Summary
Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.
Abstract
La muerte celular inmunogénica de los tumores, causada por la quimioterapia o la irradiación, puede desencadenar respuestas de células T específicas del tumor al liberar patrones moleculares asociados al peligro e inducir la producción de interferón tipo I. Las inmunoterapias, incluida la inhibición del punto de control, se basan principalmente en células T preexistentes específicas del tumor para desplegar un efecto terapéutico. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos sinérgicos que explotan la muerte celular inmunogénica como una vacuna intrínseca contra el cáncer pueden mejorar su capacidad de respuesta. Sin embargo, el espectro de factores inmunogénicos liberados por las células bajo estrés inducido por la terapia sigue estando incompletamente caracterizado, especialmente con respecto a las vesículas extracelulares (EV). Se considera que los EV, partículas membranosas a nanoescala emitidas por prácticamente todas las células, facilitan la comunicación intercelular y, en el cáncer, se ha demostrado que median el cebado cruzado contra los antígenos tumorales. Para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores en diversas condiciones, se buscan métodos adaptables, escalables y válidos. Por lo tanto, aquí se presenta un enfoque relativamente fácil y robusto para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los EV. El protocolo se basa en el análisis de citometría de flujo de células T esplénicas después de la inmunización in vivo de ratones con EV, aislados por ensayos basados en precipitaciones de cultivos de células tumorales en condiciones de terapia o estado estacionario. Por ejemplo, este trabajo muestra que la exposición al oxaliplatino de las células de melanoma murino B16-OVA resultó en la liberación de EV inmunogénicos que pueden mediar la activación de las células T citotóxicas reactivas al tumor. Por lo tanto, la detección de EV a través de la inmunización in vivo y la citometría de flujo identifica las condiciones bajo las cuales pueden surgir EV inmunogénicos. La identificación de las condiciones de liberación de EV inmunogénicos proporciona un requisito previo esencial para probar la eficacia terapéutica de los EV contra el cáncer y explorar los mecanismos moleculares subyacentes para finalmente revelar nuevos conocimientos sobre el papel de los EV en la inmunología del cáncer.
Introduction
El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la lucha contra el cáncer, tanto cuando es incitado por la inhibición del punto de control inmunitario como por la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer. Las células tumorales que sucumben a terapias genotóxicas como los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y doxorrubicina, o el tratamiento con radiación ionizante pueden liberar antígenos y patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) que potencialmente inician una respuesta inmune antitumoral adaptativa1. Las DAMP más destacadas, en el contexto de la muerte celular inmunogénica, incluyen señales find-me como atp quimiotáctico, señales eat-me como la exposición a calreticulina, que promueve la absorción de células tumorales por las células presentadoras de antígenos, y la liberación de HMGB1, que activa los receptores de reconocimiento de patrones, mejorando así la presentación cruzada de antígenos tumorales2. Además, los interferones de tipo I (IFN-I), inducidos a través de ácidos nucleicos inmunogénicos derivados de tumores u otros estímulos, son detectados por las células dendríticas, lo que les permite cebar eficazmente las células T citotóxicas específicas del tumor3,4. Clínicamente, las células T CD8+ activadas y en proliferación que se infiltran en el tumor proporcionan un factor pronóstico independiente para la supervivencia prolongada en muchos pacientes con cáncer. Liberado de tales células T activadas, el IFN-γ media efectos antiproliferativos directos sobre las células cancerosas e impulsa la polarización Th1 y la diferenciación citotóxica de las células T, contribuyendo así a una inmunovigilancia efectiva contra el cáncer5,6. El oxaliplatino es un inductor de muerte celular inmunogénico de buena fe, que media dicha respuesta inmune adaptativa contra el cáncer7. Sin embargo, la plétora de señales inmunogénicas iniciales liberadas por las células tumorales bajo estrés inducido por la terapia aún no se ha revelado por completo. A pesar de los avances significativos en la inmunoterapia contra el cáncer, la expansión de sus beneficios a una mayor parte de los pacientes sigue siendo un desafío. Una comprensión más detallada de las señales inmunogénicas que inician la activación de las células T puede guiar el desarrollo de nuevas terapias.
Un grupo heterogéneo de estructuras cerradas por membrana, conocidas como vesículas extracelulares (EV), parecen servir como dispositivos de comunicación intercelular. Emitidos por prácticamente todos los tipos de células, los EV transportan proteínas funcionales, ARN, ADN y otras moléculas a una célula receptora o pueden alterar el estado funcional de una célula simplemente uniéndose a los receptores en la superficie celular. Su carga biológicamente activa varía significativamente según el tipo y el estado funcional de la célula generadora8. En inmunología del cáncer, los EV liberados de las células tumorales se han considerado predominantemente como adversarios de la inmunoterapia porque eventualmente promueven el crecimiento invasivo, preforman nichos metastásicos9 y suprimen la respuesta inmune10. Por el contrario, algunos estudios han demostrado que los EV pueden transferir antígenos tumorales a las células dendríticas para una presentación cruzada efectiva11,12. Los EV pueden proporcionar ácidos nucleicos inmunoestimulantes si emergen bajo estrés inducido por la terapia, lo que facilita una respuesta inmune antitumoral13,14. Recientemente se ha demostrado que la detección de dichos ligandos inmunes innatos de ARN y ADN en el microambiente tumoral modula significativamente la capacidad de respuesta al bloqueo del punto de control15,16,17. Por lo tanto, el papel inmunogénico de los EV liberados por las células tumorales bajo diferente estrés inducido por la terapia debe dilucidarse aún más. Dado que los vehículos eléctricos constituyen un campo de investigación joven pero en crecimiento, la estandarización de los métodos aún está en curso. Por lo tanto, compartir conocimientos es esencial para mejorar la reproducibilidad de la investigación sobre las interacciones entre los EV y la inmunología del cáncer. Con esto en mente, este manuscrito describe un protocolo simple para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores in vivo.
Esta evaluación se realiza mediante la generación de EV derivados de tumores, inmunizando a los ratones receptores con esos EV y analizando las células T esplénicas a través de la citometría de flujo. La generación de EV se realiza idealmente mediante la siembra de células tumorales murinas en un medio de cultivo celular libre de EV para un alto grado de pureza. Las células se tratan con un estímulo de estrés celular específico, como la quimioterapia, para comparar el efecto de los EV inducidos por la terapia con la inmunogenicidad basal de los respectivos EV derivados del tumor. El aislamiento de los EV bien puede realizarse mediante diversas técnicas que deben seleccionarse de acuerdo con la aplicabilidad in vivo y la disponibilidad local. El siguiente protocolo describe un ensayo basado en la precipitación con un kit comercial para la purificación de ev. Los ratones son inmunizados dos veces con esos VEHÍCULOS ELÉCTRICOS. Catorce días después de la primera inyección, las células T se extraen del bazo y se analizan para la producción de IFN-γ a través de la citometría de flujo para evaluar una respuesta inmune sistémica. Con esto, el potencial de los EV derivados de tumores, surgidos bajo diferentes regímenes terapéuticos, para inducir respuestas antitumorales de células T se evalúa con relativa facilidad, rapidez y alta validez13. Por lo tanto, este método es adecuado para una detección inmunológica de EV derivados de células cancerosas en diversas condiciones.
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Protocol
Al inicio de los experimentos, los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El presente protocolo cumple con los estándares éticos institucionales y las regulaciones locales vigentes. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los posibles sesgos relacionados con el sexo no se investigaron en estos estudios.
1. Generación y aislamiento de EV derivados de células tumorales después de la exposición a la quimioterapia
- Cultivo de células de melanoma B16 murino que expresan ovoalbúmina (B16-OVA) en DMEM (que contiene 4 mM de L-glutamina y 4,5 g/L de D-glucosa) suplementadas con FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) a 37 °C, hasta que las células crezcan de manera constante y sean aproximadamente 90% confluentes.
NOTA: Realice esta sección del protocolo completamente en condiciones estériles utilizando una campana de cultivo celular. Para el análisis de otras entidades cancerosas, las líneas celulares que expresan un antígeno potente son preferibles para evaluar las respuestas de las células T específicas del antígeno, ya que permiten la reestimulación específica de antígenos ex vivo . - Para preparar los medios de cultivo celular necesarios para la generación de EV, agote los EV bovinos dentro de FCS mediante ultracentrifugación a 100,000 x g durante 24 h a 4 ° C, y luego deseche el pellet. Alternativamente, elija una preparación comercial baja en EV de animales de antemano.
- Cosechar células B16-OVA y lavarlas dos veces en PBS, y luego sembrar a una concentración de 400,000 células / ml en medios agotados de EV.
NOTA: Adaptar la concentración celular a la dinámica de crecimiento de la línea celular bajo investigación para que las células no crezcan en exceso. - Tratar las células B16-OVA añadiendo 30 μg de oxaliplatino por ml e incubar durante 24 h a 37 °C. Deje las condiciones de control sin tratar. En el primer uso de una sustancia genotóxica, valorar la eficacia citotóxica deseada mediante ensayos de viabilidad celular como la exclusión del azul de tripano18.
NOTA: Este ensayo también puede evaluar los EV generados en cultivos celulares tratados con otras sustancias inmunomoduladoras o irradiación ionizante además de la quimioterapéutica.
PRECAUCIÓN: El oxaliplatino causa irritación cutánea y ocular severa y puede causar una reacción alérgica en la piel e irritación respiratoria. Se sospecha que el oxaliplatino causa cáncer. Como medida de precaución, use equipo de protección personal, incluidos guantes, gafas, máscaras y ropa adecuados, limpiados antes de reutilizarlos. Evite la inhalación y lávese bien las manos después de manipular. Evite la liberación en el medio ambiente y deseche el oxaliplatino de acuerdo con las regulaciones vigentes. Obtenga información detallada de la ficha de datos de seguridad. - Recolectar sobrenadante de cultivo celular. Centrifugar primero a 400 x g durante 5 min a 4 °C, y luego a 2.000 x g durante 30 min a 4 °C, cada vez desechando el pellet. Finalmente, filtre a través de una membrana de PVDF de 220 nm. Use un tubo nuevo para cada paso para eliminar cualquier residuo celular.
NOTA: En esta etapa, el sobrenadante que contiene EV puede almacenarse a 4 °C durante un día antes de reanudar el protocolo. Sin embargo, se recomienda encarecidamente cumplir con el programa descrito con la purificación inmediata de EV. - Mezcle 1 ml de sobrenadante con 0,5 ml de un reactivo de aislamiento de exosomas específico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 1,5 ml en forma de V. Pipetear bien hacia arriba y hacia abajo o vórtice para crear una solución homogénea. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Centrifugadora a 10.000 x g durante 60 min a 4 °C. Deseche cuidadosamente el sobrenadante. Retire las gotas restantes golpeando el tubo de 1,5 ml boca abajo en una toalla de papel y por aspiración a través de una pipeta con una punta fina sin tocar el EV-pellet en la parte inferior.
- Retire a fondo todos los líquidos para evitar la dilución incontrolada del EV-pellet. Además, ejecute estas tareas rápidamente para evitar que el pellet se seque.
- Resuspenda los EV en PBS frío mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo sin rayar el pellet de la pared del tubo con la punta. Ahora, transfiera la suspensión paso a paso desde el primer hasta el último tubo para agrupar los vehículos eléctricos.
NOTA: Utilice un volumen de PBS igual a 5 μL multiplicado por el número de tubos. 5 μL de la suspensión final contiene los EV aislados liberados de 400.000 células bajo quimioterapia o en estado estacionario. - Preferiblemente, use vehículos eléctricos directamente. Si esto no es posible, guarde las suspensiones EV a -80 °C en recipientes siliconados durante un máximo de 28 días hasta la aplicación.
NOTA: Los vehículos eléctricos descritos aquí y en varias otras publicaciones no pierden su función biológica respectiva cuando se almacenan a -80 °C para ese período de tiempo19. - Cuantificar y caracterizar aislados de EV de acuerdo con las directrices MISEV201820.
NOTA: Los posibles métodos de cuantificación incluyen el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)21 y la detección de proteínas unidas a la membrana de EV22. Los posibles enfoques para caracterizar aún más los EV incluyen la microscopía electrónica23 y western blot20.
2. Inmunización de ratones con EV
- Planifique el experimento in vivo con ratones C57BL/6 (u otros ratones singénicos correspondientes a la línea celular tumoral), incluidos los grupos de tratamiento que reciben EV derivados de células tratadas, células no tratadas y PBS (vehículo), respectivamente.
NOTA: Preferiblemente, utilizar ratones a la edad de 6-8 semanas para evitar que la senescencia fisiológica disminuya la respuesta inmune24. - Mezclar 5 μL de suspensión EV con PBS frío de 55 μL para cada ratón dentro del grupo de tratamiento respectivo para inmunizarlo con EV aislados de 4,0 x 105 células B16-OVA.
NOTA: Esta cantidad de EV corresponde a aproximadamente 2 x 109 partículas medidas por análisis de seguimiento de nanopartículas (datos no mostrados). La proteína OVA mezclada con un adyuvante (por ejemplo, LPS) se puede aplicar como un potente control positivo de la vacuna.- Llene las jeringas (tamaño de la aguja 26-30 G) con 60 μL de los EV diluidos o PBS, respectivamente y colóquelas inmediatamente en hielo.
NOTA: En el protocolo, la cantidad de EV inyectados se normaliza al número de células tumorales liberadoras de EV para considerar experimentalmente los efectos cualitativos y cuantitativos del oxaliplatino en la biogénesis EV de células tumorales. Para algunos lectores, la normalización a una concentración específica de vehículos eléctricos producidos puede ajustarse mejor a su configuración experimental dependiendo de su pregunta científica.
- Llene las jeringas (tamaño de la aguja 26-30 G) con 60 μL de los EV diluidos o PBS, respectivamente y colóquelas inmediatamente en hielo.
- Inocular EV o PBS por vía subcutánea en el aspecto medial del muslo de los ratones y repetir la inmunización después de 7 días. Catorce días después del primer tratamiento, sacrifique ratones, por ejemplo, por dislocación cervical para analizar la respuesta inmune.
NOTA: Se pueden utilizar vías alternativas de inyección subcutánea, de acuerdo con los estándares locales.
3. Análisis de citometría de flujo de células T esplénicas
- Preparar y enfriar RPMI completo (cRPMI), suplementando RPMI-1640 con FCS (10% v/v), penicilina (100 Unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (2 mM) y β-mercaptoetanol (50 μM).
- Reseque el bazo de la cavidad abdominal abierta. Triture el bazo con un colador de células de 100 μm humedecido y el émbolo de plástico de una jeringa y enjuague las células esplénicas en un tubo de 50 ml con 5-10 ml de cRPMI. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
NOTA: Mantenga las celdas en hielo siempre que sea posible. Para analizar la respuesta inmune local en lugar de la esplénica, reseque los ganglios linfáticos poplíteos e inguinales drenantes, siguiendo el mismo protocolo. En este caso, omita el siguiente paso para la lisis de los eritrocitos. - Para eliminar los eritrocitos de la suspensión celular, vuelva a suspender el gránulo con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, detenga la reacción agregando cRPMI. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Para la siembra, resuspender el pellet celular en cRPMI y contar las células para colocar triplicados de 200,000 células con 200 μL cRPMI en cada pozo, utilizando una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de U. Incubar durante 48 h a 37 °C.
NOTA: Para abordar la especificidad del antígeno de las células T activadas, agregue 1 μg / ml de ovoalbúmina soluble (u otro antígeno tumoral correspondiente a la línea celular bajo investigación) o déjelo sin estímulo adicional, respectivamente. La adición del epítopo peptídico inmunodominante SIINFEKL, en lugar de la ovoalbúmina de longitud completa, permite un período de incubación más corto. Además de la citometría de flujo, el suero de los ratones y el sobrenadante de cultivo celular después de 48 h de incubación se pueden analizar en busca de varias citoquinas. - Después de 48 h, para mejorar la tinción intracelular de IFN-γ mediante, entre otras cosas, el bloqueo de la secreción de proteínas mediada por Golgi, agregue Brefeldin A (5 ng / mL), PMA (20 ng / mL) e Ionomicina (1 μg / mL) al cultivo celular. Incubar durante 4 h a 37 °C.
- Antes de teñir los biomarcadores de la superficie, transfiera los esplenocitos a una placa de 96 pocillos con un fondo en forma de V y lávese dos veces con PBS. Luego, agregue anticuerpos fluorescentes, compatibles con el citómetro de flujo disponible localmente, dirigidos contra biomarcadores de superficie, CD3, CD8 y CD4 (ver Tabla de Materiales), diluidos 1:400, más un colorante de viabilidad fijable, diluido 1:1,000 en PBS. Resuspend los esplenocitos granulados en la solución de tinción e incubar durante 30 min a 4 °C, protegidos de la luz.
- Para la fijación y permeabilización de los esplenocitos, lavar dos veces en tampón FACS (PBS más 3% v/v FCS), y luego resuspend en 100 μL de tampón de fijación/permeabilización (ver Tabla de Materiales) por pozo. Incubar durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.
- Para la tinción de IFN-γ intracelular, lave los esplenocitos en el tampón de fijación/permeabilización y resuspenda con anticuerpos fluorescentes contra ifN-γ, diluidos 1:200 en el tampón. Incubar durante al menos 1 h (hasta un máximo de 12 h) a 4 °C, protegido de la luz.
- Antes de medir las muestras por citometría de flujo, lave los esplenocitos dos veces en el tampón de fijación/permeabilización y resuspenda en el tampón FACS. Analizar la activación de las células T citotóxicas de acuerdo con la estrategia de cierre mostrada en la Figura 2.
- Primero, para detectar células individuales, seque FSC-H contra FSC-A. Luego, para detectar células linfoides, seque SSC contra FSC-A. Posteriormente, seleccione células CD3+, CD4-, CD8+ vivas y determine su subconjunto productor de IFN-γ para cuantificar la activación de células T citotóxicas en el bazo.
NOTA: Incluya una tinción de fluorescencia menos uno (FMO) con todos los fluorocromos excepto el fluorocromo dirigido contra IFN-γ como control técnico negativo.
- Primero, para detectar células individuales, seque FSC-H contra FSC-A. Luego, para detectar células linfoides, seque SSC contra FSC-A. Posteriormente, seleccione células CD3+, CD4-, CD8+ vivas y determine su subconjunto productor de IFN-γ para cuantificar la activación de células T citotóxicas en el bazo.
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Representative Results
Este protocolo está destinado a facilitar la evaluación directa y fácilmente reproducible de la inmunogenicidad de los EV derivados de tumores. De este modo, los ratones son inoculados con EV derivados de cultivos in vitro de células tumorales que expresan el antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA). La respuesta inmune posterior se analiza en células T esplénicas a través de citometría de flujo.
La Figura 1 ofrece una visión general de los pasos prácticos de todo el protocolo. Dado que el trabajo se centra en la muerte celular inmunogénica, la presentación cruzada y la inmunidad antitumoral inducida por EV, este protocolo se limita a la función de las células T citotóxicas CD8 +. Como se muestra en la Figura 2, las células fueron cerradas como células individuales, subconjunto de linfocitos (por tamaño y granularidad), células viables (excluyendo un marcador de vida / muerte) y células T citotóxicas CD3 + CD4- CD8 + . La acumulación intracelular de IFN-γ se evaluó como un marcador sustituto para la activación. A continuación se analizan los posibles marcadores adicionales con respecto a la diferenciación y el agotamiento de las células T.
Usando el método descrito aquí, los ratones fueron inmunizados con EV derivados de células tumorales que expresan OVA cultivadas en estado estacionario (no tratadas) o en condiciones de estrés genotóxico (tratadas con oxaliplatino). Solo los ratones inyectados con EV derivados de células tumorales en condiciones de estrés genotóxico indujeron una potente activación de células T citotóxicas esplénicas en animales receptores (Figura 3A). La inyección de EV derivados de tumores en condiciones de estado estacionario resultó en cierta activación de células T, pero eso no fue significativamente diferente de la activación de células T en ratones inyectados con el vehículo PBS. Estos datos muestran que bajo estrés genotóxico, las células tumorales pueden liberar vehículos eléctricos potentemente inmunogénicos. La producción de IFN-γ aumentó particularmente cuando los esplenocitos de animales tratados con EV tumoral se reestimularon ex vivo con el OVA del antígeno tumoral modelo antes del análisis (Figura 3B). Estos datos sugieren que los EV derivados de tumores pueden inducir respuestas inmunes específicas de antígenos tumorales. Curiosamente, la producción de IFN-γ, aunque en mucha menor medida, también se detecta en ausencia de reestimulación específica del antígeno. Posiblemente, otros antígenos asociados al melanoma, como el antígeno de diferenciación TRP225, pueden ser el objetivo de alguna parte de la respuesta de las células T inducidas por EV.
Figura 1: Visión pictográfica del protocolo. (A) Procedimiento de aislamiento de EV generados en cultivos de células tumorales que se asemejan a la quimioterapia. (B) Calendario para la inmunización de ratones con EV. (C) Protocolo de tinción para el análisis de citometría de flujo de linfocitos T citotóxicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de cierre de citometría de flujo para analizar la activación de células T citotóxicas en el bazo. Los números representan el porcentaje de su respectiva población matriz. FSC-A: área de dispersión hacia adelante; FSC-H: altura de dispersión hacia adelante; SSC: dispersión lateral; vivo/muerto: marcador de muerte celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los EV derivados de células tumorales bajo estrés genotóxico pueden inducir respuestas de células T específicas de antígenos en animales receptores. (A) Los ratones fueron inmunizados con EV derivados de células tumorales cultivadas en estado estacionario (no tratado) o en condiciones de estrés genotóxico (tratadas con oxaliplatino). Las inyecciones en vehículos (PBS) se utilizaron como control negativo. Se determinó la producción de IFN-γ por las células T citotóxicas en el bazo tras la inmunización contra la EV. Con esto, las suspensiones de células esplénicas se reestimularon con ovoalbúmina ex vivo antes del análisis. (B) Los ratones fueron tratados con EV derivados de células tumorales en condiciones de estrés genotóxico como se describió anteriormente. La activación de las células T esplénicas se determinó después de la reestimulación ex vivo , ya sea en presencia o ausencia de ovoalbúmina. Las barras representan la media por grupo y los bigotes su error estándar. La prueba de análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba posterior a Bonferroni se utilizó para múltiples comparaciones estadísticas de un conjunto de datos. El nivel de significancia se estableció en P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001 y se indica aquí con asteriscos (*, ** y ***). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona una evaluación inmunológica in vivo de los EV derivados de células de melanoma bajo estrés inducido por la quimioterapia mientras se adapta a los EV emitidos por varios cánceres bajo diversos tratamientos. La inmunización de ratones con EV derivados de células B16-OVA tratadas con oxaliplatino, por ejemplo, expande las células T CD8 + productoras de IFN-γ en el bazo, que se estimulan aún más mediante la incubación ex vivo con ovoalbúmina, lo que indica una respuesta inmune específica del tumor. Por lo tanto, la detección de EV inmunogénicos mediante la detección a través de este protocolo facilita una comprensión más completa de las terapias convencionales contra el cáncer y permite una investigación centrada en el papel de los EV en la inmunología del cáncer.
Cabe destacar que los experimentos con vehículos eléctricos requieren algunas consideraciones especiales. En este protocolo, los EV se normalizan semicuantitativamente al número de células tumorales liberadas dentro de las 24 h. Este enfoque refleja el objetivo de identificar la inmunogenicidad mejorada, independientemente de si surge de alteraciones en la calidad o cantidad de EV liberados. Por lo tanto, los resultados reproducibles in vivo se basan en la eficacia de aislamiento constante de los vehículos eléctricos. Con este fin, garantizar que los gránulos EV se resuspendan por completo y con prontitud para evitar la desecación es un paso crítico.
Además, los EV deben cuantificarse y caracterizarse, por ejemplo, mediante análisis de seguimiento de nanopartículas y western blot de transmembrana canónica, luminal y al menos un marcador EV negativo20. La cuantificación y caracterización de los EV controla el aislamiento inconstante y aborda las diferencias cuantitativas en los EV o subconjuntos de EV. Este tipo de caracterización ev constituye una parte de la información mínima que debe informarse en estudios sobre vesículas extracelulares, de acuerdo con las pautas de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV). Sin embargo, varios métodos de caracterización son igualmente legítimos y deben seleccionarse en relación con la disponibilidad local y la pregunta de investigación individual. En particular, definir la dosis de una sustancia de interés o la irradiación ionizante constituye otro paso crítico del protocolo, que puede requerir una validación experimental para lograr un nivel adecuado de muerte celular.
En general, se debe considerar la posible contaminación de evs aislados con la sustancia de tratamiento, proteínas solubles y lipoproteínas. Una estrategia en este sentido consiste en reproducir el experimento con técnicas complementarias de aislamiento de EV que el mismo tipo de contaminación20 puede no comprometer. Immunoaffinity, por ejemplo, aísla los VEHÍCULOS eléctricos con un rendimiento más bajo pero una especificidad mayor que los métodos puramente basados en la precipitación y puede proporcionar un control adecuado a este respecto26. Un enfoque alternativo es comparar los EV derivados de células silvestres con aislamientos de células genéticamente modificadas con una deleción específica de genes involucrados en la biogénesis EV o desplegar sustancias que reduzcan la emisión de EV20.
Los resultados obtenidos de este protocolo deben complementarse con una caracterización más completa de la respuesta inmune mediada por EV. Especialmente la clasificación de las células T CD8 + en células de memoria efectoras y efectoras, a través de CD4427, así como las células de memoria centrales y sin antígenos, a través de CD62L28, pueden transmitir una visión más profunda. Además, el análisis de células T auxiliares, células T reguladoras y células NK puede ser de interés. Para probar la eficacia antitumoral de los EV, los ratones pueden ser desafiados con las células cancerosas correspondientes después de recibir la inmunización EV o tratados con EV contra un cáncer preestablecido, adaptando así las pautas para la detección de la muerte celular inmunogénica2,29 a este derivado tumoral libre de células. Sin embargo, las conclusiones de todas estas configuraciones experimentales están limitadas por el hecho de que las células cancerosas en una placa de Petri potencialmente generan EV funcionalmente diferentes a las células cancerosas incrustadas en un microambiente tumoral dinámico30 que a menudo suprime la inmunidad contra el cáncer. Por lo tanto, la evaluación de los EV derivados de cocultivos de tumores /fibroblastos o tejido tumoral ex vivo puede reflejar mejor la situación real. En un próximo paso traslacional hacia la realidad clínica, los EV del material del paciente pueden analizarse para detectar inmunogenicidad antes y durante la terapia para evaluar su usabilidad como biomarcadores.
Dado que recientemente se descubrió que los EV derivados del cáncer modulan el sistema inmunitario, bajo ciertas circunstancias, el viaje de exploración de su potencial clínico no ha hecho más que empezar31. Para un análisis en profundidad de los mecanismos inmunes cooptados por los EV inmunogénicos, las herramientas útiles incluyen la microscopía de fluorescencia que visualiza la absorción de EV por células específicas, el despliegue de ratones con deficiencias genéticas para vías inmunes específicas y métodos de detección de alteraciones moleculares en el contenido de EV. En última instancia, la identificación de EV inmunogénicos derivados de tumores, con los métodos de detección descritos en este documento, permitirá una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes detrás de la inmunidad mediada por EV y, por lo tanto, constituye un paso crucial para aprovechar su potencial contra el cáncer.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 y Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (a H.P.), una beca de investigación Mechtild Harf de la Fundación DKMS para Dar Vida (a H.P.) un Premio al Joven Investigador por la Alianza de Investigación del Melanoma (a S.H.), una beca de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (a F.S.), un Fondo Semilla de la Universidad Técnica de Munich (a S.H.) y una beca de investigación de la Fundación Wilhelm Sander (2021.041.1, a S.H.). H. P. cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Investigadores de EMBO.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:
F.S., H.P. y S.H. diseñaron la investigación, analizaron e interpretaron los resultados. F.S. y S.H. escribieron el manuscrito. H.P. y S.H. guiaron el estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
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