ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.
Abstract
Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is uitgegroeid tot een biotechnologisch platform dat transcriptie- en vertaalmachines in vitro vastlegt. Talrijke ontwikkelingen hebben het CFPS-platform toegankelijker gemaakt voor nieuwe gebruikers en hebben het scala aan toepassingen uitgebreid. Voor op lysaat gebaseerde CFPS-systemen kunnen celextracten worden gegenereerd uit een verscheidenheid aan organismen, waarbij de unieke biochemie van die gastheer wordt gebruikt om de eiwitsynthese te vergroten. In de afgelopen 20 jaar is Escherichia coli (E. coli) een van de meest gebruikte organismen geworden voor het ondersteunen van CFPS vanwege de betaalbaarheid en veelzijdigheid. Ondanks tal van belangrijke ontwikkelingen is de workflow voor de bereiding van E. coli-celextract een belangrijk knelpunt gebleven voor nieuwe gebruikers om CFPS voor hun toepassingen te implementeren. De workflow voor de voorbereiding van extracten is tijdrovend en vereist technische expertise om reproduceerbare resultaten te bereiken. Om deze barrières te overwinnen, meldden we eerder de ontwikkeling van een 24-uurs celvrije auto-inductie (CFAI) -workflow die de input van gebruikers en de vereiste technische expertise vermindert. De CFAI-workflow minimaliseert de arbeid en technische vaardigheden die nodig zijn om celextracten te genereren en verhoogt tegelijkertijd de totale hoeveelheden verkregen celextracten. Hier beschrijven we die workflow stap voor stap om de toegang te verbeteren en de brede implementatie van op E. coli gebaseerde CFPS te ondersteunen.
Introduction
Het gebruik van celvrije eiwitsynthese (CFPS) voor biotechnologische toepassingen is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen 1,2,3. Deze ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de toegenomen inspanningen om de processen die zich voordoen in CFPS en de rol van elk onderdeelte begrijpen 4,5. Bovendien hebben lagere kosten als gevolg van geoptimaliseerde opstellingen en alternatieve energiebronnen celvrije technologie gemakkelijker te implementeren gemaakt voor nieuwe gebruikers 6,7,8,9. Om de noodzakelijke transcriptie- en translatiefactoren voor eiwitsynthese te implementeren, wordt celextract vaak gebruikt om celvrije reactiesaan te sturen 10. Onlangs gepubliceerde gebruikershandleidingen hebben eenvoudige protocollen voor het produceren van functioneel extract, waardoor het gemakkelijker te implementeren is voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers 1,11,12,13,14. Celextract wordt meestal verkregen door de lysis van een celkweek, die kan worden gekweekt met behulp van verschillende organismen, afhankelijk van het specifieke gebruik dat gewenst is 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) is snel uitgegroeid tot een van de meest gebruikte gastheerorganismen voor de productie van functionele extracten17. De BL21 Star (DE3) stam heeft de voorkeur omdat het de proteasen uit het buitenmembraan (OmpT protease) en het cytoplasma (Lon protease) verwijdert, waardoor een optimale omgeving wordt geboden voor de recombinante eiwitexpressie. Bovendien bevat de DE3 het λDE3 dat het gen voor T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) draagt onder controle van de lacUV5-promotor; de stercomponent bevat een gemuteerd RNaseE-gen dat splitsing van mRNA 4,14,18,19 voorkomt. Onder de lacUV5-promotor maakt isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie de expressie van T7 RNAP20,21 mogelijk. Deze stammen worden gebruikt om cellen te kweken en te oogsten, die grondstof geven voor de bereiding van extracten. Cellyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, waaronder kralen kloppen, Franse pers, homogenisatie, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie 1,11,12,22.
Het proces van bacteriekweek en oogsten is consistent op de meeste platforms bij het gebruik van E. coli, maar vereist meerdere dagen en intensief toezicht van de onderzoeker 1,11,13. Dit proces begint over het algemeen met een nachtelijke zaadkweek in LB-bouillon, die bij nachtelijke groei vervolgens wordt ingeënt tot een grotere cultuur van 2xYTPG (gist, trypton, fosfaatbuffer, glucose) de volgende dag. De groei van deze grotere cultuur wordt gemonitord totdat deze de vroege tot midden logfase bereikt, bij een optische dichtheid (OD) van 2,514,20. Constante meting is vereist omdat eerder is aangetoond dat de componenten van transcriptie en translatie zeer actief zijn in de vroege tot midden logfase23,24. Hoewel dit proces reproduceerbare extracten kan creëren, heeft ons laboratorium onlangs een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, die het toezicht van onderzoekers vermindert, de totale opbrengst van extract voor een bepaalde liter celkweek verhoogt en de toegang tot E. coli-gebaseerde extractbereiding voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers verbetert (figuur 1 ). Hier bieden we de stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de CFAI-workflow, om binnen 24 uur van een gestreepte plaat cellen naar een voltooide CFPS-reactie te gaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media groei
- Bereid 960 ml CFAI-media zoals beschreven in tabel 1 en pas de pH aan op 7,2 met KOH.
- Breng de kweekmedia gedurende 30 minuten bij 121 °C over in een verbijsterde kolf en autoclaaf van 2,5 L.
- Bereid een suikeroplossing van 40 ml zoals beschreven in tabel 1. Filter-steriliseer de oplossing in een aparte geautoclaveerde glazen container.
OPMERKING: De suikeroplossing kan tot verder gebruik in een incubator van 30 °C worden bewaard. - Laat de media na autoclaveren volledig afkoelen tot onder de 40 °C.
- Voeg voorafgaand aan de inenting van de CFAI-media de suikeroplossing rechtstreeks toe aan de CFAI-media.
- Om de media te enten, veegt u een lus vol kolonies van een eerder gestreepte E. coli BL21 Star (DE3) plaat en plaatst u deze rechtstreeks in de media. Draai de lus in het medium, maar raak de zijkanten van de container niet aan. Zorg ervoor dat de streepplaat vers is, met levensvatbare cellen.
- Plaats de kolf met de ingeënte media in een incubator van 30 °C terwijl u bij 200 tpm schudt. Laat de cultuur van de ene op de andere dag groeien. Als cellen 's avonds worden geënt, bereikt de cultuur een geschatte optische dichtheid, gemeten bij 600 nm (OD600), van 10 de volgende ochtend. Inentings- en oogsttijden kunnen indien nodig worden aangepast.
2. Celoogst
- Bereid S30-buffer van tevoren voor en houd deze koud. Bereid de S30-buffer volgens tabel 2 voor op een uiteindelijke pH van 8,2.
OPMERKING: De S30-buffer kan dagen voor de celoogst worden voorbereid. Als dit gebeurt, bereid dan zonder dithiothreitol en bewaar bij 4 °C. Voeg dithiothreitol vlak voor gebruik toe. - Houd vanaf dit punt alle oplossingen en materialen op ijs. Breng 1 L media over in een centrifugefles van 1 L en centrifugeer bij 5.000 x g tussen 4-10 °C gedurende 10 minuten. Decanteer en gooi het supernatant weg. Breng met behulp van een steriele spatel de pellet over in een voorgekoelde en eerder gewogen conische buis van 50 ml.
- Was eenmaal met 30-40 ml koude S30-buffer door de pellet via vortexing in 30 s bursts met rustperioden op ijs opnieuw op te suspenderen.
OPMERKING: Vanwege een groter volume pellet kan het splitsen van de celkorrel in twee conische buizen van 50 ml nuttig zijn voor de wasstap. Het opslaan van cellen in kleinere aliquots biedt ook flexibiliteit voor de downstream-verwerking. - Centrifugeer de celresuspensie bij 5000 x g tussen 4-10 °C gedurende 10 minuten.
- Gooi het supernatant weg en veeg overtollige van de binnenwanden van de conische buis van 50 ml af met een schoon weefsel, vermijd het aanraken van de pellet zelf. Weeg en vries de pellet in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik.
OPMERKING: Pellets hoeven mogelijk niet te worden ingevroren als de gebruiker van plan is door te gaan met het protocol voor de bereiding van het extract.
3. Extract bereiding
- Combineer de bevroren pellet met 1 ml S30-buffer voor elke 1 g van de celkorrel en laat ongeveer 30-60 minuten op ijs ontdooien. Resuspend ontdooide pellet via vortexing in uitbarstingen van 30 s met rustperiodes op ijs. Vortex totdat er geen zichtbare klonten cellen overblijven.
OPMERKING: Kleinere klonten kunnen worden geresuspendeerd door te mengen met behulp van een pipet. - Breng aliquots van 1,4 ml celresuspensie over in microfugebuizen van 1,5 ml voor cellysis. Soniceer elke buis met een frequentie van 20 kHz en 50% amplitude voor drie uitbarstingen van 45 s met 59 s rust per cyclus omgeven door een ijsbad. Keer de buis tussen de cycli om en voeg onmiddellijk 4,5 μL 1 M dithiothreitol toe na de laatste ultrasoonapparaatcyclus.
OPMERKING: Vanwege de warmte die vrijkomt bij ultrasoonapparaat, is het uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat alle aliquots op ijs worden gehouden wanneer ze niet worden gesoniseerd. Het ijsbad moet constant worden aangevuld of groot genoeg zijn om koel te blijven gedurende het hele ultrasoonapparaatproces. - Centrifugeer elke buis bij 18.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Haal het supernatant en aliquot in 1,5 ml microfugebuizen in 600 μL aliquots. Flash vries aliquots in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik. Er moet voor worden gezorgd dat alleen het supernatant wordt gepimpt.
4. Celvrije eiwitsynthese
- Ontdooi één aliquot extract uit de vorige stap om 15 μL celvrije eiwitsynthesereacties uit te voeren in 1,5 ml microfugebuizen in quadruplicaat.
- Bereid elke reactie voor door 240 ng DNA (16 μg/ml eindconcentratie), 2,20 μl oplossing A, 2,10 μl oplossing B, 5,0 μl extract en een wisselend volume water van moleculaire kwaliteit te combineren om de reactie te vullen tot 15 μL. Deze reactie kan worden geschaald naar hogere volumes. Zie tabel 3 voor ratio's.
- Bereid oplossing A en B voor volgens tabel 4. Elke oplossing kan worden bereid in batches van 100 μL tot 1 ml, aliquoteerd en bewaard bij -80 °C tot verder gebruik.
OPMERKING: De hoeveelheid DNA kan variëren afhankelijk van het eiwit van belang. In dit geval is het gebruikte plasmide, pJL1-sfGFP, geoptimaliseerd om te presteren bij 16 μg / ml, of 597 μM.
- Bereid oplossing A en B voor volgens tabel 4. Elke oplossing kan worden bereid in batches van 100 μL tot 1 ml, aliquoteerd en bewaard bij -80 °C tot verder gebruik.
- Laat de reacties minstens 4 uur lopen bij 37 °C.
5. Kwantificering van reporter eiwit, super folder groen fluorescerend eiwit (sfGFP)
- Combineer met behulp van een half oppervlak 96-well zwarte polystyreenplaat 2 μL van elk celvrij eiwitsynthesereactieproduct met 48 μL van 0,05 M HEPES-buffer bij pH 7,2. Drie tot vier replicaties van elke reactiebuis worden aanbevolen.
- Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van de sfGFP met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm.
- Voor de omzetting van relatieve fluorescentie-eenheden naar volumetrische opbrengst (μg/ml) sfGFP, stel een standaardcurve vast met behulp van gezuiverde pJL1-sfGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het bereiden van CFAI-media werd glucose ingeruild voor een toename van lactose en glycerol als het belangrijkste energiesubstraat in de media. Daarnaast werd ook de buffercapaciteit van de CFAI-media verhoogd. Deze specifieke componenten zijn weergegeven in tabel 1.
De cellen werden vervolgens gekweekt tot zowel een OD600 van 10 als de standaard 2,5 in CFAI-media om consistentie met extractkwaliteit te tonen ondanks verschillende extracthoeveelheden. De 2,5 OD600 CFAI-media werden gekweekt na inenting uit een zaadkweek in LB-bouillon bij 37 °C, 200 tpm, terwijl de OD600 10-cultuur rechtstreeks uit een plaat werd geënt. Elke partij CFAI-media werd vervolgens gecontroleerd en geoogst op hun respectieve OD600. De groei tot een OD600 van 10 leidde tot een toename van een grotere hoeveelheid celpellets en totaal verkregen extract, omdat het 9,60 ml extract produceerde versus de 2,10 ml extract verkregen uit de groei tot 2,5 OD600 (figuur 2). Verdere analyse van de totale eiwitconcentratie toonde geen significant verschil in totaal eiwit in elk extract (tabel 5). Hoewel ze werden gekweekt tot verschillende niveaus van optische dichtheid, vertoonden beide batches extract vergelijkbare resultaten in celvrije reacties met behulp van sfGFP (figuur 3). Dit suggereert dat de combinatie van de verhoogde buffercapaciteit, het gebruik van lactose en glycerol als de belangrijkste koolstofbron en het implementeren van lactose in plaats van IPTG voor T7RNAP-inductie helpen bij het stabiliseren van extractgroei tot od600 onder 10.
| Geautoclaveerde CFAI Media: | |
| Onderdelen | Aantal |
| Tafelzout | 5.0 gr |
| Trypton | 20.0 gr |
| Gist Extract | 5.0 gr |
| Kaliumfosfaat, monobasisch | 6.0 gr |
| Kaliumfosfaat, dibasisch | 14.0 gr |
| NanopureTM Water | | Vul tot een totaal van 960 ml |
| Filter gesteriliseerde suikeroplossing: | |
| Onderdelen | Aantal |
| D-glucose | 0,50 g |
| D-lactose | 4.0 gr |
| 80% v / v Glycerol | 7,5 ml |
| NanopureTM Water | | 28,0 ml |
Tabel 1: CFAI-componenten. Componenten voor CFAI-media en suikeroplossingen met hun respectieve hoeveelheden. De media moeten worden geroerd tijdens de toevoeging van elk onderdeel en het suikeroplossingsfilter worden gesteriliseerd. Elke oplossing moet vóór de inenting aan een afzonderlijke steriele container worden toegevoegd.
| S30-buffer | |
| Onderdelen | Concentratie |
| Tris Acetaat pH 8,2 bij kamertemperatuur | 10 meter |
| Magnesiumacetaat | 14 meter |
| Kaliumacetaat | 60 meter |
| Dithiothreitol | 2 meter |
Tabel 2: S30 buffercomponenten: Componenten voor S30-buffer werden met hun respectieve hoeveelheden toegevoegd aan een steriele conische buis van 50 ml.
| Bestanddeel | Aantal |
| Oplossing A | 2,20 μL |
| Oplossing B | 2,1 μL |
| Extract | 5 μl |
| DNA Sjabloon | Volume voor 16 μg/ml finale |
| Water | Vul tot een totaal van 15 μL |
Tabel 3: CFPS-reactieverhoudingen: Relatieve volumepercentages voor oplossing A, oplossing B en extract. Het DNA-volume kan variëren afhankelijk van de concentratie van het specifieke plasmide en moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor het specifieke plasmide van de gebruiker dat wordt gebruikt.
| Oplossing A | Oplossing B | ||
| Onderdelen | Concentratie | Onderdelen | Concentratie |
| Atp | 1,2 mM | Magnesiumglutamaat | 10 meter |
| Gtp | 0,850 mM | Ammoniumglutamaat | 10 meter |
| Utp | 0,850 mM | Kaliumglutamaat | 130m |
| CTP | 0,850 mM | Fosfoenolpyruvaat (PEP) | 30 meter |
| Folinezuur | 31,50 μg/ml | L-Valine | 2 meter |
| Trna | 170,60 μg/ml | L-tryptofaan | 2 meter |
| Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) | 0,40 mM | L-Isoleucine | | 2 meter |
| Co-enzym A | 0,27 mM | L-Leucine | 2 meter |
| Oxaalzuur | 4,00 mM | L-cysteïne | 2 meter |
| Putrescine | | 1,00 mM | L-Methionine | 2 meter |
| Spermidine | 1,50 mM | L-Alanine | 2 meter |
| HEPES Buffer pH 7,5 | 57,33 mM | L-Arginine | 2 meter |
| L-Asparagine | | 2 meter | ||
| L-asparaginezuur | 2 meter | ||
| L-glutaminezuur | 2 meter | ||
| L-Glycine | 2 meter | ||
| L-glutamine | 2 meter | ||
| L-Histidine | 2 meter | ||
| L-Lysine | 2 meter | ||
| L-Proline | | 2 meter | ||
| L-Serine | 2 meter | ||
| L-Threonine | 2 meter | ||
| L-Fenylalanine | 2 meter | ||
| L-Tyrosine | 2 meter | ||
Tabel 4: Oplossing A- en B-componenten. Voorraadconcentraties voor de componenten voor oplossing A en B werden toegevoegd met hun respectieve hoeveelheden, elk in een microfugebuis van 1,5 ml.
| Extract | Totale eiwitconcentratie (μg/ml) | Standaarddeviatie |
| 2xYTPG 2,5 OD | 30617 | 3745 |
| CFAI 2,5 OD | 30895 | 2254 |
| CFAI 10.0 OD | 27905 | 3582 |
Tabel 5: Totale extracteiwitopbrengsten. Analyse van het totale eiwit van verschillende celextractgezwellen. De totale eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een Bradford Assay. Elke concentratie werd bepaald uit drielicaten met behulp van een verdunning van 1:40.
Figuur 1: Vergelijking van CFAI en typische workflow van cellen naar CFPS: Vergelijking van de totale tijdlijn van cellen naar CFPS met behulp van de (A) CFAI-workflow (links, rood) versus de (B) eerder vastgestelde methode (groen, rechts). De vergelijking toont het verminderde toezicht en de tijdlijn van onderzoekers bij het uitvoeren van CFPS met behulp van de CFAI-workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CFAI pellet grootte vergelijking. Vergelijking van CFAI-mediapellets na celoogst bij verschillende OD600. De media groeiden naar een OD600 van 2,5 produceerde een celkorrel van 2,23 g (links) en de media die werden gekweekt tot een OD600 van 10 produceerden een celkorrel van 9,49 g (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van groei op de GVBS-reactieopbrengsten. (A) Vergelijking van GVBS-reactieopbrengsten tussen gezwellen tot 2,5 OD600 en 10 OD600, met (B) afbeeldingen van elke CFPS-reactie boven hun respectieve opbrengst. Celvrije reacties werden uitgevoerd in een microfugebuis van 1,5 ml en gekwantificeerd na 24 uur incubatie bij 37 °C met behulp van een standaardcurve om fluorescentie te correleren met sfGFP-concentratie. Het "Negatief" komt overeen met de set negatieve controlereacties waarin geen sjabloon-DNA is toegevoegd. De traditionele 2xYTPG-media (de positieve controle) en de CFAI-extracten zijn van vergelijkbare kwaliteit als aangetoond door hun hoge CFPS-opbrengsten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toezicht door onderzoekers is traditioneel nodig voor twee belangrijke acties tijdens celgroei: de inductie van T7 RNAP en het oogsten van cellen bij een specifieke OD600. CFAI voorkomt beide vereisten om de tijd van de onderzoeker te verminderen en de technische training die nodig is om celextracten van hoge kwaliteit te bereiden. Auto-inductie van T7 RNAP wordt bereikt door glucose te vervangen door lactose als de primaire suiker in de media, waardoor de eerdere noodzaak om de groei actief te controleren en vervolgens met IPTG op een nauwkeurig punt tijdens de celgroei te induceren, wordt vermeden. De noodzaak om celculturen actief te monitoren om te oogsten bij een specifieke OD600 wordt ook weggenomen, waardoor de onderzoeker zich losmaakt van de celcultuur. Dit komt bovenop het recente werk dat ook de productie van kwaliteitsextracten heeft aangetoond die op niet-traditionele tijdstippen zijn geoogst 13,25,26. De nieuwe mediaformulering verbetert de buffercapaciteit en koolstofbronnen om het actieve energiemetabolisme te ondersteunen, zelfs als de celcultuur de stationaire fase nadert. De capaciteit om robuuste celextracten te verkrijgen uit hoge OD600-culturen stelt de onderzoeker in staat om de culturen op hun gemak te oogsten27. De workflow die we verkiezen en aanbevelen is om de cultuur 's avonds in te enten en de volgende ochtend terug te keren om te oogsten.
Het oogsten van cellen met een hogere OD600 resulteert ook in een aanzienlijk grotere hoeveelheid cellen verkregen voor extractbereiding. Voor ervaren onderzoekers is het vermeldenswaard dat de celkorrel veel donkerder van kleur is in vergelijking met cellen die zijn gekweekt in 2xYTPG-media, zelfs wanneer geoogst met een OD600 van 2,5. Het is ook belangrijk op te merken dat als de hele celkorrel in één keer wordt verwerkt, de grote hoeveelheid resuspensie die per celkorrel wordt verkregen bij het uitvoeren van lysis via ultrasoonapparaat enige tijd zal duren. Daarom is het belangrijk om alle aliquots koud te houden tijdens dit proces 11,13,14. De toename van het extractvolume per groei verlaagt de kosten proportioneel en ondersteunt biomanufacturing-toepassingen. Met de gedemonstreerde verbeteringen biedt de CFAI-workflow een eenvoudiger protocol voor nieuwe en ervaren gebruikers van celvrije technologie om reproduceerbare, functionele E. coli-extract te produceren.
Ondanks de voordelen van de aangeboden CFAI-media, zijn er beperkingen aan deze methode. De belangrijkste uitdaging is het ontluikende karakter van de workflow. Hoewel metabolomics-analyse licht heeft geworpen op de verschillen in CFAI OD600 10-extracten en reactieproducten in vergelijking met 2xYTPG, blijven de implicaties van deze verschillen op specifieke toepassingen niet gekarakteriseerd27. Daarnaast is deze workflow ontwikkeld voor BL21 E. coli-gebaseerd lysaat. Het is onduidelijk of de mediaherformulering een robuust extractpreparaat van andere E. coli-stammen zou ondersteunen, zoals de genomisch gehercodeerde stammen van E. coli28,29. Het is mogelijk dat de CFAI-benadering kan worden gebruikt voor het genereren van extracten van andere bacteriële organismen, maar het is onwaarschijnlijk dat het extractpreparaat voor eukaryote organismen zoals Chinese Hamster Ovary of konijnenreticulocyt ondersteunt; deze hebben echter hun eigen vastgestelde methoden30,31. We verwachten dat de eenvoud van de CFAI-workflow de barrières zal verminderen en de celvrije gemeenschap zal stimuleren om het nut ervan te karakteriseren en te evalueren voor het brede scala aan toepassingen dat CFPS ondersteunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Auteurs willen Dr. Jennifer VanderKelen en Andrea Laubscher bedanken voor technische ondersteuning. Auteurs willen ook Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington en Jillian Kasman bedanken voor de nuttige discussies. Auteurs erkennen ook de financieringssteun van het Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly en de National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al.
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
Tags
Bio-engineering Nummer 173Erratum
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
