Summary
यह पांडुलिपि वर्णन करती है कि प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्यूमर सेल-व्युत्पन्न बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (ईवी) के विवो इम्युनोजेनिसिटी में मूल्यांकन कैसे किया जाए। उपचार-प्रेरित इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु से गुजरने वाले ट्यूमर से व्युत्पन्न ईवी ट्यूमर इम्युनोसुर्विलेंस में विशेष रूप से प्रासंगिक लगते हैं। यह प्रोटोकॉल ऑक्सालिप्लैटिन-प्रेरित इम्यूनोस्टिमुलेटरी ट्यूमर ईवी के मूल्यांकन का उदाहरण देता है, लेकिन इसे विभिन्न सेटिंग्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
कीमोथेरेपी या विकिरण के कारण ट्यूमर की इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु, खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न जारी करके और टाइप I इंटरफेरॉन के उत्पादन को प्रेरित करके ट्यूमर-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकती है। चेकपॉइंट निषेध सहित इम्यूनोथेरेपी, मुख्य रूप से एक चिकित्सीय प्रभाव को उजागर करने के लिए पहले से मौजूद ट्यूमर-विशिष्ट टी कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं। इस प्रकार, सहक्रियात्मक चिकित्सीय दृष्टिकोण जो एक आंतरिक एंटी-कैंसर वैक्सीन के रूप में इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु का शोषण करते हैं, उनकी जवाबदेही में सुधार कर सकते हैं। हालांकि, चिकित्सा-प्रेरित तनाव के तहत कोशिकाओं द्वारा जारी इम्युनोजेनिक कारकों का स्पेक्ट्रम अपूर्ण रूप से विशेषता है, विशेष रूप से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (ईवी) के बारे में। ईवीएस, नैनो-स्केल झिल्लीदार कणों को लगभग सभी कोशिकाओं से उत्सर्जित किया जाता है, जिसे अंतरकोशिकीय संचार की सुविधा के लिए माना जाता है और कैंसर में, ट्यूमर एंटीजन के खिलाफ क्रॉस-प्राइमिंग की मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है। विभिन्न परिस्थितियों में ट्यूमर से व्युत्पन्न ईवी के इम्युनोजेनिक प्रभाव का आकलन करने के लिए, अनुकूलनीय, स्केलेबल और वैध तरीकों की मांग की जाती है। इसलिए, इसमें एक अपेक्षाकृत आसान और मजबूत दृष्टिकोण को ईवी एस का आकलन करने के लिए प्रस्तुत किया गया है विवो इम्युनोजेनेसिटी में। प्रोटोकॉल ईवी के साथ चूहों के विवो टीकाकरण के बाद स्प्लेनिक टी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण पर आधारित है, जो चिकित्सा या स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत ट्यूमर सेल संस्कृतियों से वर्षा-आधारित एसेस द्वारा अलग किया गया है। उदाहरण के लिए, इस काम से पता चलता है कि B16-OVA मुरीन मेलेनोमा कोशिकाओं के oxaliplatin एक्सपोजर के परिणामस्वरूप इम्युनोजेनिक ईवी की रिहाई हुई जो ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के सक्रियण की मध्यस्थता कर सकती है। इसलिए, विवो टीकाकरण और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से ईवी की स्क्रीनिंग उन स्थितियों की पहचान करती है जिनके तहत इम्युनोजेनिक ईवी उभर सकते हैं। इम्युनोजेनिक ईवी रिलीज की स्थितियों की पहचान करना कैंसर के खिलाफ ईवीएस की चिकित्सीय प्रभावकारिता का परीक्षण करने और अंततः कैंसर इम्यूनोलॉजी में ईवीएस की भूमिका में नई अंतर्दृष्टि का अनावरण करने के लिए अंतर्निहित आणविक तंत्र की खोज करने के लिए एक आवश्यक शर्त प्रदान करता है।
Introduction
प्रतिरक्षा प्रणाली कैंसर के खिलाफ लड़ाई में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, दोनों जब प्रतिरक्षा चेकपॉइंट निषेध द्वारा उकसाया जाता है और पारंपरिक कैंसर उपचारों की प्रभावकारिता के लिए। ट्यूमर कोशिकाएं जीनोटॉक्सिक उपचारों जैसे कि कीमोथेरेपी एजेंटों ऑक्सालिप्लैटिन और डोक्सोरुबिसिन, या आयनीकरण विकिरण उपचार के लिए झुकने वाली कोशिकाएं एंटीजन और खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) जारी कर सकती हैं जो संभावित रूप से एक अनुकूली एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करती हैं। इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु के संदर्भ में सबसे प्रमुख डीएएमपी में केमोटैक्टिक एटीपी जैसे खोज-मुझे संकेत शामिल हैं, जैसे कि कैल्रेटिकुलिन के एक्सपोजर जैसे मुझे संकेत, जो एंटीजन-प्रस्तुत कोशिकाओं द्वारा ट्यूमर सेल अपटेक को बढ़ावा देते हैं, और एचएमजीबी 1 की रिहाई, जो पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स को सक्रिय करती है, जिससे ट्यूमर एंटीजन 2 की क्रॉस-प्रस्तुति बढ़ जाती है। इसके अलावा, टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I), ट्यूमर-व्युत्पन्न इम्युनोजेनिक न्यूक्लिक एसिड या अन्य उत्तेजनाओं के माध्यम से प्रेरित, डेंड्राइटिक कोशिकाओं द्वारा महसूस किया जाता है, जिससे उन्हें प्रभावी रूप से ट्यूमर-विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से प्राइम करने में सक्षम बनाया जाता है3,4। नैदानिक रूप से, सक्रिय और ट्यूमर में घुसपैठ करने वाली सीडी 8 + टी कोशिकाओं को फैलाने से कई कैंसर रोगियों में लंबे समय तक जीवित रहने के लिए एक स्वतंत्र भविष्यवाणी कारक प्रदान किया जाता है। इस तरह के सक्रिय टी कोशिकाओं से जारी, आईएफएन-γ कैंसर कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष एंटीप्रोलिफेरेटिव प्रभावों की मध्यस्थता करता है और Th1 ध्रुवीकरण और साइटोटोक्सिक टी सेल भेदभाव को चलाता है, जिससे कैंसर के खिलाफ प्रभावी immunosurveillance में योगदान होता है5,6। Oxaliplatin एक वास्तविक इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु प्रेरक है, जो कैंसर के खिलाफ इस तरह की अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मध्यस्थता करता है7। हालांकि, चिकित्सा-प्रेरित तनाव के तहत ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा जारी प्रारंभिक इम्युनोजेनिक संकेतों की अधिकता का पूरी तरह से अनावरण किया जाना बाकी है। कैंसर इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, रोगियों के एक बड़े हिस्से में इसके लाभों का विस्तार करना एक चुनौती बनी हुई है। टी सेल सक्रियण शुरू करने वाले इम्युनोजेनिक संकेतों की अधिक विस्तृत समझ उपन्यास उपचारों के विकास का मार्गदर्शन कर सकती है।
झिल्ली-संलग्न संरचनाओं का एक विषम समूह, जिसे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (ईवी) के रूप में जाना जाता है, अंतरकोशिकीय संचार उपकरणों के रूप में कार्य करने लगते हैं। लगभग सभी सेल प्रकारों द्वारा उत्सर्जित, ईवी कार्यात्मक प्रोटीन, आरएनए, डीएनए और अन्य अणुओं को प्राप्तकर्ता सेल में ले जाते हैं या सेल की सतह पर रिसेप्टर्स को बाध्य करके सेल की कार्यात्मक स्थिति को बदल सकते हैं। उनका जैविक रूप से सक्रिय कार्गो उत्पादन सेल 8 के प्रकार और कार्यात्मक स्थिति से काफी भिन्न होता है। कैंसर इम्यूनोलॉजी में, ट्यूमर कोशिकाओं से जारी ईवी को मुख्य रूप से इम्यूनोथेरेपी के लिए प्रतिकूल माना जाता है क्योंकि वे अंततः आक्रामक विकास को बढ़ावा देते हैं, मेटास्टैटिक niches9 को पूर्वरूप देते हैं, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाते हैं। इसके विपरीत, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि ईवी प्रभावी क्रॉस-प्रस्तुति 11,12 के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं में ट्यूमर एंटीजन को स्थानांतरित कर सकते हैं। ईवी immunostimulatory न्यूक्लिक एसिड प्रदान कर सकते हैं यदि वे चिकित्सा-प्रेरित तनाव के तहत उभरते हैं, तो एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 13,14 की सुविधा प्रदान करते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में इस तरह के आरएनए और डीएनए जन्मजात प्रतिरक्षा लिगेंड की संवेदन को हाल ही में चेकपॉइंट नाकाबंदी के प्रति जवाबदेही को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है 15,16,17। इसलिए, विभिन्न चिकित्सा-प्रेरित तनाव के तहत ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा जारी ईवी की इम्युनोजेनिक भूमिका को और अधिक स्पष्ट करने की आवश्यकता है। चूंकि ईवी अनुसंधान के एक युवा अभी तक बढ़ते क्षेत्र का गठन करते हैं, इसलिए विधियों का मानकीकरण अभी भी चल रहा है। इसलिए, ईवी और कैंसर इम्यूनोलॉजी के बीच बातचीत पर अनुसंधान पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए ज्ञान साझा करना आवश्यक है। इसे ध्यान में रखते हुए, यह पांडुलिपि विवो में ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी के इम्युनोजेनिक प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।
यह मूल्यांकन ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी उत्पन्न करके, उन ईवी के साथ प्राप्तकर्ता चूहों का टीकाकरण करके, और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्लीहा टी कोशिकाओं का विश्लेषण करके किया जाता है। EV पीढ़ी आदर्श रूप से शुद्धता की एक उच्च डिग्री के लिए एक EV मुक्त सेल संस्कृति माध्यम में murine ट्यूमर कोशिकाओं सीडिंग द्वारा प्रदर्शन किया जाता है। कोशिकाओं को एक विशिष्ट सेल तनाव उत्तेजना के साथ इलाज किया जाता है, जैसे कि कीमोथेरेपी, संबंधित ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी की बेसलाइन इम्युनोजेनेसिटी के खिलाफ चिकित्सा-प्रेरित ईवी के प्रभाव की तुलना करने के लिए। ईवी के अलगाव को विभिन्न तकनीकों द्वारा अच्छी तरह से किया जा सकता है जिन्हें विवो प्रयोज्यता और स्थानीय उपलब्धता के अनुसार चुना जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईवी शुद्धिकरण के लिए एक वाणिज्यिक किट के साथ एक वर्षा-आधारित परख का वर्णन करता है। चूहों को उन ईवी के साथ दो बार प्रतिरक्षित किया जाता है। पहले इंजेक्शन के चौदह दिन बाद, टी कोशिकाओं को प्लीहा से निकाला जाता है और एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से आईएफएन-γ उत्पादन के लिए विश्लेषण किया जाता है। इसके साथ, ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी की क्षमता, विभिन्न चिकित्सीय आहारों के तहत उभरते हुए, एंटी-ट्यूमर टी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए अपेक्षाकृत आसानी से, जल्दी से और उच्च वैधता के साथ मूल्यांकन किया जाता है13। इसलिए, यह विधि विभिन्न परिस्थितियों में कैंसर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी की प्रतिरक्षाविज्ञानी स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।
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Protocol
प्रयोगों की शुरुआत में, चूहों की उम्र कम से कम 6 सप्ताह थी और विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में बनाए रखा गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल संस्थागत नैतिक मानकों और प्रचलित स्थानीय नियमों का अनुपालन करता है। पशु अध्ययन को स्थानीय नियामक एजेंसी (Regierung von Oberbayern, म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इन अध्ययनों में संभावित सेक्स से संबंधित पूर्वाग्रहों की जांच नहीं की गई थी।
1. कीमोथेरेपी जोखिम के बाद ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी का उत्पादन और अलगाव
- DMEM में ovalbumin (B16-OVA) को व्यक्त करने वाली संस्कृति मुरीन B16 मेलेनोमा कोशिकाएं (जिसमें 4 mM L-glutamine और 4.5 g/ L D-glucose शामिल हैं) FCS (10% v / v), पेनिसिलिन (100 यूनिट / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL) के साथ पूरक 37 °C पर, जब तक कि कोशिकाएं लगातार बढ़ती हैं और लगभग 90% confluent होती हैं।
नोट:: प्रोटोकॉल के इस अनुभाग को पूरी तरह से एक सेल संस्कृति हुड का उपयोग कर बाँझ शर्तों के तहत निष्पादित करें। अन्य कैंसर संस्थाओं के विश्लेषण के लिए, एक शक्तिशाली एंटीजन व्यक्त करने वाली सेल लाइनें एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए बेहतर होती हैं, क्योंकि वे विशिष्ट पूर्व विवो एंटीजन पुन: अनुकरण की अनुमति देते हैं। - ईवी पीढ़ी के लिए आवश्यक सेल संस्कृति मीडिया तैयार करने के लिए, एफसीएस के भीतर गोजातीय ईवी को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 100,000 एक्स जी पर अल्ट्रासेंट्रिफ्यूजन द्वारा समाप्त करें, और फिर गोली को त्याग दें। वैकल्पिक रूप से, पहले से पशु ईवी में कम व्यावसायिक तैयारी चुनें।
- बी 16-ओवीए कोशिकाओं को काटें और उन्हें पीबीएस में दो बार धोएं, और फिर ईवी-समाप्त मीडिया में 400,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर बीज।
नोट:: जाँच के तहत सेल लाइन की वृद्धि गतिशील करने के लिए सेल एकाग्रता अनुकूलित करें ताकि कक्षों overgrow नहीं है। - प्रति एमएल ऑक्सालिप्लैटिन के 30 μg को जोड़कर B16-OVA कोशिकाओं का इलाज करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। नियंत्रण की स्थिति अनुपचारित छोड़ दें। एक genotoxic पदार्थ के पहले उपयोग पर, इस तरह के trypan नीले बहिष्करण के रूप में सेल व्यवहार्यता assays का उपयोग कर वांछित साइटोटोक्सिक प्रभावकारिता titrate18.
नोट: यह परख भी अन्य प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटिंग पदार्थों या कीमोथेरेपी के अलावा ionizing विकिरण के साथ इलाज सेल संस्कृतियों में उत्पन्न EVs का मूल्यांकन कर सकते हैं.
चेतावनी: ऑक्सालिप्लैटिन त्वचा और गंभीर आंखों की जलन का कारण बनता है और एलर्जी त्वचा की प्रतिक्रिया और श्वसन जलन का कारण बन सकता है। ऑक्सालिप्लैटिन पर कैंसर पैदा करने का संदेह है। एक एहतियात के रूप में, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें, जिसमें पर्याप्त दस्ताने, चश्मे, मास्क और कपड़े शामिल हैं, जिन्हें पुन: उपयोग से पहले साफ किया गया था। साँस लेने से बचें और हैंडलिंग के बाद हाथों को अच्छी तरह से धोएं। पर्यावरण में रिलीज से बचें और प्रचलित नियमों के अनुसार ऑक्सालिप्लैटिन का निपटान करें। सुरक्षा डेटा पत्रक से विस्तृत जानकारी प्राप्त करें. - सेल संस्कृति supernatant ले लीजिए. सेंट्रीफ्यूज पहले 400 x g पर 5 मिनट के लिए 4 °C पर, और फिर 4 °C पर 30 मिनट के लिए 2,000 x g पर, हर बार गोली को त्यागना। अंत में, एक 220 एनएम PVDF झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए प्रत्येक चरण के लिए एक ताजा ट्यूब का उपयोग करें।
नोट: इस स्तर पर, EV-युक्त supernatant प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले एक दिन के लिए 4 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, तत्काल ईवी शुद्धिकरण के साथ वर्णित अनुसूची का पालन करने के लिए दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। - एक विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सोसोम अलगाव अभिकर्मक के 0.5 मिलीलीटर के साथ supernatant के 1 mL मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें) एक वी आकार के 1.5 mL ट्यूब में। एक समरूप समाधान बनाने के लिए पूरी तरह से ऊपर और नीचे या भंवर को अच्छी तरह से पिपेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सावधानी से supernatant छोड़ दें. एक कागज तौलिया पर उल्टा 1.5 एमएल ट्यूब दोहन द्वारा और नीचे ईवी-गोली को छूने के बिना एक ठीक टिप के साथ एक पिपेट के माध्यम से आकांक्षा द्वारा शेष बूँदें निकालें।
- ईवी-पैलेट के अनियंत्रित कमजोर पड़ने को रोकने के लिए सभी तरल पदार्थों को अच्छी तरह से हटा दें। इसके अलावा, छर्रे को सूखने से रोकने के लिए इन कार्यों को जल्दी से निष्पादित करें।
- टिप के साथ ट्यूब की दीवार से गोली scratching बिना ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ठंडे PBS में EVs resuspend. अब, ईवी को पूल करने के लिए पहले से अंतिम ट्यूब तक कदम से कदम से निलंबन चरण स्थानांतरित करें।
नोट:: 5 μL ट्यूबों की संख्या से गुणा के बराबर PBS की एक मात्रा का उपयोग करें। अंतिम निलंबन के 5 μL में कीमोथेरेपी के तहत या स्थिर स्थिति में 400,000 कोशिकाओं से जारी अलग-थलग ईवी शामिल हैं। - अधिमानतः, सीधे ईवी का उपयोग करें। यदि यह संभव नहीं है, तो आवेदन तक 28 दिनों तक सिलिकॉनाइज्ड जहाजों में -80 डिग्री सेल्सियस पर ईवी निलंबन स्टोर करें।
नोट: यहां और कई अन्य प्रकाशनों में वर्णित ईवी अपने संबंधित जैविक कार्य को नहीं खोते हैं जब उस समय अवधि 19 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। - MISEV2018 दिशानिर्देशों 20 के अनुसार EV आइसोलेट्स को परिमाणित और चिह्नित करें।
नोट: परिमाणीकरण के लिए संभावित तरीकों में नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) 21 और ईवी के झिल्ली-बाध्य प्रोटीन का पता लगाना शामिल है22। ईवी को और अधिक चिह्नित करने के संभावित दृष्टिकोणों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 23 और पश्चिमी धब्बा 20 शामिल हैं।
2. ईवी के साथ चूहों का टीकाकरण
- C57BL/6 चूहों (या ट्यूमर सेल लाइन के अनुरूप अन्य syngeneic चूहों) के साथ इन विवो प्रयोग की योजना बनाएं, जिसमें क्रमशः उपचारित कोशिकाओं, अनुपचारित कोशिकाओं और पीबीएस (वाहन) से व्युत्पन्न ईवी प्राप्त करने वाले उपचार समूह शामिल हैं।
नोट: अधिमानतः, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने से शारीरिक सेनेसेंस को रोकने के लिए 6-8 सप्ताह की उम्र में चूहों का उपयोग करें24। - संबंधित उपचार समूह के भीतर प्रत्येक माउस के लिए 55 μL ठंडे PBS के साथ EV-निलंबन के 5 μL मिश्रण करने के लिए इसे 4.0 x 105 B16-OVA कोशिकाओं से अलग EVs के साथ प्रतिरक्षित करने के लिए।
नोट: ईवी की यह मात्रा नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (डेटा नहीं दिखाया गया है) द्वारा मापा गया लगभग 2 x 109 कणों से मेल खाती है। एक सहायक (जैसे, एलपीएस) के साथ मिश्रित ओवीए प्रोटीन को एक शक्तिशाली टीका सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लागू किया जा सकता है।- क्रमशः पतले ईवी या पीबीएस के 60 μL के साथ सिरिंज (सुई का आकार 26-30 जी) भरें और बर्फ पर तुरंत डालें।
नोट: प्रोटोकॉल में, इंजेक्ट किए गए ईवी की मात्रा को ईवी-रिलीजिंग ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत किया जाता है ताकि प्रयोगात्मक रूप से ट्यूमर सेल ईवी बायोजेनेसिस पर ऑक्सालिप्लैटिन के गुणात्मक और मात्रात्मक प्रभावों दोनों पर विचार किया जा सके। कुछ पाठकों के लिए, उत्पादित ईवी की एक विशिष्ट एकाग्रता के लिए सामान्यीकरण उनके वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर उनके प्रयोगात्मक सेटअप को बेहतर ढंग से फिट कर सकता है।
- क्रमशः पतले ईवी या पीबीएस के 60 μL के साथ सिरिंज (सुई का आकार 26-30 जी) भरें और बर्फ पर तुरंत डालें।
- चूहों की जांघ के औसत दर्जे के पहलू में ईवीएस या पीबीएस को चमड़े के नीचे संक्रमित करें और 7 दिनों के बाद टीकाकरण को दोहराएं। पहले उपचार के चौदह दिन बाद, चूहों की बलि दें, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा।
नोट: वैकल्पिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन मार्गों का उपयोग स्थानीय मानकों के अनुसार किया जा सकता है।
3. प्लीहा टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण
- तैयार करें और पूरा RPMI (cRPMI), FCS (10% v / v), पेनिसिलिन (100 इकाइयों / mL), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL), एल-ग्लूटामाइन (2 mM), और β-mercaptoethanol (50 μM) के साथ RPMI-1640 के पूरक।
- खुले उदर गुहा से तिल्ली को उच्छेदन करें। एक नम 100 μm सेल छलनी और एक सिरिंज के प्लास्टिक प्लंजर के साथ तिल्ली को मैश करें और स्प्लेनिक कोशिकाओं को 5-10 मिलीलीटर cRPMI के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में फ्लश करें। 400 x g पर 4 °C पर 5 मिनट के लिए centrifuge और supernatant त्याग.
नोट: जब भी संभव हो बर्फ पर कोशिकाओं को रखें। स्प्लेनिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बजाय स्थानीय का विश्लेषण करने के लिए, एक ही प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, draining popliteal और वंक्षण लिम्फ नोड्स को उच्छेदित करें। इस मामले में, एरिथ्रोसाइट्स के लाइसिस के लिए अगले चरण को छोड़ दें। - सेल निलंबन से एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के लिए, लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 2 एमएल के साथ छर्रे को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, cRPMI जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें। 400 x g पर 4 °C पर 5 मिनट के लिए centrifuge और supernatant त्याग.
- सीडिंग के लिए, सीआरपीएमआई में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक कुएं में 200 μL cRPMI के साथ 200,000 कोशिकाओं के तीन प्रतियों को रखने के लिए कोशिकाओं की गिनती करें, यू-आकार के तल के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: सक्रिय टी कोशिकाओं की एंटीजन-विशिष्टता को संबोधित करने के लिए, क्रमशः 1 μg / mL घुलनशील ovalbumin (या जांच के तहत सेल लाइन के अनुरूप एक और ट्यूमर एंटीजन) जोड़ें या अतिरिक्त उत्तेजना के बिना छोड़ दें। प्रतिरक्षा-प्रमुख पेप्टाइड एपिटोप SIINFEKL जोड़ना, पूर्ण लंबाई ovalbumin के बजाय, एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि के लिए अनुमति देता है। प्रवाह साइटोमेट्री के अलावा, चूहों के सीरम और सेल संस्कृति supernatant इनक्यूबेशन के 48 ज के बाद विभिन्न साइटोकिन्स के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। - 48 घंटे के बाद, इंट्रासेल्युलर आईएफएन-γ धुंधला करने को बढ़ाने के लिए, अन्य बातों के साथ-साथ, प्रोटीन के गोल्गी-मध्यस्थता स्राव को अवरुद्ध करने के लिए, सेल संस्कृति में ब्रेफेल्डिन ए (5 एनजी / एमएल), पीएमए (20 एनजी / एमएल), और आयोनोमाइसिन (1 μg / एमएल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- सतह बायोमाकर्स को धुंधला करने से पहले, स्प्लेनोसाइट्स को वी-आकार के नीचे के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं। फिर, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़ें, स्थानीय रूप से उपलब्ध प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत, सतह बायोमाकर्स, सीडी 3, सीडी 8, और सीडी 4 ( सामग्री की तालिका देखें) के खिलाफ निर्देशित, पतला 1: 400, प्लस एक फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई, पीबीएस में 1: 1,000 पतला। धुंधला समाधान में छर्रेदार स्प्लेनोसाइट्स को फिर से निलंबित कर दिया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, जो प्रकाश से संरक्षित है।
- स्प्लेनोसाइट्स के निर्धारण और permeabilization के लिए, FACS-बफर (PBS प्लस 3% v / v FCS) में दो बार धोएं, और फिर 100 μL में फिक्सेशन / परमीबिलाइजेशन बफर ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
- इंट्रासेल्युलर आईएफएन-γ के दाग के लिए, फिक्सेशन / परमेबिलाइजेशन बफर में स्प्लेनोसाइट्स को धोएं और आईएफएन-γ के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ फिर से निलंबित करें, बफर में 1: 200 पतला करें। कम से कम 1 घंटे (अधिकतम 12 घंटे तक) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो प्रकाश से संरक्षित है।
- प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नमूनों को मापने से पहले, स्प्लेनोसाइट्स को निर्धारण / परमेबिलाइजेशन बफर में दो बार धोएं और एफएसीएस-बफर में पुन: निलंबित करें। चित्र 2 में प्रदर्शित गेटिंग रणनीति के अनुसार साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के सक्रियण का विश्लेषण करें।
- सबसे पहले, एकल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एफएससी-ए के खिलाफ एफएससी-एच को धब्बा करें। फिर, लिम्फोइड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एफएससी-ए के खिलाफ एसएससी को धब्बा करें। इसके बाद, जीवित CD3+, CD4-, CD8+ कोशिकाओं का चयन करें और प्लीहा में साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के सक्रियण को मापने के लिए उनके IFN-γ-उत्पादक सबसेट का निर्धारण करें।
नोट: नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण के रूप में IFN-γ के खिलाफ लक्षित फ्लोरोक्रोम को छोड़कर सभी फ्लोरोक्रोम के साथ एक प्रतिदीप्ति-माइनस-एक (FMO) दाग शामिल करें।
- सबसे पहले, एकल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एफएससी-ए के खिलाफ एफएससी-एच को धब्बा करें। फिर, लिम्फोइड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एफएससी-ए के खिलाफ एसएससी को धब्बा करें। इसके बाद, जीवित CD3+, CD4-, CD8+ कोशिकाओं का चयन करें और प्लीहा में साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के सक्रियण को मापने के लिए उनके IFN-γ-उत्पादक सबसेट का निर्धारण करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी की इम्युनोजेनेसिटी के सीधे और आसानी से पुन: प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाना है। इसके द्वारा, चूहों को मॉडल एंटीजन चिकन ओवल्बुमिन (ओवीए) को व्यक्त करने वाले ट्यूमर कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृतियों से व्युत्पन्न ईवी एस के साथ संक्रमित किया जाता है। बाद की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्लीहा टी कोशिकाओं में किया जाता है।
चित्रा 1 पूरे प्रोटोकॉल के व्यावहारिक चरणों का अवलोकन देता है। चूंकि काम इम्युनोजेनिक सेल मृत्यु, क्रॉस-प्रस्तुति और ईवी-प्रेरित एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर केंद्रित है, इसलिए यह प्रोटोकॉल सीडी 8 + साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के कार्य तक सीमित है। जैसा कि चित्रा 2 में प्रदर्शित किया गया है, कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं, लिम्फोसाइट सबसेट (आकार और ग्रैन्युलैरिटी द्वारा), व्यवहार्य कोशिकाओं (जीवन / मृत मार्कर को छोड़कर), और सीडी 3 + सीडी 4- सीडी 8 + साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के रूप में गेटेड किया गया था। IFN-γ के इंट्रासेल्युलर संचय को सक्रियण के लिए एक सरोगेट मार्कर के रूप में मूल्यांकन किया गया था। टी सेल भेदभाव और थकावट के बारे में संभावित अतिरिक्त मार्करों पर नीचे चर्चा की गई है।
यहां वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, चूहों को ओवीए-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, जो या तो स्थिर-राज्य (अनुपचारित) या जीनोटॉक्सिक तनाव की स्थिति (ऑक्सालिप्लैटिन-उपचारित) के तहत सुसंस्कृत थे। केवल चूहों को जीनोटॉक्सिक तनाव की स्थिति के तहत ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी एस के साथ इंजेक्ट किया गया, प्राप्तकर्ता जानवरों में प्लीहा साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के शक्तिशाली सक्रियण को प्रेरित किया गया (चित्रा 3 ए)। स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत ट्यूमर से व्युत्पन्न ईवी एस के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कुछ टी सेल सक्रियण हुआ, लेकिन यह पीबीएस वाहन के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों में टी सेल सक्रियण से काफी अलग नहीं था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि जीनोटॉक्सिक तनाव के तहत, ट्यूमर कोशिकाएं शक्तिशाली रूप से इम्युनोजेनिक ईवी जारी कर सकती हैं। आईएफएन-γ का उत्पादन विशेष रूप से बढ़ गया था जब ट्यूमर ईवी-उपचारित जानवरों के स्प्लेनोसाइट्स को विश्लेषण से पहले मॉडल ट्यूमर एंटीजन ओवीए के साथ पूर्व विवो पुन: प्रस्तुत किया गया था (चित्रा 3 बी)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि आईएफएन-γ-उत्पादन - भले ही बहुत कम हद तक - एंटीजन-विशिष्ट पुनर्स्थापना की अनुपस्थिति में भी पता चला है। संभवतः, अन्य मेलेनोमा से जुड़े एंटीजन, जैसे कि भेदभाव एंटीजन टीआरपी 225, ईवी-प्रेरित टी सेल प्रतिक्रिया के कुछ हिस्से द्वारा लक्षित किया जा सकता है।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का चित्रात्मक अवलोकन। (ए) कीमोथेरेपी के समान ट्यूमर सेल संस्कृतियों में उत्पन्न ईवी की अलगाव प्रक्रिया। (ख) ईवी के साथ चूहों के प्रतिरक्षण के लिए अनुसूची। (सी) साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए धुंधला प्रोटोकॉल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्लीहा में साइटोटॉक्सिक टी सेल सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। संख्याएं इसकी संबंधित मूल आबादी के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती हैं। FSC-A: आगे तितर बितर क्षेत्र; FSC-H: आगे तितर बितर ऊंचाई; एसएससी: साइडवर्ड स्कैटर; जीवित / मृत: सेल मृत्यु मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: जीनोटॉक्सिक तनाव के तहत ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी प्राप्तकर्ता जानवरों में एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं। (ए) चूहों को ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, जो या तो स्थिर-राज्य (अनुपचारित) या जीनोटॉक्सिक तनाव की स्थिति (ऑक्सालिप्लैटिन-उपचारित) के तहत सुसंस्कृत थे। वाहन (पीबीएस) इंजेक्शन का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ईवी टीकाकरण पर प्लीहा में साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं द्वारा आईएफएन-γ उत्पादन निर्धारित किया गया था। इसके साथ, स्प्लेनिक सेल निलंबन को विश्लेषण से पहले ओवलबुमिन पूर्व विवो के साथ फिर से तैयार किया गया था। (बी) चूहों को जीनोटॉक्सिक तनाव की स्थिति के तहत ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी के साथ इलाज किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है। प्लीहा टी सेल सक्रियण या तो ovalbumin की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पूर्व vivo restimulation के बाद निर्धारित किया गया था। सलाखों प्रति समूह माध्य को दर्शाता है और व्हिस्कर इसकी मानक त्रुटि को दर्शाता है। Bonferroni posttest के साथ विचरण (एनोवा) परीक्षण के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग डेटासेट की कई सांख्यिकीय तुलनाओं के लिए किया गया था। महत्व स्तर पी < 0.05, पी < 0.01, और पी < 0.001 पर सेट किया गया था और तारांकन चिह्न (*, **, और ***) के साथ यहां इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल विभिन्न उपचारों के तहत विभिन्न कैंसर से उत्सर्जित ईवी के अनुकूल होने के दौरान कीमोथेरेपी-प्रेरित तनाव के तहत मेलेनोमा कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी एस के विवो मूल्यांकन में एक प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, ऑक्सालिप्लैटिन-उपचारित बी 16-ओवीए कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईवी के साथ चूहों को प्रतिरक्षित करना, प्लीहा में आईएफएन-γ-उत्पादक सीडी 8 + टी कोशिकाओं का विस्तार करता है, जो आगे ओवलबुमिन के साथ पूर्व विवो इनक्यूबेशन द्वारा उत्तेजित होते हैं, जो ट्यूमर-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का संकेत देते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के माध्यम से स्क्रीनिंग द्वारा इम्युनोजेनिक ईवी का पता लगाने से पारंपरिक कैंसर उपचारों की अधिक व्यापक समझ की सुविधा मिलती है और कैंसर इम्यूनोलॉजी में ईवी की भूमिका में एक केंद्रित जांच सक्षम होती है।
ध्यान दें, ईवी के साथ प्रयोगों को कुछ विशेष विचारों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, ईवी को 24 घंटे के भीतर जारी ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के लिए अर्ध-मात्रात्मक रूप से सामान्यीकृत किया जाता है। यह दृष्टिकोण बढ़ी हुई इम्युनोजेनेसिटी की पहचान करने के उद्देश्य को दर्शाता है, भले ही यह गुणवत्ता या जारी किए गए ईवी की मात्रा में परिवर्तन से उभरता है या नहीं। इसलिए, विवो परिणामों में पुन: प्रस्तुत करने योग्य ईवी की निरंतर अलगाव प्रभावकारिता पर भरोसा करते हैं। इस अंत के लिए, यह सुनिश्चित करना कि ईवी छर्रों को पूरी तरह से और तुरंत desiccation से बचने के लिए फिर से निलंबित कर दिया जाता है, एक महत्वपूर्ण कदम है।
इसके अतिरिक्त, ईवी को परिमाणित और विशेषता दी जानी चाहिए, उदाहरण के लिए, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण और विहित ट्रांसमेम्ब्रेन, ल्यूमिनल और कम से कम एक नकारात्मक ईवी-मार्कर 20 के पश्चिमी धब्बा द्वारा। असंगत अलगाव के लिए ईवी नियंत्रणों को परिमाणित करना और विशेषता देना और ईवी या ईवी सबसेट में मात्रात्मक अंतर को संबोधित करता है। इस प्रकार के ईवी लक्षण वर्णन न्यूनतम जानकारी का एक हिस्सा है जिसे इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (आईएसईवी) दिशानिर्देशों के अनुसार, बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के बारे में अध्ययन में रिपोर्ट करने की आवश्यकता है। हालांकि, विभिन्न लक्षण वर्णन विधियां समान रूप से वैध हैं और स्थानीय उपलब्धता और व्यक्तिगत अनुसंधान प्रश्न के बारे में चुनी जानी चाहिए। विशेष रूप से, ब्याज या आयनीकरण विकिरण के पदार्थ की खुराक को परिभाषित करना प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है, जिसे सेल मृत्यु के पर्याप्त स्तर को प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक सत्यापन की आवश्यकता हो सकती है।
सामान्य तौर पर, उपचार पदार्थ, घुलनशील प्रोटीन और लिपोप्रोटीन के साथ अलग-थलग ईवी के संभावित संदूषण पर विचार किया जाना चाहिए। इस संबंध में एक रणनीति पूरक ईवी-अलगाव तकनीकों के साथ प्रयोग को पुन: उत्पन्न करने में शामिल है कि एक ही प्रकार का संदूषण 20 समझौता नहीं कर सकता है। Immunoaffinity, उदाहरण के लिए, विशुद्ध रूप से वर्षा-आधारित तरीकों की तुलना में कम उपज लेकिन उच्च विशिष्टता के साथ ईवी को अलग करता है और इस संबंध में एक उपयुक्त नियंत्रण प्रदान कर सकता है26। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण ईवी बायोजेनेसिस में शामिल जीन के एक विशिष्ट विलोपन के साथ आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कोशिकाओं से अलगाव के साथ जंगली-प्रकार के सेल-व्युत्पन्न ईवी की तुलना करना है या ईवी उत्सर्जन को कम करने वाले पदार्थों को तैनात करना है20।
इस प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों को ईवी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन द्वारा पूरक किया जाना चाहिए। विशेष रूप से CD8 + T कोशिकाओं का वर्गीकरण CD4427 के माध्यम से प्रभावक और effector स्मृति कोशिकाओं में, साथ ही साथ एंटीजन-भोले और केंद्रीय स्मृति कोशिकाओं, CD62L28 के माध्यम से, गहरी अंतर्दृष्टि व्यक्त कर सकता है। इसके अलावा, टी सहायक कोशिकाओं, नियामक टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं का विश्लेषण ब्याज का हो सकता है। ईवी की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, चूहों को ईवी टीकाकरण प्राप्त करने के बाद संबंधित कैंसर कोशिकाओं के साथ चुनौती दी जा सकती है या एक पूर्व-स्थापित कैंसर के खिलाफ ईवी के साथ इलाज किया जा सकता है, जिससे इस सेल-मुक्त ट्यूमर व्युत्पत्ति के लिए इम्युनोजेनिक सेल डेथ 2,29 का पता लगाने के लिए दिशानिर्देशों को अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, इन सभी प्रयोगात्मक सेटअपों से निष्कर्ष इस तथ्य से सीमित हैं कि पेट्री डिश में कैंसर कोशिकाएं संभावित रूप से एक गतिशील ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट 30 में एम्बेडेड कैंसर कोशिकाओं की तुलना में कार्यात्मक रूप से अलग ईवी उत्पन्न करती हैं जो अक्सर एंटी-कैंसर प्रतिरक्षा को दबाती हैं। इस प्रकार, ट्यूमर / फाइब्रोब्लास्ट कोकल्चर या पूर्व विवो ट्यूमर ऊतक से व्युत्पन्न ईवी का आकलन करना वास्तविक स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित कर सकता है। नैदानिक वास्तविकता की ओर एक अगले ट्रांसलेशनल कदम में, रोगी सामग्री से ईवी को बायोमार्कर के रूप में उनकी प्रयोज्यता का आकलन करने के लिए चिकित्सा से पहले और उसके दौरान इम्युनोजेनेसिटी के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।
जैसा कि कैंसर-व्युत्पन्न ईवी को हाल ही में पाया गया था - कुछ परिस्थितियों में - प्रतिरक्षा प्रणाली को संशोधित करना, उनकी नैदानिक क्षमता की खोज की यात्रा केवल शुरू हुई है31। इम्युनोजेनिक ईवी द्वारा सह-चुने गए प्रतिरक्षा तंत्र के गहन विश्लेषण के लिए, उपयोगी उपकरणों में विशिष्ट कोशिकाओं द्वारा ईवी अपटेक की कल्पना करने वाली प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, विशिष्ट प्रतिरक्षा मार्गों के लिए आनुवंशिक कमियों के साथ चूहों की तैनाती, और ईवी सामग्री में आणविक परिवर्तन के लिए स्क्रीनिंग विधियां शामिल हैं। आखिरकार, इम्युनोजेनिक ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवी की पहचान करना, यहां वर्णित स्क्रीनिंग विधियों के साथ, ईवी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा के पीछे अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ को सक्षम करेगा और इसलिए कैंसर के खिलाफ अपनी क्षमता का उपयोग करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का गठन करेगा।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा समर्थित किया गया था - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 और Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.) के लिए, जीवन देने के लिए DKMS फाउंडेशन से एक Mechtild Harf अनुसंधान अनुदान (H.P.) मेलेनोमा रिसर्च एलायंस (S.H.) द्वारा एक युवा अन्वेषक पुरस्कार, एक छात्रवृत्ति द्वारा एक छात्रवृत्ति-Kröner-Fresenius-Stiftung तकनीकी विश्वविद्यालय म्यूनिख द्वारा एक बीज निधि (एस.एच.) और विल्हेम सैंडर फाउंडेशन (2021.041.1, एस.एच.) द्वारा एक शोध अनुदान। एच.पी. EMBO युवा अन्वेषक कार्यक्रम द्वारा समर्थित है।
लेखक योगदान:
F.S., H.P., और S.H. ने अनुसंधान को डिजाइन किया, विश्लेषण किया, और परिणामों की व्याख्या की। एफ.एस. और एस.एच. ने पांडुलिपि लिखी। H.P. और S.H. ने अध्ययन का मार्गदर्शन किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
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