Summary
Detta manuskript beskriver hur man bedömer in vivo immunogenicity av tumör cell-härledda extracellulära blåsor (EVs) med hjälp av flöde cytometri. EVs härrör från tumörer som genomgår behandling-inducerad immunogenic cell död verkar särskilt relevant i tumör immunosurveillance. Detta protokoll exemplifierar bedömningen av oxaliplatin-inducerad immunostimulatory tumör EVs men kan anpassas till olika inställningar.
Abstract
Immunogenic cell död av tumörer, orsakas av kemoterapi eller bestrålning, kan utlösa tumör-specifika T-cells svar genom att släppa fara-associerade molekylära mönster och inducera produktionen av typ I interferon. Immunterapier, inklusive checkpoint hämning, förlitar sig främst på befintliga tumörspecifika T-celler för att utveckla en terapeutisk effekt. Således kan synergistiska terapeutiska metoder som utnyttjar immunogen celldöd som ett inneboende anti-cancervaccin förbättra deras lyhördhet. Spektrumet av immunogenic faktorer som frigörs av celler under terapi-inducerad stress är dock fortfarande ofullständigt karakteriseras, särskilt när det gäller extracellulära blåsor (EVs). EVs, membranösa partiklar i nanoskala som släpps ut från praktiskt taget alla celler, anses underlätta intercellulär kommunikation och har vid cancer visat sig medla tvärprimering mot tumörantigener. För att bedöma den immunogenic effekten av EVs härrör från tumörer under olika förhållanden, är anpassningsbara, skalbara och giltiga metoder söks. Därför presenteras häri ett relativt enkelt och robust tillvägagångssätt för att bedöma EVs in vivo immunogenicitet. Protokollet är baserat på flödescytometrianalys av mjälte-T-celler efter in vivo-immunisering av möss med EVs, isolerade av nederbördsbaserade analyser från tumörcellskulturer under terapi eller steady-state-tillstånd. Till exempel visar detta arbete att oxaliplatin exponering av B16-OVA murine melanom celler resulterade i frisättning av immunogenic EVs som kan medla aktiveringen av tumör-reaktiva cytotoxiska T-celler. Därför identifierar screening av EVs via in vivo immunisering och flöde cytometri villkor under vilka immunogenic EVs kan dyka upp. Att identifiera villkor för immunogenic EV-frisättning ger en viktig förutsättning för att testa EVs terapeutiska effekt mot cancer och utforska de underliggande molekylära mekanismerna för att i slutändan avslöja nya insikter om EVs roll i cancerimmunologi.
Introduction
Immunsystemet spelar en central roll i kampen mot cancer, både när det uppviglats av immunkontrollhämning och för effekten av konventionella cancerbehandlingar. Tumörceller som dukar under för genotoxiska terapier som kemoterapeutiska medel oxaliplatin och doxorubicin, eller joniserande strålbehandling kan frigöra antigener och fara-associerade molekylära mönster (DAMPs) som potentiellt initierar ett adaptivt anti-tumör immunsvar1. De mest framträdande DAMPs, i samband med immunogenic celldöd, inkluderar find-me signaler såsom chemotactic ATP, eat-me signaler såsom exponering av calreticulin, som främjar tumör cellupptag av antigen-presenterar celler, och frisättningen av HMGB1, som aktiverar mönsterigenkänningsreceptorer, vilket förbättrar korspresentationen av tumör antigener2. Dessutom känns typ I-interferoner (IFN-I), inducerade via tumör-härledda immunogenic nukleinsyror eller andra stimuli, av dendritiska celler, vilket gör det möjligt för dem att effektivt prime tumör-specifika cytotoxiska T-celler3,4. Kliniskt, aktiverade och prolifererande CD8 + T celler infiltrera tumör ger en oberoende prognostisk faktor för långvarig överlevnad hos många cancerpatienter. IFN-γ frigörs från sådana aktiverade T-celler och förmedlar direkta antiproliferativa effekter på cancerceller och driver Th1 polarisering och cytotoxisk T-cellsdifferentiering, vilket bidrar till effektiv immunosurveillance mot cancer5,6. Oxaliplatin är en äkta immunogen celldödsinducerare, som förmedlar ett sådant adaptivt immunsvar mot cancer7. Den mängd initiala immunogenic signaler som släppts av tumörceller under terapi-inducerad stress återstår dock att vara helt avtäckt. Trots betydande framsteg inom cancerimmunterapi är det fortfarande en utmaning att utöka sina fördelar till en större del av patienterna. En mer detaljerad förståelse av immunogenic signaler som initierar T-cells aktivering kan vägleda utvecklingen av nya terapier.
En heterogen grupp av membran-slutna strukturer, känd som extracellulära blåsor (EVs), verkar fungera som intercellulära kommunikationsanordningar. EVs avges av praktiskt taget alla celltyper och bär funktionella proteiner, RNA, DNA och andra molekyler till en mottagarcell eller kan ändra en cells funktionella tillstånd bara genom att binda till receptorer på cellytan. Deras biologiskt aktiva last varierar avsevärt beroende på typ och funktionstillstånd hos den genererande cellen8. I cancerimmunologi har EVs som släppts ut från tumörceller främst betraktats som adversarial till immunterapi eftersom de så småningom främjar invasiv tillväxt, preform metastaserade nischer9 och undertrycka immunsvaret10. Däremot har vissa studier visat att EVs kan överföra tumör antigener till dendritiska celler för effektiv korspresentation11,12. EVs kan ge immunostimulatoriska nukleinsyror om de dyker upp under terapiinducerad stress, vilket underlättar ett immunsvar mot tumör13,14. Avkänning av sådana RNA och DNA medfödda immunligander i tumör mikromiljön har nyligen visat sig modulera lyhördhet för kontrollpunkt blockad betydligt15,16,17. Därför måste den immunogenic rollen av EVs släppta av tumörceller under olika terapi-inducerad stress förklaras ytterligare. Eftersom elfordon utgör ett ungt men växande forskningsområde pågår fortfarande standardisering av metoder. Därför är kunskapsutbyte avgörande för att förbättra forskningens reproducerbarhet vid interaktioner mellan EVs och cancerimmunologi. Med detta i åtanke beskriver detta manuskript ett enkelt protokoll för att bedöma den immunogenic effekten av tumör-härledda EVs in vivo.
Denna bedömning utförs genom att generera tumör-härledda EVs, immunisera mottagarmöss med dessa EVs och analysera splenic T-celler via flöde cytometry. EV-generationen utförs idealiskt genom sådd av murin tumörceller i ett EV-fritt cellkulturmedium för en hög renhetsgrad. Celler behandlas med en specifik cellstressstimulans, såsom kemoterapi, för att jämföra effekten av terapiinducerade EVs mot immungenitet vid respektive tumör-härledda EVs. Isoleringen av elfordon kan mycket väl utföras med olika tekniker som bör väljas efter in vivo-tillämplighet och lokal tillgänglighet. Följande protokoll beskriver en nederbördsbaserad analys med ett kommersiellt kit för EV-rening. Möss immuniseras två gånger med dessa EVs. Fjorton dagar efter den första injektionen extraheras T-celler från mjälten och analyseras för IFN-γ produktion via flödescytometri för att utvärdera ett systemiskt immunsvar. Med detta bedöms potentialen hos tumör-härledda EVs, som dyker upp under olika terapeutiska regimer, att inducera anti-tumor T-cells svar relativt enkelt, snabbt och med hög giltighet13. Därför är denna metod lämplig för en immunologisk screening av EVs som härrör från cancerceller under olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vid början av experiment var möss minst 6 veckors ålder och bibehölls under specifika patogenfria förhållanden. Detta protokoll överensstämmer med de institutionella etiska normerna och gällande lokala bestämmelser. Djurstudier godkändes av den lokala tillsynsmyndigheten (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Eventuella könsrelaterade fördomar undersöktes inte i dessa studier.
1. Generering och isolering av EL som härrör från tumörceller efter kemoterapiexponering
- Kultur murin B16 melanom celler uttrycker ovalbumin (B16-OVA) i DMEM (innehållande 4 mM L-glutamin och 4,5 g/L D-glukos) kompletteras med FCS (10% v/v), penicillin (100 enheter/ml) och streptomycin (100 μg/mL) vid 37 °C, tills cellerna växer stadigt och är cirka 90% confluent.
OBS: Utför denna del av protokollet helt under sterila förhållanden med hjälp av en cellodlingshuv. För analys av andra cancerenheter är cellinjer som uttrycker ett potent antigen att föredra för att bedöma antigenspecifika T-cellssvar, eftersom de möjliggör specifik ex vivo-antigenrestimulering. - För att förbereda de cellodlingsmedier som krävs för EV-generering, utarma nötkreatur EVs inom FCS genom ultracentrifugation vid 100 000 x g för 24 h vid 4 °C och kassera sedan pelleten. Alternativt kan du välja ett kommersiellt preparat med låg i djur-EVs i förväg.
- Skörda B16-OVA-celler och tvätta dem två gånger i PBS, och sedan frö i en koncentration av 400 000 celler/ml i EV-uttömda medier.
OBS: Anpassa cellkoncentrationen till tillväxtdynamiken hos den celllinje som undersöks så att cellerna inte överväxt. - Behandla B16-OVA-celler genom att tillsätta 30 μg oxaliplatin per ml och inkubera i 24 timmar vid 37 °C. Lämna kontrollförhållandena obehandlade. Vid den första användningen av ett genotoxiskt ämne titrera önskad cytotoxisk effekt med hjälp av cellviabilitetsanalyser såsom trypanblå uteslutning18.
OBS: Denna analys kan också utvärdera EVs som genereras i cellkulturer som behandlats med andra immunmodulerande ämnen eller joniserande bestrålning förutom kemoterapeutiska.
VARNING: Oxaliplatin orsakar hud- och allvarlig ögonirritation och kan orsaka allergisk hudreaktion och irritation i luftvägarna. Oxaliplatin misstänks orsaka cancer. Som en försiktighetsåtgärd bör du använda personlig skyddsutrustning, inklusive lämpliga handskar, skyddsglasögon, masker och kläder, som rengörs före återanvändning. Undvik inandning och tvätta händerna noggrant efter hantering. Undvik att släppas ut i miljön och kassera oxaliplatin enligt gällande regler. Få detaljerad information från säkerhetsdatabladet. - Samla cellkultur supernatant. Centrifugera först vid 400 x g i 5 min vid 4 °C, och sedan vid 2 000 x g i 30 min vid 4 °C, varje gång kassera pelleten. Filtrera slutligen genom ett 220 nm PVDF-membran. Använd ett nytt rör för varje steg för att ta bort eventuella cellrester.
OBS: I detta skede kan det EV-innehållande supernatanten förvaras vid 4 °C i en dag innan protokollet återupptas. Det rekommenderas dock starkt att följa det beskrivna schemat med omedelbar EV-rening. - Blanda 1 ml supernatant med 0,5 ml av ett specifikt kommersiellt tillgängligt exosomisoleringsreagens (se Materialtabell) i ett V-format 1,5 ml-rör. Rör dig noggrant upp och ner eller virvel för att skapa en homogen lösning. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Centrifug vid 10 000 x g i 60 min vid 4 °C. Kassera försiktigt supernatanten. Ta bort de återstående dropparna genom att knacka på 1,5 ml-röret upp och ner på en pappershandduk och genom att aspirera genom en pipett med en fin spets utan att röra EV-pelleten längst ner.
- Avlägsna noggrant alla vätskor för att förhindra okontrollerad utspädning av EV-pelleten. Utför också dessa uppgifter snabbt för att förhindra att pelleten torkar ut.
- Återanvänd elfordonen i kall PBS genom att pipettera upp och ner utan att repa pelleten från rörets vägg med spetsen. Överför nu fjädringen steg för steg från det första till det sista röret för att slå samman ELBILARna.
OBS: Använd en volym PBS som motsvarar 5 μL multiplicerat med antalet rör. 5 μL av den slutliga suspensionen innehåller de isolerade EL som frigörs från 400 000 celler under kemoterapi eller i stabilt tillstånd. - Använd helst elbilar direkt. Om detta inte är möjligt, förvara EV-suspensioner vid -80 °C i silikoniserade kärl i upp till 28 dagar fram till applicering.
OBS: De EL-fordon som beskrivs här och i flera andra publikationer förlorar inte sin respektive biologiska funktion när de lagras vid -80 °C för den tidsperioden19. - Kvantifiera och karakterisera EV-isolat enligt RIKTLINJERNA FÖR MISEV20182020.
OBS: Möjliga kvantifieringsmetoder inkluderar nanopartikelspårningsanalys (NTA)21 och detektion av EV:s membranbundna proteiner22. Möjliga metoder för att ytterligare karakterisera EVs inkluderar elektronmikroskopi23 och västra blot20.
2. Immunisering av möss med EVs
- Planera in vivo-experimentet med C57BL/6-möss (eller andra syngeneska möss som motsvarar tumörcelllinjen), inklusive behandlingsgrupper som får EVs som härrör från behandlade celler, obehandlade celler respektive PBS (fordon).
OBS: Använd helst möss i åldern 6-8 veckor för att förhindra att fysiologisk senescens minskar immunsvaret24. - Blanda 5 μL EV-suspension med 55 μL kall PBS för varje mus inom respektive behandlingsgrupp för att immunisera den med EVs isolerade från 4,0 x 105 B16-OVA-celler.
OBS: Denna mängd EL motsvarar cirka 2 x 109 partiklar mätt genom nanopartikelspårningsanalys (data visas inte). OVA-protein blandat med adjuvans (t.ex. LPS) kan appliceras som en potent vaccinpositiv kontroll.- Fyll sprutorna (nålstorlek 26-30 G) med 60 μL av de utspädda EL-fordonen respektive PBS och lägg omedelbart på is.
OBS: I protokollet normaliseras mängden injicerade EVs till antalet EV-frigörande tumörceller för att experimentellt överväga både kvalitativa och kvantitativa effekter av oxaliplatin på tumör cell EV biogenes. För vissa läsare kan normalisering till en specifik koncentration av producerade EVs bättre passa deras experimentella inställning beroende på deras vetenskapliga fråga.
- Fyll sprutorna (nålstorlek 26-30 G) med 60 μL av de utspädda EL-fordonen respektive PBS och lägg omedelbart på is.
- Inokulera EVs eller PBS subkutant i den mediala aspekten av mössens lår och upprepa immuniseringen efter 7 dagar. Fjorton dagar efter den första behandlingen offra möss, t.ex. genom livmoderhalscancer förskjutning för att analysera immunsvaret.
OBS: Alternativa subkutana injektionsvägar får användas i enlighet med lokala standarder.
3. Flödescytometrianalys av mjälte T-celler
- Förbered och kyl komplett RPMI (cRPMI), komplettera RPMI-1640 med FCS (10% v/v), penicillin (100 enheter/ml), streptomycin (100 μg/mL), L-glutamin (2 mM) och β-mercaptoethanol (50 μM).
- Omförslut mjälten från den öppnade bukhålan. Mosa mjälten med en fuktad 100 μm cellsil och plastkolven på en spruta och spola de mjältecellerna i ett 50 ml-rör med 5-10 ml cRPMI. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
OBS: Förvara cellerna på is när det är möjligt. För att analysera det lokala snarare än det mjälte immunsvaret, omslut de dränerande popliteal och inguinallymfknutor lymfkörtlar, enligt samma protokoll. I det här fallet hoppar du över nästa steg för lysen av erytrocyter. - För att avlägsna erytrocyter från cellupphängningen, återanvänd pelleten med 2 ml röd blodcelllysbuffert (se Materialtabell) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Stoppa sedan reaktionen genom att lägga till cRPMI. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- För sådd, återanvänd cellpelleten i cRPMI och räkna cellerna så att de placerar tre exemplar av 200 000 celler med 200 μL cRPMI i varje brunn, med hjälp av en 96-välplatta med en U-formad botten. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C.
OBS: För att ta itu med antigen-specificiteten hos aktiverade T-celler, tillsätt 1 μg/ml löslig ovalbumin (eller ett annat tumörantigen som motsvarar den undersökta cellinjen) eller lämna utan ytterligare stimulans. Att tillsätta den immundominerande peptidetopen SIINFEKL, istället för ovalbumin i full längd, möjliggör en kortare inkubationstid. Förutom flödescytometri kan mössens serum och cellodlingsvinnatanten efter 48 timmar inkubation analyseras för olika cytokiner. - Efter 48 h, för att förbättra intracellulära IFN-γ färgning genom att bland annat blockera Golgi-medierad utsöndring av proteiner, tillsätt Brefeldin A (5 ng/mL), PMA (20 ng/mL) och Ionomycin (1 μg/mL) till cellkulturen. Inkubera i 4 timmar vid 37 °C.
- Innan du färgar ytbiomarkörer, överför praktocyter till en 96-välplatta med en V-formad botten och tvätta två gånger med PBS. Tillsätt sedan fluorescerande antikroppar, kompatibla med den lokalt tillgängliga flödescytometern, riktad mot ytbiomarkörer, CD3, CD8 och CD4 (se Tabell över material), utspädda 1:400, plus ett fixerbart bärkraftsfärg, utspädd 1:1 000 i PBS. Återsuspend pelleterade splenocyter i färgningslösningen och inkubera i 30 min vid 4 °C, skyddade mot ljus.
- För fixering och permeabilisering av splenocyter, tvätta två gånger i FACS-buffert (PBS plus 3% v/v FCS) och sedan återanvända i 100 μL fixering/permeabiliseringsbuffert (se Tabell över material) per brunn. Inkubera i 30 min vid 4 °C, skyddad mot ljus.
- För färgning av intracellulära IFN-γ, tvätta praktocyter i fixerings-/permeabiliseringsbuffert och återsuspend med fluorescerande antikroppar mot IFN-γ, utspädda 1:200 i bufferten. Inkubera i minst 1 h (upp till högst 12 timmar) vid 4 °C, skyddad mot ljus.
- Innan du mäter proverna efter flödescytometri, tvätta splenocyter två gånger i fixerings-/permeabiliseringsbuffert och återutnyttjas i FACS-buffert. Analysera aktiveringen av cytotoxiska T-celler enligt den gatingstrategi som visas i figur 2.
- För det första, för att upptäcka enstaka celler, blot FSC-H mot FSC-A. Sedan, för att upptäcka lymfoida celler, blot SSC mot FSC-A. Välj därefter levande CD3+, CD4-, CD8+ -celler och bestämma deras IFN-γ-producerande delmängd för att kvantifiera aktiveringen av cytotoxiska T-celler i mjälten.
OBS: Inkludera en fluorescens-minus-en (FMO) fläck med alla fluorokromer utom fluorokromen riktad mot IFN-γ som negativ teknisk kontroll.
- För det första, för att upptäcka enstaka celler, blot FSC-H mot FSC-A. Sedan, för att upptäcka lymfoida celler, blot SSC mot FSC-A. Välj därefter levande CD3+, CD4-, CD8+ -celler och bestämma deras IFN-γ-producerande delmängd för att kvantifiera aktiveringen av cytotoxiska T-celler i mjälten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll är avsett att underlätta enkel och lätt reproducerbar bedömning av immunogenicity av tumör-härledda EVs. Därmed inokuleras möss med EVs som härrör från in vitro-kulturer av tumörceller som uttrycker modellen antigen kyckling ovalbumin (OVA). Det efterföljande immunsvaret analyseras i mjälte T-celler via flödescytometri.
Figur 1 ger en översikt över de praktiska stegen i hela protokollet. Eftersom arbetet fokuserar på immunogenic celldöd, korspresentation och EV-inducerad antitumör immunitet, är detta protokoll begränsat till funktionen av CD8 + cytotoxiska T-celler. Som visas i figur 2, celler gated som enstaka celler, lymfocyt delmängd (efter storlek och granularitet), livskraftiga celler (exklusive en liv/död markör) och CD3 + CD4- CD8 + cytotoxiska T-celler. Intracellulär ackumulering av IFN-γ bedömdes som en surrogatmarkör för aktivering. Möjliga ytterligare markörer avseende T-cells differentiering och utmattning diskuteras nedan.
Med hjälp av den metod som beskrivs här immuniserades möss med EVs som härrör från OVA-uttryckande tumörceller odlade antingen under steady-state (obehandlade) eller genotoxiska stressförhållanden (oxaliplatinbehandlade). Endast möss som injicerats med EVs som härrör från tumörceller under genotoxiska stressförhållanden inducerade potent aktivering av mjältecyttoxiska T-celler hos mottagardjur (figur 3A). Injektion av EVs härrör från tumörer under steady-state villkor resulterade i vissa T-cells aktivering, men det var inte signifikant annorlunda än T-cells aktivering hos möss injiceras med PBS fordon. Dessa data visar att under genotoxisk stress, tumörceller kan släppa potent immunogenic EVs. Produktionen av IFN-γ ökade särskilt när praktocyter av tumör EV-behandlade djur var ex vivo restimulerade med modellen tumör antigen OVA före analys (figur 3B). Dessa data tyder på att tumör-härledda EVs kan inducera tumör antigen-specifika immunsvar. Intressant nog upptäcks också IFN-γ-produktion - även om den i mycket mindre utsträckning - inte har någon antigenspecifik restimulering. Eventuellt kan andra melanomassocierade antigener, såsom differentieringsantigent TRP225, vara måltavlor för någon del av det EV-inducerade T-cellssvaret.
Figur 1: Piktografisk översikt över protokollet. (A) Isolering förfarandet för EVs genereras i tumör cell kulturer som liknar kemoterapi. B) Schema för immunisering av möss med EVs. C) Färgningsprotokoll för flödescytometrianalys av cytotoxiska T-celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Flödescytometri gating strategi för att analysera cytotoxisk T-cell aktivering i mjälten. Siffrorna representerar procentandelen av respektive överordnad befolkning. FSC-A: spridningsområde framåt; FSC-H: framåtriktad spridningshöjd; SSC: sidåtriktad spridning; levande/död: celldödsmarkör. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: EVs som härrör från tumörceller under genotoxisk stress kan inducera antigenspecifika T-cellssvar hos mottagardjur. (A) Möss immuniserades med EVs som härrör från tumörceller som odlats antingen under steady-state (obehandlade) eller genotoxiska stressförhållanden (oxaliplatinbehandlade). Injektioner från fordonet (PBS) användes som en negativ kontroll. IFN-γ produktion av cytotoxiska T-celler i mjälten vid EV immunisering fastställdes. Med detta, splenic cellen suspensioner restimulerades med ovalbumin ex vivo före analys. (B) Möss behandlades med EVs som härrörde från tumörceller under genotoxiska stressförhållanden enligt beskrivningen ovan. Splenic T cell aktivering fastställdes efter ex vivo restimulering antingen i närvaro eller avsaknad av ovalbumin. Staplar visar medelvärdet per grupp och whiskers dess standardfel. Envägsanalysen av varianstestet (ANOVA) med Bonferroni posttest användes för flera statistiska jämförelser av en datauppsättning. Signifikansnivån sattes till P < 0,05, P < 0,01 och P < 0,001 och anges här med asterisker (*, **och ***). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en immunologisk in vivo-bedömning av EVs som härrör från melanomceller under kemoterapiinducerad stress samtidigt som de anpassar sig till EVs som släpps ut från olika cancerformer under olika behandlingar. Immunisering av möss med EVs som härrör från oxaliplatinbehandlade B16-OVA-celler, till exempel, expanderar IFN-γ-producerande CD8 + T-celler i mjälten, som ytterligare stimuleras av ex vivo inkubation med ovalbumin, vilket indikerar ett tumörspecifikt immunsvar. Detektion av immunogenic EVs genom screening genom detta protokoll underlättar således en mer omfattande förståelse av konventionella cancerbehandlingar och möjliggör en fokuserad undersökning av EVs roll i cancerimmunologi.
Observera att experiment med elbilar kräver vissa speciella överväganden. I detta protokoll normaliseras EVs semi-kvantitativt till antalet tumörceller som släpps inom 24 timmar. Detta tillvägagångssätt återspeglar målet att identifiera förbättrad immunogenicitet, oavsett om det uppstår från förändringar i kvalitet eller kvantitet av utsläppta EVs. Reproducerbara in vivo-resultat är därför beroende av den konstanta isoleringseffektiviteten hos EL- och elfordon. För detta ändamål är det ett kritiskt steg att se till att EV-pellets återanvänds helt och hållet och snabbt för att undvika uttorkning.
Dessutom måste EVs kvantifieras och karakteriseras, t.ex. genom nanopartikelspårningsanalys och western blot av kanonisk transmembran, luminal och minst en negativ EV-markör20. Kvantifiera och karakterisera EVs-kontroller för inkonsekvent isolering och tar itu med kvantitativa skillnader i EVs- eller EV-delmängder. Denna typ av EV-karakterisering utgör en del av den minsta information som behöver rapporteras i studier om extracellulära blåsor, enligt International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) riktlinjer. Olika karakteriseringsmetoder är dock lika legitima och bör väljas när det gäller lokal tillgänglighet och den enskilda forskningsfrågan. Att definiera dosering av ett ämne av intresse eller joniserande bestrålning utgör ett annat kritiskt steg i protokollet, vilket kan kräva experimentell validering för att uppnå en adekvat nivå av celldöd.
I allmänhet måste potentiell kontaminering av isolerade EVs med behandlingssubstansen, lösliga proteiner och lipoproteiner övervägas. En strategi i detta avseende består i att reproducera experimentet med kompletterande EV-isoleringstekniker som samma typ av förorening20 kanske inte äventyrar. Immunoaffinitet, till exempel, isolerar EVs med lägre utbyte men högre specificitet än rent nederbördsbaserade metoder och kan ge en lämplig kontroll i detta avseende26. Ett alternativt tillvägagångssätt är att jämföra cell-härledda elfordon av vild typ med isolering från genetiskt modifierade celler med en specifik radering av gener som är involverade i EV-biogenes eller distribuera ämnen som minskar EVs utsläpp20.
Resultat som erhålls från detta protokoll bör kompletteras med en mer omfattande karakterisering av ev-medierade immunsvaret. Särskilt klassificeringen av CD8 + T-celler i effektor- och effektorminnesceller, genom CD4427, liksom antigennaiva och centrala minnesceller, genom CD62L28, kan förmedla djupare insikt. Dessutom kan analysen av T-hjälparceller, regulatoriska T-celler och NK-celler vara av intresse. För testning av antitumöreffekt av EVs kan möss utmanas med motsvarande cancerceller efter att ha fått EV-immunisering eller behandlats med EVs mot en företabled cancer, vilket anpassar riktlinjerna för påvisande av immunogen celldöd2,29 till denna cellfria tumörderivat. Slutsatser från alla dessa experimentella inställningar begränsas dock av det faktum att cancerceller i en Petri-maträtt potentiellt genererar funktionellt olika EVs än cancerceller inbäddade i en dynamisk tumörmikromiljö30 som ofta undertrycker anti-cancer immunitet. Bedömning av EVs härrör från tumör/fibroblast cocultures eller ex vivo tumör vävnad kan bättre återspegla den faktiska situationen. I ett nästa translationella steg mot klinisk verklighet kan EVs från patientmaterial analyseras för immunogenicitet före och under behandlingen för att bedöma deras användbarhet som biomarkörer.
Eftersom cancerbaserade EVs nyligen konstaterades - under vissa omständigheter - modulera immunsystemet, har resan att utforska deras kliniska potential bara börjat31. För en djupgående analys av de immunmekanismer som väljs av immunogena EVs, består användbara verktyg av fluorescensmikroskopi som visualiserar EV-upptaget av specifika celler, utplacering av möss med genetiska brister för specifika immunvägar och screeningmetoder för molekylära förändringar i EV-halten. I slutändan kommer identifiering av immunogenic tumör-härledda EVs, med screeningmetoder som beskrivs häri, att möjliggöra en bättre förståelse av de underliggande mekanismerna bakom EV-medierad immunitet och utgör därför ett avgörande steg mot att utnyttja deras potential mot cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 och Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (till H.P.), ett Mechtild Harf Research Grant från DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium från Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse vid Melanoma researchallians (till S. en fröfond av Tekniska universitetet München (till S.H.) och ett forskningsanslag av Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, till S.H.). H. P. stöds av EMBO Young Investigator Program.
FÖRFATTARBIDRAG:
F.S., H.P., och S.H. designade forskningen, analyserade och tolkade resultaten. F.S. och S.H. skrev manuskriptet. H.P. och S.H. guidade studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
