Summary
Dette manuskriptet beskriver hvordan man vurderer in vivo immunogenisitet av tumorcelleavledede ekstracellulære vesyrer (EVs) ved hjelp av strømningscytometri. Elbiler avledet fra svulster som gjennomgår behandlingsindusert immunogen celledød virker spesielt relevante i tumorimmunosurveillans. Denne protokollen eksemplifiserer vurderingen av oksaliplatininduserte immunostimulatoriske tumor-elbiler, men kan tilpasses ulike innstillinger.
Abstract
Immunogen celledød av svulster, forårsaket av kjemoterapi eller bestråling, kan utløse tumorspesifikke T-celleresponser ved å frigjøre farerelaterte molekylære mønstre og indusere produksjonen av type I interferon. Immunterapi, inkludert sjekkpunkthemming, er først og fremst avhengig av eksisterende tumorspesifikke T-celler for å utfolde en terapeutisk effekt. Dermed kan synergistiske terapeutiske tilnærminger som utnytter immunogen celledød som en iboende anti-kreftvaksine forbedre deres respons. Imidlertid forblir spekteret av immunogene faktorer utgitt av celler under terapiindusert stress ufullstendig karakterisert, spesielt med hensyn til ekstracellulære vesyrer (ELBILER). Elbiler, nano-skala membranøse partikler som slippes ut fra nesten alle celler, anses å lette intercellulær kommunikasjon og, i kreft, har vist seg å megle krysspriming mot tumorantigener. For å vurdere den immunogene effekten av elbiler avledet fra svulster under ulike forhold, er det søkt om tilpasningsdyktige, skalerbare og gyldige metoder. Derfor presenteres heri en relativt enkel og robust tilnærming for å vurdere ELBILERs in vivo immunogenisitet. Protokollen er basert på strømningscytometrianalyse av miltNiske T-celler etter in vivo-immunisering av mus med elbiler, isolert av nedbørsbaserte analyser fra tumorcellekulturer under terapi eller steady-state forhold. For eksempel viser dette arbeidet at oksaliplatineksponering av B16-OVA murin melanomceller resulterte i frigjøring av immunogene elbiler som kan megle aktiveringen av tumorreaktive cytotoksiske T-celler. Derfor identifiserer screening av elbiler via in vivo-immunisering og strømningscytometri forhold der immunogene elbiler kan dukke opp. Identifisering av tilstander for immunogen EV-utgivelse gir en viktig forutsetning for å teste ELBILERs terapeutiske effekt mot kreft og utforske de underliggende molekylære mekanismene for til slutt å avdekke ny innsikt i ELBILERs rolle i kreftimmunologi.
Introduction
Immunsystemet spiller en sentral rolle i kampen mot kreft, både når det oppfordres av immunkontrollpunkthemming og for effekten av konvensjonelle kreftbehandlinger. Tumorceller som bukker under for gentoksiske terapier som kjemoterapeutiske midler oxaliplatin og doksorubicin, eller ioniserende strålebehandling, kan frigjøre antigener og farerelaterte molekylære mønstre (DAMPer) som potensielt kan initiere en adaptiv anti-tumor immunrespons1. De mest fremtredende DAMP-ene, i sammenheng med immunogen celledød, inkluderer finn-meg-signaler som kjemosaktisk ATP, eat-me-signaler som eksponering av calreticulin, som fremmer tumorcelleopptak av antigen-presenterende celler, og utgivelsen av HMGB1, som aktiverer mønstergjenkjenningsreseptorer, og dermed forbedrer krysspresentasjonen av tumorantigener2. Videre er type I interferoner (IFN-I), indusert via tumor-avledede immunogene nukleinsyrer eller andre stimuli, følt av dendrittiske celler, slik at de effektivt kan prime tumorspesifikke cytotoksiske T-celler3,4. Klinisk gir aktiverte og prolifererende CD8+ T-celler som infiltrerer svulsten en uavhengig prognostisk faktor for langvarig overlevelse hos mange kreftpasienter. IFN-γ frigjøres fra slike aktiverte T-celler, og formidler direkte antiproliferative effekter på kreftceller og driver polarisering og cytotoksisk T-celledifferensiering, og bidrar dermed til effektiv immunosurveillans mot kreft5,6. Oxaliplatin er en bona fide immunogen celledødsinduser, som medierer slik adaptiv immunrespons mot kreft7. Imidlertid gjenstår mengden av innledende immunogene signaler utgitt av tumorceller under terapiindusert stress å bli fullstendig avduket. Til tross for betydelige fremskritt innen kreftimmunoterapi, er det fortsatt en utfordring å utvide fordelene til en større del av pasientene. En mer detaljert forståelse av immunogene signaler som initierer T-celleaktivering kan lede utviklingen av nye terapier.
En heterogen gruppe membran-lukkede strukturer, kjent som ekstracellulære vesikler (ELBILER), ser ut til å fungere som intercellulære kommunikasjonsenheter. Avgitt av nesten alle celletyper, bærer elbiler funksjonelle proteiner, RNA, DNA og andre molekyler til en mottakercelle eller kan endre cellens funksjonelle tilstand bare ved å binde seg til reseptorer på celleoverflaten. Deres biologisk aktive last varierer betydelig etter type og funksjonell tilstand av den genererende cellen8. I kreftimmunologi har elbiler frigjort fra tumorceller overveiende blitt ansett som motstandere av immunterapi fordi de til slutt fremmer invasiv vekst, preform metastatiske nisjer9 og undertrykker immunresponsen10. I motsetning har noen studier vist at elbiler kan overføre tumorantigener til dendrittiske celler for effektiv krysspresentasjon11,12. Elbiler kan gi immunostimulatoriske nukleinsyrer hvis de oppstår under terapiindusert stress, noe som letter en anti-tumor immunrespons13,14. Sensing av slike RNA og DNA medfødte immunligander i tumormikromiljøet har nylig vist seg å modulere respons på sjekkpunktblokaden betydelig15,16,17. Derfor må den immunogene rollen til elbiler som frigjøres av tumorceller under forskjellig terapiindusert stress, belyses ytterligere. Siden elbiler utgjør et ungt, men voksende forskningsfelt, pågår det fortsatt standardisering av metoder. Derfor er det viktig å dele kunnskap for å forbedre forskningens reproduserbarhet på interaksjoner mellom elbiler og kreftimmunologi. Med dette i tankene beskriver dette manuskriptet en enkel protokoll for å vurdere den immunogene effekten av tumoravledede elbiler in vivo.
Denne vurderingen utføres ved å generere tumoravledede elbiler, immunisere mottakermus med disse ELBIL-ene og analysere milt-T-celler via strømningscytometri. EV-generasjonen utføres ideelt av såing murine tumorceller i et EV-fritt cellekulturmedium for en høy grad av renhet. Celler behandles med en bestemt cellestress-stimulus, for eksempel kjemoterapi, for å sammenligne effekten av terapiinduserte elbiler mot baseline immunogenisitet av respektive tumoravledede elbiler. Isolering av elbiler kan godt utføres av ulike teknikker som bør velges i henhold til in vivo-anvendbarhet og lokal tilgjengelighet. Følgende protokoll beskriver en nedbørsbasert analyse med et kommersielt sett for EV-rensing. Mus immuniseres to ganger med disse elbilene. Fjorten dager etter den første injeksjonen ekstraheres T-celler fra milten og analyseres for IFN-γ produksjon via strømningscytometri for å evaluere en systemisk immunrespons. Med dette vurderes potensialet for tumoravledede elbiler, som dukker opp under forskjellige terapeutiske regimer, for å indusere anti-tumor T-celleresponser relativt enkelt, raskt og med høy gyldighet13. Derfor er denne metoden egnet for en immunologisk screening av elbiler avledet fra kreftceller under ulike forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ved begynnelsen av eksperimenter var mus minst 6 uker gamle og ble opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold. Den nåværende protokollen er i samsvar med institusjonelle etiske standarder og gjeldende lokale forskrifter. Dyrestudier ble godkjent av det lokale reguleringsorganet (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Mulige kjønnsrelaterte skjevheter ble ikke undersøkt i disse studiene.
1. Generering og isolering av elbiler avledet fra tumorceller etter kjemoterapieksponering
- Kultur murin B16 melanom celler som uttrykker ovalbumin (B16-OVA) i DMEM (inneholder 4 mM L-glutamin og 4,5 g/L D-glukose) supplert med FCS (10% v/v), penicillin (100 Enheter/ml), og streptomycin (100 μg/ml) ved 37 °C, og streptomycin (100 μg/ml) ved 37 °C, til cellene vokser jevnt og er ca. 90% sammenfallende.
MERK: Utfør denne delen av protokollen helt under sterile forhold ved hjelp av en cellekulturhette. For analyse av andre kreftenheter er cellelinjer som uttrykker et potent antigen å foretrekke å vurdere antigenspesifikke T-celleresponser, da de tillater spesifikk ex vivo antigen restimulering. - For å forberede cellekulturmediene som kreves for EV-generering, tøm bovine elbiler i FCS ved ultracentrifugation ved 100,000 x g i 24 timer ved 4 °C, og kast deretter pelletsen. Alternativt kan du velge et kommersielt preparat lavt i dyre-ELBILER på forhånd.
- Høst B16-OVA celler og vask dem to ganger i PBS, og frø deretter i en konsentrasjon på 400.000 celler / ml i EV-utarmede medier.
MERK: Tilpass cellekonsentrasjonen til vekstdynamikken til cellelinjen som undersøkes, slik at cellene ikke vokser for mye. - Behandle B16-OVA celler ved å tilsette 30 μg oksaliplatin per ml og inkubere i 24 timer ved 37 °C. La kontrollforholdene være ubehandlet. Ved første bruk av et gentoksisk stoff, titrat ønsket cytotoksisk effekt ved hjelp av celle-levedyktighetsanalyser som trypan blå eksklusjon18.
MERK: Denne analysen kan også evaluere elbiler generert i cellekulturer som behandles med andre immunmodulerende stoffer eller ioniserende bestråling i tillegg til kjemoterapeutikk.
FORSIKTIG: Oxaliplatin forårsaker hud og alvorlig øyeirritasjon og kan forårsake en allergisk hudreaksjon og irritasjon i luftveiene. Oxaliplatin mistenkes for å forårsake kreft. Som en forholdsregel, bruk personlig verneutstyr, inkludert tilstrekkelige hansker, vernebriller, masker og klær, rengjort før gjenbruk. Unngå innånding og vask hendene grundig etter håndtering. Unngå utslipp i miljøet og kast oxaliplatin i henhold til gjeldende forskrifter. Få detaljert informasjon fra sikkerhetsdatabladet. - Samle cellekultur supernatant. Sentrifuge først ved 400 x g i 5 min ved 4 °C, og deretter ved 2000 x g i 30 min ved 4 °C, hver gang pellets kastes. Til slutt filtrerer du gjennom en 220 nm PVDF-membran. Bruk et nytt rør for hvert trinn for å fjerne cellerester.
MERK: På dette stadiet kan den EV-inneholdende supernatanten oppbevares ved 4 °C i en dag før protokollen gjenopptas. Det anbefales imidlertid sterkt å følge den beskrevne tidsplanen med umiddelbar EV-rensing. - Bland 1 ml supernatant med 0,5 ml av et spesifikt kommersielt tilgjengelig eksosomisolasjonsreagens (se Materialtabell) i et V-formet 1,5 ml rør. Rør grundig opp og ned eller virvel for å skape en homogen løsning. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Sentrifuge ved 10.000 x g i 60 min ved 4 °C. Kast forsiktig supernatanten. Fjern de resterende dråpene ved å trykke på 1,5 ml-røret opp ned på et papirhåndkle og ved aspirasjon gjennom en pipette med en fin spiss uten å berøre EV-pellet nederst.
- Fjern alle væsker grundig for å forhindre ukontrollert fortynning av EV-pellets. Utfør også disse oppgavene raskt for å forhindre at pellet tørker ut.
- Resuspend ELBILene i kald PBS ved å pipettere opp og ned uten å skrape pelletsen fra rørveggen med spissen. Nå, overfør suspensjonen trinn for trinn fra det første til det siste røret for å samle ELBIL-ene.
MERK: Bruk et volum PBS som tilsvarer 5 μL multiplisert med antall rør. 5 μL av den endelige suspensjonen inneholder de isolerte ELBIL-ene som frigjøres fra 400 000 celler under kjemoterapi eller i steady state. - Bruk fortrinnsvis elbiler direkte. Hvis dette ikke er mulig, oppbevar EV-suspensjoner ved -80 °C i silikoniserte beholdere i opptil 28 dager frem til påføring.
MERK: ELBILene som er beskrevet her og i flere andre publikasjoner, mister ikke sin respektive biologiske funksjon når de lagres ved -80 °C i den tidsperioden19. - Kvantifisere og karakterisere EV-isolasjoner i henhold til MISEV2018-retningslinjene20.
MERK: Mulige metoder for kvantifisering inkluderer nanopartikkelsporingsanalyse (NTA)21 og påvisning av EUs membranbundne proteiner22. Mulige tilnærminger for å ytterligere karakterisere elbiler inkluderer elektronmikroskopi23 og vestlig blot20.
2. Immunisering av mus med elbiler
- Planlegg in vivo-eksperimentet med C57BL/6-mus (eller andre syngeneiske mus som tilsvarer tumorcellelinjen), inkludert behandlingsgrupper som mottar elbiler avledet fra behandlede celler, ubehandlede celler og PBS (kjøretøy).
MERK: Bruk fortrinnsvis mus i en alder av 6-8 uker for å forhindre at fysiologisk senescence reduserer immunresponsen24. - Bland 5 μL EV-suspensjon med 55 μL kald PBS for hver mus i den respektive behandlingsgruppen for å immunisere den med elbiler isolert fra 4,0 x 105 B16-OVA celler.
MERK: Denne mengden elbiler tilsvarer omtrent 2 x 109 partikler målt ved nanopartikkelsporingsanalyse (data ikke vist). OVA-protein blandet med en adjuvans (f.eks. LPS) kan påføres som en potent vaksinepositiv kontroll.- Fyll sprøyter (nålstørrelse 26-30 G) med henholdsvis 60 μL av de fortynnede ELBIL-ene eller PBS og legg dem umiddelbart på is.
MERK: I protokollen normaliseres mengden injiserte elbiler til antall EV-frigjørende tumorceller for å eksperimentelt vurdere både kvalitative og kvantitative effekter av oksaliplatin på tumorcelle EV biogenese. For noen lesere kan normalisering til en bestemt konsentrasjon av produserte elbiler bedre passe til deres eksperimentelle oppsett, avhengig av deres vitenskapelige spørsmål.
- Fyll sprøyter (nålstørrelse 26-30 G) med henholdsvis 60 μL av de fortynnede ELBIL-ene eller PBS og legg dem umiddelbart på is.
- Inokulere elbiler eller PBS subkutant inn i medialaspektet av musenes lår og gjenta immuniseringen etter 7 dager. Fjorten dager etter den første behandlingen, ofre mus, for eksempel ved cervical dislokasjon for å analysere immunresponsen.
MERK: Alternative subkutane injeksjonsruter kan brukes i henhold til lokale standarder.
3. Strømningscytometrianalyse av miltniske T-celler
- Forbered og avkjøl fullstendig RPMI (cRPMI), supplere RPMI-1640 med FCS (10% v / v), penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 μg / ml), L-glutamin (2 mM) og β-mercaptoethanol (50 μM).
- Resect milten fra det åpne bukhulen. Mos milten med en fuktet 100 μm cellesil og plaststempelet på en sprøyte og skyll spleniccellene i et 50 ml rør med 5-10 ml cRPMI. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
MERK: Hold celler på is når det er mulig. For å analysere den lokale i stedet for den spleniske immunresponsen, resect drenering popliteal og inguinal lymfeknuter, etter samme protokoll. I dette tilfellet hopper du over neste trinn for lysis av erytrocytter. - For å fjerne erytrocytter fra cellesuspensjonen, resuspender pellet med 2 ml rød blodcelle lysisbuffer (se Materialtabell) og inkubere i 5 minutter ved romtemperatur. Stopp deretter reaksjonen ved å legge til cRPMI. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- For såing, resuspend cellepellet i cRPMI og telle cellene til å plassere triplikater av 200,000 celler med 200 μL cRPMI i hver brønn, ved hjelp av en 96-brønns plate med en U-formet bunn. Inkuber i 48 timer ved 37 °C.
MERK: For å adressere antigenspesifikkiteten til aktiverte T-celler, tilsett henholdsvis 1 μg/ml løselig ovalbumin (eller et annet tumorantigen som tilsvarer cellelinjen under undersøkelse) eller la det stå uten ytterligere stimulans. Ved å legge til den immundominerende peptid epitopen SIINFEKL, i stedet for ovalbumin i full lengde, gir det en kortere inkubasjonsperiode. Foruten strømningscytometri kan musenes serum og cellekulturen supernatant etter 48 timers inkubasjon analyseres for ulike cytokiner. - Etter 48 timer, for å forbedre intracellulær IFN-γ farging ved blant annet å blokkere den Golgi-medierte sekresjonen av proteiner, tilsett Brefeldin A (5 ng/ml), PMA (20 ng/ml) og Ionomycin (1 μg/ml) til cellekulturen. Inkuber i 4 timer ved 37 °C.
- Før du flekker overflatebiomarkører, overfør splenocytter til en 96-brønns plate med V-formet bunn og vask to ganger med PBS. Deretter legger du til fluorescerende antistoffer, kompatible med det lokalt tilgjengelige strømningscytometeret, rettet mot overflatebiomarkører, CD3, CD8 og CD4 (se Tabell over materialer), fortynnet 1:400, pluss et fikserbart levedyktighetsfargestoff, fortynnet 1:1,000 i PBS. Resuspend pelleted splenocytter i fargeløsningen og inkubere i 30 min ved 4 °C, beskyttet mot lys.
- For fiksering og permeabilisering av splenocytter, vask to ganger i FACS-buffer (PBS pluss 3% v / v FCS), og deretter resuspend i 100 μL fiksering / permeabiliseringsbuffer (se Materialtabell) per brønn. Inkuber i 30 min ved 4 °C, beskyttet mot lys.
- For farging av intracellulær IFN-γ, vask splenocytter i fikserings-/permeabiliseringsbuffer og resuspend med fluorescerende antistoffer mot IFN-γ, fortynnet 1:200 i bufferen. Inkuber i minst 1 time (opptil maksimalt 12 timer) ved 4 °C, beskyttet mot lys.
- Før du måler prøvene ved strømningscytometri, vask splenocytter to ganger i fikserings-/permeabiliseringsbuffer og resuspend i FACS-buffer. Analyser aktiveringen av cytotoksiske T-celler i henhold til gatingstrategien som vises i figur 2.
- Først, for å oppdage enkeltceller, blot FSC-H mot FSC-A. Deretter, for å oppdage lymfoide celler, blot SSC mot FSC-A. Velg deretter levende CD3+-, CD4-, CD8+ -celler og bestem deres IFN-γ-produserende delsett for å kvantifisere aktiveringen av cytotoksiske T-celler i milten.
MERK: Ta med en Fluorescence-minus-one (FMO)-flekk med alle fluorokromer unntatt fluorokromen rettet mot IFN-γ som negativ teknisk kontroll.
- Først, for å oppdage enkeltceller, blot FSC-H mot FSC-A. Deretter, for å oppdage lymfoide celler, blot SSC mot FSC-A. Velg deretter levende CD3+-, CD4-, CD8+ -celler og bestem deres IFN-γ-produserende delsett for å kvantifisere aktiveringen av cytotoksiske T-celler i milten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen er ment å lette den enkle og lett reproduserbare vurderingen av immunogenisiteten til tumoravledede elbiler. Herved er mus inokulert med elbiler avledet fra in vitrokulturer av tumorceller som uttrykker modellen antigen kylling ovalbumin (OVA). Den påfølgende immunresponsen analyseres i miltNiske T-celler via strømningscytometri.
Figur 1 gir en oversikt over de praktiske trinnene i hele protokollen. Siden arbeidet fokuserer på immunogen celledød, krysspresentasjon og EV-indusert anti-tumorimmunitet, er denne protokollen begrenset til funksjonen til CD8 + cytotoksiske T-celler. Som vist i figur 2, ble celler inngjerdet som enkeltceller, lymfocyttdel (etter størrelse og granularitet), levedyktige celler (unntatt en liv / død markør) og CD3 + CD4 - CD8 + cytotoksiske T-celler. Intracellulær akkumulering av IFN-γ ble vurdert som surrogatmarkør for aktivering. Mulige ekstra markører angående T-celledifferensiering og utmattelse er diskutert nedenfor.
Ved hjelp av metoden som er beskrevet her, ble mus immunisert med elbiler avledet fra OVA-uttrykkende tumorceller dyrket enten under steady-state (ubehandlet) eller gentoksiske stressforhold (oksaliplatinbehandlet). Bare mus injisert med elbiler avledet fra tumorceller under gentoksiske stressforhold induserte potent aktivering av miltika cytotoksiske T-celler hos mottakerdyr (figur 3A). Injeksjon av elbiler avledet fra svulster under steady-state forhold resulterte i noen T-celleaktivering, men det var ikke signifikant forskjellig fra T-celleaktivering hos mus injisert med PBS-kjøretøyet. Disse dataene viser at tumorceller under gentoksisk stress kan frigjøre potent immunogene elbiler. Produksjonen av IFN-γ ble spesielt økt når splenocytter av tumor EV-behandlede dyr ble eks vivo restimulert med modellen tumor antigen OVA før analyse (Figur 3B). Disse dataene tyder på at tumor-avledede elbiler kan indusere tumorantigenspesifikke immunresponser. Interessant nok oppdages IFN-γ-produksjon - selv om det i mye mindre grad - også i fravær av antigenspesifikk restimulering. Muligens kan andre melanom-assosierte antigener, som differensieringsantigenet TRP225, være målrettet av en del av den EV-induserte T-celleresponsen.
Figur 1: Piktografisk oversikt over protokollen. (A) Isolasjonsprosedyre av elbiler generert i tumorcellekulturer som ligner kjemoterapi. (B) Tidsplan for immunisering av mus med elbiler. (C) Fargingsprotokoll for strømningscytometrianalyse av cytotoksiske T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flow cytometri gating strategi for å analysere cytotoksisk T celleaktivering i milten. Tallene representerer prosentandelen av den respektive overordnede populasjonen. FSC-A: fremoverspredningsområde; FSC-H: fremoverspredningshøyde; SSC: sidelengs scatter; levende/døde: celledødsmarkør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Elbiler avledet fra tumorceller under gentoksisk stress kan indusere antigenspesifikke T-celleresponser hos mottakerdyr. (A) Mus ble immunisert med elbiler avledet fra tumorceller dyrket enten under steady-state (ubehandlet) eller gentoksiske stresstilstander (oksaliplatinbehandlet). Kjøretøyinjeksjoner (PBS) ble brukt som en negativ kontroll. IFN-γ produksjon av cytotoksiske T-celler i milten ved EL-immunisering ble bestemt. Med dette ble miltcelle suspensjoner restimulert med ovalbumin ex vivo før analyse. (B) Mus ble behandlet med elbiler avledet fra tumorceller under gentoksiske stresstilstander som beskrevet ovenfor. Splenic T celleaktivering ble bestemt etter ex vivo restimulation enten i nærvær eller fravær av ovalbumin. Barer skildrer gjennomsnittet per gruppe og visper standardfeilen. Enveisanalysen av varianstest (ANOVA) med Bonferroni posttest ble brukt til flere statistiske sammenligninger av et datasett. Signifikansnivået ble satt til P < 0,05, P < 0,01 og P < 0,001 og er angitt her med stjerner (*, **og ***). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en immunologisk in vivo-vurdering av elbiler avledet fra melanomceller under kjemoterapiindusert stress mens de tilpasser seg elbiler som slippes ut fra ulike kreftformer under ulike behandlinger. Immunisering av mus med elbiler avledet fra oksaliplatinbehandlede B16-OVA-celler utvider for eksempel IFN-γ produserende CD8+ T-celler i milten, som ytterligere stimuleres av eks vivo-inkubasjon med ovalbumin, noe som indikerer en tumorspesifikk immunrespons. Påvisning av immunogene elbiler ved å screene gjennom denne protokollen letter dermed en mer omfattende forståelse av konvensjonelle kreftbehandlinger og muliggjør en fokusert undersøkelse av elbilers rolle i kreftimmunologi.
Vær oppmerksom på at eksperimenter med elbiler krever noen spesielle hensyn. I denne protokollen normaliseres elbiler semi-kvantitativt til antall tumorceller som frigjøres innen 24 timer. Denne tilnærmingen gjenspeiler målet om å identifisere økt immunogenisitet, uavhengig av om den kommer ut av endringer i kvalitet eller mengde frigjorte elbiler. Derfor er reproduserbare in vivo-resultater avhengige av den konstante isolasjonseffekten av elbiler. For dette formål er det et kritisk skritt å sikre at EV-pellets blir resuspendert helt og raskt for å unngå uttørking.
I tillegg må elbiler kvantifiseres og karakteriseres, for eksempel ved nanopartikkelsporingsanalyse og vestlig flekk av kanonisk transmembran, luminal og minst en negativ EV-markør20. Kvantifisere og karakterisere elbilers kontroller for inkonstantisolasjon og adresserer kvantitative forskjeller i elbiler eller EV-delsett. Denne typen EV-karakterisering utgjør en del av minimumsinformasjonen som må rapporteres i studier om ekstracellulære vesikler, i henhold til International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) retningslinjer. Imidlertid er ulike karakteriseringsmetoder like legitime og bør velges ut om lokal tilgjengelighet og det enkelte forskningsspørsmål. Spesielt utgjør definering av dosering av et stoff av interesse eller ioniserende bestråling et annet kritisk trinn i protokollen, som kan kreve eksperimentell validering for å oppnå et tilstrekkelig nivå av celledød.
Generelt må potensiell forurensning av isolerte elbiler med behandlingsstoffet, løselige proteiner og lipoproteiner vurderes. En strategi i denne forbindelse består i å reprodusere eksperimentet med komplementære EV-isolasjonsteknikker som samme type forurensning20 kanskje ikke går på akkord med. Immunoffinitet isolerer for eksempel elbiler med lavere utbytte, men høyere spesifisitet enn rent nedbørsbaserte metoder og kan gi en passende kontroll i denne forbindelse26. En alternativ tilnærming er å sammenligne villtype celleavledede elbiler med isolasjoner fra genmodifiserte celler med en spesifikk sletting av gener involvert i EV-biogenese eller utplassere stoffer som reduserer elbilers utslipp20.
Resultater hentet fra denne protokollen bør suppleres med en mer omfattende karakterisering av den EV-medierte immunresponsen. Spesielt klassifiseringen av CD8+ T-celler i effektor- og effektorminneceller, gjennom CD4427, samt antigennaive og sentrale minneceller, gjennom CD62L28, kan formidle dypere innsikt. Videre kan analysen av T-hjelperceller, regulatoriske T-celler og NK-celler være av interesse. For å teste anti-tumoreffekten av elbiler, kan mus bli utfordret med de tilsvarende kreftcellene etter å ha fått EV-immunisering eller behandlet med elbiler mot en preetablert kreft, og dermed tilpasse retningslinjene for påvisning av immunogen celledød2,29 til denne cellefrie tumoravledningen. Imidlertid er konklusjoner fra alle disse eksperimentelle oppsettene begrenset av det faktum at kreftceller i en Petri-tallerken potensielt genererer funksjonelt forskjellige elbiler enn kreftceller innebygd i en dynamisk tumormikromiljø30 som ofte undertrykker anti-kreftimmunitet. Dermed kan vurdering av elbiler avledet fra tumor / fibroblast kokulturer eller ex vivo tumorvev bedre gjenspeile den faktiske situasjonen. I et neste oversettelsestrinn mot klinisk virkelighet kan elbiler fra pasientmateriale analyseres for immunogenisitet før og under behandlingen for å vurdere deres brukervennlighet som biomarkører.
Ettersom kreftavledede elbiler nylig ble funnet å - under visse omstendigheter - modulere immunforsvaret, har reisen for å utforske deres kliniske potensial bare så vidt begynt31. For en grundig analyse av immunmekanismene som er valgt av immunogene elbiler, omfatter nyttige verktøy fluorescensmikroskopi som visualiserer EV-opptaket av bestemte celler, utplassering av mus med genetiske mangler for spesifikke immunbaner og screeningmetoder for molekylære endringer i EV-innholdet. Til syvende og sist vil identifisering av immunogen tumor-avledede elbiler, med screeningmetoder beskrevet her, muliggjøre en bedre forståelse av de underliggende mekanismene bak EV-mediert immunitet og utgjør derfor et avgjørende skritt mot å utnytte deres potensial mot kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 og Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (til H.P.), et Mechtild Harf Research Grant fra DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award av Melanoma Research Alliance (til S.H.), et stipend fra Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (til F.S.), et frøfond av Det tekniske universitetet münchen (til S.H.) og et forskningsstipend av Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, til S.H.). H. P. støttes av EMBO Young Investigator Program.
FORFATTERBIDRAG:
F.S., H.P. og S.H. designet forskningen, analyserte og tolket resultatene. F.S. og S.H. skrev manuskriptet. H.P. og S.H. ledet studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
