. Zerdrücken Sie die Milz mit einem angefeuchteten 100 μm Zellsieb und dem Kunststoffkolben einer Spritze und spülen Sie die Milzzellen in ein 50 ml Rohr mit 5-10 mL cRPMI. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
HINWEIS: Halten Sie die Zellen wann immer möglich auf Eis. Um die lokale und nicht die Milzimmunantwort zu analysieren, resezieren Sie die entwässernden Popliteal- und Leistenlymphknoten nach demselben Protokoll. Überspringen Sie in diesem Fall den nächsten Schritt für die Lyse von Erythrozyten. - Um Erythrozyten aus der Zellsuspension zu entfernen, resuspendieren Sie das Pellet mit 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie cRPMI hinzufügen. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
- Für die Aussaat suspendieren Sie das Zellpellet in cRPMI und zählen Sie die Zellen, um Verdreifachungen von 200.000 Zellen mit 200 μL cRPMI in jede Vertiefung zu legen, wobei eine 96-Well-Platte mit einem U-förmigen Boden verwendet wird. 48 h bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Um die Antigenspezifität aktivierter T-Zellen zu adressieren, fügen Sie 1 μg / ml lösliches Ovalbumin (oder ein anderes Tumorantigen, das der untersuchten Zelllinie entspricht) hinzu oder lassen Sie es ohne zusätzlichen Reiz. Die Zugabe des immundominanten Peptidepitops SIINFEKL anstelle von Ovalbumin in voller Länge ermöglicht eine kürzere Inkubationszeit. Neben der Durchflusszytometrie können das Serum der Mäuse und der Zellkulturüberstand nach 48 h Inkubation auf verschiedene Zytokine analysiert werden. - Um die intrazelluläre IFN-γ-Färbung zu verbessern, indem unter anderem die Golgi-vermittelte Sekretion von Proteinen blockiert wird, fügen Sie nach 48 h Brefeldin A (5 ng/ml), PMA (20 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) zur Zellkultur hinzu. 4 h bei 37 °C inkubieren.
- Bevor Sie Oberflächenbiomarker färben, übertragen Sie Splenozyten auf eine 96-Well-Platte mit einem V-förmigen Boden und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Fügen Sie dann fluoreszierende Antikörper hinzu, die mit dem lokal verfügbaren Durchflusszytometer kompatibel sind und gegen Oberflächenbiomarker gerichtet sind, CD3, CD8 und CD4 (siehe Materialtabelle), verdünnt 1:400, sowie einen fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff, verdünnt 1:1.000 in PBS. Pelletierte Splenozyten in der Färbelösung resuspendieren und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Zur Fixierung und Permeabilisierung von Splenozyten zweimal in FACS-Puffer (PBS plus 3% v/v FCS) waschen und dann in 100 μL Fixations-/Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) pro Vertiefung resuspendieren. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Zur Färbung von intrazellulärem IFN-γ die Splenozyten im Fixations-/Permeabilisierungspuffer waschen und mit fluoreszierenden Antikörpern gegen IFN-γ, verdünnt 1:200 im Puffer, resuspendieren. Inkubieren Sie mindestens 1 h (bis zu einem Maximum von 12 h) bei 4 °C, lichtgeschützt.
- Bevor Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie messen, waschen Sie die Splenozyten zweimal im Fixations-/Permeabilisierungspuffer und resuspendieren Sie sie im FACS-Puffer. Analysieren Sie die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen gemäß der in Abbildung 2 dargestellten Gating-Strategie.
- Erstens, um einzelne Zellen zu erkennen, tupfen Sie FSC-H gegen FSC-A. Um dann lymphatische Zellen nachzuweisen, tupfen Sie SSC gegen FSC-A. Wählen Sie anschließend lebende CD3+-, CD4-, CD8+-Zellen aus und bestimmen Sie deren IFN-γ-produzierende Teilmenge, um die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen in der Milz zu quantifizieren.
HINWEIS: Fügen Sie einen FMO-Fleck (Fluorescence-minus-one) mit allen Fluorochromen außer dem gegen IFN-γ gerichteten Fluorochrom als technische Negativkontrolle hinzu.
- Erstens, um einzelne Zellen zu erkennen, tupfen Sie FSC-H gegen FSC-A. Um dann lymphatische Zellen nachzuweisen, tupfen Sie SSC gegen FSC-A. Wählen Sie anschließend lebende CD3+-, CD4-, CD8+-Zellen aus und bestimmen Sie deren IFN-γ-produzierende Teilmenge, um die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen in der Milz zu quantifizieren.
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Representative Results
Dieses Protokoll soll die einfache und leicht reproduzierbare Beurteilung der Immunogenität von tumorabgeleiteten EVs erleichtern. Dabei werden Mäuse mit EVs beimpft, die aus In-vitro-Kulturen von Tumorzellen gewonnen werden, die das Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimieren. Die anschließende Immunantwort wird in Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 1 gibt einen Überblick über die praktischen Schritte des gesamten Protokolls. Da sich die Arbeit auf den immunogenen Zelltod, die Kreuzpräsentation und die EV-induzierte Antitumorimmunität konzentriert, ist dieses Protokoll auf die Funktion von CD8+ zytotoxischen T-Zellen beschränkt. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden die Zellen als Einzelzellen, Lymphozyten-Untergruppe (nach Größe und Granularität), lebensfähige Zellen (ohne Lebens- / Totenmarker) und CD3 + CD4- CD8 + zytotoxische T-Zellen eingezäunt. Die intrazelluläre Akkumulation von IFN-γ wurde als Surrogatmarker für die Aktivierung bewertet. Mögliche zusätzliche Marker bezüglich T-Zell-Differenzierung und -Erschöpfung werden im Folgenden diskutiert.
Mit der hier beschriebenen Methode wurden Mäuse mit EVs immunisiert, die aus OVA-exprimierenden Tumorzellen gewonnen wurden, die entweder unter stationären (unbehandelten) oder genotoxischen Stressbedingungen (oxaliplatinbehandelt) kultiviert wurden. Nur Mäuse, denen EVs aus Tumorzellen unter genotoxischen Stressbedingungen injiziert wurden, induzierten eine starke Aktivierung von zytotoxischen Milz-T-Zellen bei Empfängertieren (Abbildung 3A). Die Injektion von EVs, die aus Tumoren unter stationären Bedingungen stammten, führte zu einer gewissen T-Zell-Aktivierung, aber das unterschied sich nicht signifikant von der T-Zell-Aktivierung bei Mäusen, denen das PBS-Vehikel injiziert wurde. Diese Daten zeigen, dass Tumorzellen unter genotoxischem Stress potent immunogene EVs freisetzen können. Die Produktion von IFN-γ war besonders erhöht, wenn Splennozyten von Tumor-EV-behandelten Tieren vor der Analyse ex vivo mit dem Modell-Tumorantigen OVA restimuliert wurden (Abbildung 3B). Diese Daten deuten darauf hin, dass tumorabgeleitete EVs Tumorantigen-spezifische Immunantworten induzieren können. Interessanterweise wird die IFN-γ-Produktion - wenn auch in viel geringerem Maße - auch in Abwesenheit einer antigenspezifischen Restimulation nachgewiesen. Möglicherweise können andere Melanom-assoziierte Antigene, wie das Differenzierungsantigen TRP225, von einem Teil der EV-induzierten T-Zell-Antwort angegriffen werden.
Abbildung 1: Piktografische Übersicht über das Protokoll . (A) Isolationsverfahren von EVs, die in Tumorzellkulturen erzeugt werden, die einer Chemotherapie ähneln. (B) Zeitplan für die Immunisierung von Mäusen mit EVs. C) Färbeprotokoll für die Durchflusszytometrie-Analyse zytotoxischer T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Analyse der zytotoxischen T-Zell-Aktivierung in der Milz. Die Zahlen stellen den Prozentsatz der jeweiligen Mutterbevölkerung dar. FSC-A: Vorwärtsstreubereich; FSC-H: Vorwärtsstreuhöhe; SSC: seitliche Streuung; Lebend/tot: Zelltodmarker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: EVs, die aus Tumorzellen unter genotoxischem Stress gewonnen werden, können bei Empfängertieren antigenspezifische T-Zell-Reaktionen induzieren. (A) Mäuse wurden mit EVs immunisiert, die aus Tumorzellen gewonnen wurden, die entweder unter stationären (unbehandelten) oder genotoxischen Stressbedingungen (oxaliplatin-behandelt) kultiviert wurden. Fahrzeugeinspritzungen (PBS) wurden als Negativkontrolle verwendet. Die IFN-γ-Produktion durch zytotoxische T-Zellen in der Milz bei EV-Immunisierung wurde bestimmt. Dabei wurden Milzzellsuspensionen vor der Analyse ex vivo mit Ovalbumin restimuliert. (B) Mäuse wurden mit EVs aus Tumorzellen unter genotoxischen Stressbedingungen wie oben beschrieben behandelt. Die Aktivierung der Milz-T-Zellen wurde nach Ex-vivo-Restimulation entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Ovalbumin bestimmt. Balken stellen den Mittelwert pro Gruppe dar und schnurrt seinen Standardfehler. Der One-Way Analysis of Variance (ANOVA) Test mit Bonferroni Posttest wurde für mehrere statistische Vergleiche eines Datensatzes verwendet. Das Signifikanzniveau wurde auf P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001 festgelegt und ist hier mit Sternchen (*, ** und ***) gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine immunologische In-vivo-Bewertung von EVs, die aus Melanomzellen unter chemotherapieinduziertem Stress gewonnen werden, während es sich an EVs anpasst, die von verschiedenen Krebsarten unter verschiedenen Behandlungen emittiert werden. Die Immunisierung von Mäusen mit EVs, die aus Oxaliplatin-behandelten B16-OVA-Zellen gewonnen werden, erweitert beispielsweise IFN-γ-produzierende CD8+ T-Zellen in der Milz, die durch Ex-vivo-Inkubation mit Ovalbumin weiter stimuliert werden, was auf eine tumorspezifische Immunantwort hinweist. So ermöglicht der Nachweis immunogener EVs durch Screening durch dieses Protokoll ein umfassenderes Verständnis konventioneller Krebstherapien und ermöglicht eine fokussierte Untersuchung der Rolle von EVs in der Krebsimmunologie.
Bemerkenswert ist, dass Experimente mit Elektrofahrzeugen einige besondere Überlegungen erfordern. In diesem Protokoll werden EVs semi-quantitativ auf die Anzahl der Tumorzellen normalisiert, die innerhalb von 24 h freigesetzt werden. Dieser Ansatz spiegelt das Ziel wider, eine verbesserte Immunogenität zu identifizieren, unabhängig davon, ob sie sich aus Veränderungen der Qualität oder Quantität der freigesetzten Elektrofahrzeuge ergibt. Daher beruhen reproduzierbare In-vivo-Ergebnisse auf der konstanten Isolationswirksamkeit von EVs. Zu diesem Zweck ist es ein entscheidender Schritt, sicherzustellen, dass EV-Pellets vollständig und zeitnah resuspendiert werden, um eine Austrocknung zu vermeiden.
Darüber hinaus müssen EVs quantifiziert und charakterisiert werden, z. B. durch Nanopartikel-Tracking-Analyse und Western Blot von kanonischer Transmembran, luminal und mindestens einem negativen EV-Marker20. Quantifizierung und Charakterisierung von EVs-Kontrollen für inkonstante Isolierung und Adressierung quantitativer Unterschiede in EVs oder EV-Teilmengen. Diese Art der EV-Charakterisierung stellt einen Teil der Mindestinformationen dar, die in Studien über extrazelluläre Vesikel gemäß den Richtlinien der International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) berichtet werden müssen. Verschiedene Charakterisierungsmethoden sind jedoch gleichermaßen legitim und sollten hinsichtlich der lokalen Verfügbarkeit und der individuellen Forschungsfrage gewählt werden. Insbesondere die Definition der Dosierung einer Substanz von Interesse oder ionisierender Bestrahlung stellt einen weiteren kritischen Schritt des Protokolls dar, der möglicherweise eine experimentelle Validierung erfordert, um ein angemessenes Maß an Zelltod zu erreichen.
Im Allgemeinen muss eine mögliche Kontamination isolierter EVs mit der Behandlungssubstanz, löslichen Proteinen und Lipoproteinen berücksichtigt werden. Eine Strategie in dieser Hinsicht besteht darin, das Experiment mit komplementären EV-Isolationstechniken zu reproduzieren, die die gleiche Art von Kontamination20 möglicherweise nicht beeinträchtigt. Die Immunaffinität isoliert beispielsweise Elektrofahrzeuge mit einer geringeren Ausbeute, aber einer höheren Spezifität als rein fällungsbasierte Methoden und kann in dieser Hinsicht eine geeignete Kontrolle bieten26. Ein alternativer Ansatz besteht darin, von Wildtypzellen abgeleitete Elektrofahrzeuge mit Isolationen aus gentechnisch veränderten Zellen mit einer spezifischen Deletion von Genen zu vergleichen, die an der Biogenese von Elektrofahrzeugen beteiligt sind, oder Substanzen einzusetzen, die die Emission von Elektrofahrzeugen reduzieren20.
Die Ergebnisse dieses Protokolls sollten durch eine umfassendere Charakterisierung der EV-vermittelten Immunantwort ergänzt werden. Insbesondere die Einteilung von CD8+ T-Zellen in Effektor- und Effektorgedächtniszellen, durch CD4427, sowie antigennaive und zentrale Speicherzellen, durch CD62L28, kann tiefere Einsichten vermitteln. Darüber hinaus könnte die Analyse von T-Helferzellen, regulatorischen T-Zellen und NK-Zellen von Interesse sein. Um die Anti-Tumor-Wirksamkeit von EVs zu testen, können Mäuse nach der EV-Immunisierung mit den entsprechenden Krebszellen herausgefordert oder mit EVs gegen einen voretablierten Krebs behandelt werden, wodurch die Richtlinien für den Nachweis des immunogenen Zelltods2,29 an dieses zellfreie Tumorderivat angepasst werden. Die Schlussfolgerungen aus all diesen Versuchsaufbauten sind jedoch durch die Tatsache begrenzt, dass Krebszellen in einer Petrischale möglicherweise funktionell andere EVs erzeugen als Krebszellen, die in eine dynamische Tumormikroumgebung eingebettet sind30, die häufig die Anti-Krebs-Immunität unterdrückt. Daher kann die Beurteilung von EVs, die aus Tumor-/Fibroblasten-Kokulturen oder Ex-vivo-Tumorgewebe stammen, die tatsächliche Situation besser widerspiegeln. In einem nächsten translationalen Schritt in Richtung klinischer Realität können EVs aus Patientenmaterial vor und während der Therapie auf Immunogenität analysiert werden, um ihre Verwendbarkeit als Biomarker zu bewerten.
Da kürzlich festgestellt wurde, dass krebsbedingte Elektrofahrzeuge - unter bestimmten Umständen - das Immunsystem modulieren, hat die Erforschung ihres klinischen Potenzials gerade erst begonnen31. Für eine eingehende Analyse der Immunmechanismen, die von immunogenen EVs kooptiert werden, umfassen nützliche Werkzeuge die Fluoreszenzmikroskopie, die die EV-Aufnahme durch bestimmte Zellen visualisiert, den Einsatz von Mäusen mit genetischen Mängeln für bestimmte Immunwege und Screening-Methoden für molekulare Veränderungen des EV-Gehalts. Letztendlich wird die Identifizierung immunogener tumorabgeleiteter EVs mit den hierin beschriebenen Screening-Methoden ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen hinter der EV-vermittelten Immunität ermöglichen und stellt daher einen entscheidenden Schritt zur Nutzung ihres Potenzials gegen Krebs dar.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 und Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (an H.P.), ein Mechtild Harf Forschungsstipendium der DKMS Foundation for Giving Life (an H.P.) ein Young Investigator Award der Melanoma Research Alliance (an S.H.), ein Stipendium der Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (an F.S.), einen Seed Fund der Technischen Universität München (an S.H.) und ein Forschungsstipendium der Wilhelm Sander Stiftung (2021.041.1, an S.H.). H. P. wird durch das EMBO Young Investigator Program unterstützt.
AUTORENBEITRÄGE:
F.S., H.P. und S.H. entwarfen die Forschung, analysierten und interpretierten die Ergebnisse. F.S. und S.H. schrieben das Manuskript. H.P. und S.H. leiteten die Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
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