O presente protocolo descreve detalhes experimentais concisos sobre a avaliação e interpretação dos dados de torque in vivo obtidos por estimulação elétrica do nervo peroneal comum em suínos anestesiados.
A avaliação confiável da força muscular esquelética é, sem dúvida, a medida de desfecho mais importante nos estudos de doenças neuromusculares e musculoesqueléticas e lesões, particularmente quando se avalia a eficácia das terapias regenerativas. Além disso, um aspecto crítico da tradução de muitas terapias regenerativas é a demonstração de escalabilidade e eficácia em um grande modelo animal. Várias preparações fisiológicas foram estabelecidas para avaliar propriedades da função muscular intrínseca em estudos científicos básicos, principalmente em pequenos modelos animais. As práticas podem ser categorizadas como: in vitro (fibras isoladas, feixes de fibras ou músculo inteiro), in situ (músculo com vascularização intacta e inervação, mas tendão distal ligado a um transdutor de força) e in vivo (estruturas do músculo ou unidade muscular permanecem intactas). Há pontos fortes e fracos em cada uma dessas preparações; no entanto, uma clara vantagem dos testes de força in vivo é a capacidade de realizar medições repetidas no mesmo animal. Aqui, são apresentados os materiais e métodos para avaliar de forma confiável o torque isométrico produzido pelos músculos dorsiflexor de escalada traseira in vivo em resposta à estimulação elétrica peroneal padrão em suínos anestesiados.
A função primária do músculo esquelético é produzir força, o que acaba por possibilitar atividades como respirar, comer e ambulação. Condições que reduzem a capacidade funcional do músculo esquelético podem levar à diminuição do desempenho (ocupacional ou esporte), incapacidade ou morte. Por exemplo, a manutenção da massa muscular e da função em populações envelhecidas está positivamente associada à qualidade de vida e à capacidade de realizar atividades básicas e instrumentais da vida diária 1,2. E, a diminuição da força muscular em pacientes com distrofia muscular de Duchenne resulta na incapacidade de ambulação e insuficiência respiratória, contribuindo para a mortalidade prematura 3,4,5. Assim, a medição da força muscular é uma medida de desfecho crítico em estudos envolvendo doença neuromuscular ou lesão.
O torque isométrico voluntário ou isozilítico máximo (e/ou índice de fadiga) é frequentemente usado como índice de capacidade funcional em estudos clínicos6. Em estudos em animais, medidas análogas podem ser feitas in vivo usando estimulação nervosa elétrica enquanto sob anestesia. Notavelmente, os preparativos in vivo são minimamente invasivos com musculatura, tendões, vasculatura e inervação permanecendo intactos e, portanto, permitem avaliações funcionais repetidas 7,8,9,10,11. Esta preparação é comumente usada em pequenos modelos de roedores e, em menor medida, em modelos animais maiores, como coelhos12, cães13,14, ovelhas15 e suínos16,17. O uso geral dessa metodologia pode ser impactante para muitos estudos de pesquisa translacional, como em modelos suínos geneticamente modificados (suínos) de atrofia muscular espinhal (SMA)18. Aqui, são apresentados métodos para avaliar o torque isométrico máximo induzido pela estimulação nervosa do grupo muscular dorsiflexor porcine in vivo. As técnicas apresentadas foram inicialmente adaptadas daquelas desenvolvidas originalmente para avaliar o torque muscular anterior do camundongo19,20 e posteriormente refinadas por experiência em investigação da capacidade de produção de torque após lesão 17,21,22,23,24,25,26,27,28 e durante o desenvolvimento16 em vários modelos suínos.
Este protocolo destaca a medição do torque isométrico in vivo utilizando uma metodologia que requer um computador integrado com uma célula de carga e estimulador elétrico. Os métodos aqui apresentados utilizam um aparelho de teste isométrico isométrico de suínos, aparelhos de plataforma e software correspondente (ver Tabela de Materiais). No entanto, a metodologia pode ser adaptada para usar outros softwares comercialmente disponíveis ou personalizados, dispositivos de aquisição de dados e estimuladores. Estes métodos destinam-se a ser utilizados em uma suíte cirúrgica de grande porte dedicada repleta de equipamentos padrão como: mesa cirúrgica de bloqueio, segunda mesa de bloqueio de altura igual para a plataforma de teste, respirador e dispositivos de monitoramento, e esteira de aquecimento ou outros dispositivos para manter a temperatura corporal.
São necessários os seguintes membros da equipe para conduzir esses métodos: um técnico de anestesia qualificado e dois funcionários de estudo para realizar o teste funcional. Essas pessoas trabalharão juntas para a estabilização inicial do membro no aparelho da plataforma. Em seguida, um dos dois funcionários será responsável pela colocação/posicionamento do eletrodo e o outro pelas aplicações do computador durante os testes.
Etapas críticas, modificações e solução de problemas
Para minimizar a variabilidade dos dados e maximizar o sucesso da abordagem, destacam-se as seguintes etapas críticas.
Estimulação nervosa ideal
Esta abordagem experimental começa com a despolarização do axônio nervoso e conta com a colocação correta do eletrodo e estimulação elétrica otimizada. Uma análise pós-morte da anatomia nervosa relacionada a marcos ósseos pode ajudar a visualizar a colocação adequada de eletrodos durante os testes. A aquisição de torque máximo de contração ajuda a determinar a corrente apropriada (em miliamperes; mA) entregue ao axônio nervoso. Existem dois valores a serem mente ao otimizar a estimulação nervosa no início dos testes: (1) a relação twitch-tetanic é ~1:5, por exemplo, ~2 N·m de torque de contração corresponde a um torque tetanic de 10 N·m (Figura 3); e (2) o torque típico para a massa corporal é de ~0,3 N·m por kg de massa corporal (Figura 4). Se os torques de contração de pico aparecerem baixos, remova os eletrodos e tente outra colocação. Certifique-se de verificar as configurações do estimulador, conexões BNC e conexões de eletrodos. A re-colocação do eletrodo pode ser necessária entre as contrações se houver muito movimento durante o posicionamento do membro entre ângulos articulares, como observado acima (Figura 2). Observe que abordagens experimentais e intervencionistas podem impactar esses valores.
Alinhamento biomecânico adequado
A duração do músculo inicial influencia a força contratil muscular (a relação comprimento-tensão), e o comprimento muscular pode mudar com base no alinhamento do quadril, joelho e articulação do tornozelo. Os ângulos articulares devem ser padronizados entre membros e entre os suínos. Um ângulo articular do tornozelo de 90° é fortemente recomendado para o quadril e joelho. Uma posição ligeiramente plantarflexada do tornozelo (~30° do ângulo neutro da articulação do tornozelo 0°) é ideal para a força máxima. Reflete a posição anatômica natural da articulação do tornozelo em suínos e cães em pé. Todas as articulações também devem ser paralelas aos transdutores de pedal e torque para evitar a perda de torque mensurável devido à contribuição de um vetor de torque perpendicular. Inspecionar os ângulos articulares do quadril-joelho-tornozelo e o alinhamento pé-pedal-articulação é fortemente recomendado depois de fixar o pé no pé-pedal e fixar a articulação do joelho com as barras de fixação do membro (Figura 1). Se houver desalinhamento, desbloqueie e remova as barras e reposicione o porco na mesa cirúrgica. Embora a padronização de ângulos conjuntos entre os estudos seja fundamental para minimizar a variância de dados, há limitações ao alinhamento biomecânico que são notáveis, discutidas abaixo.
Significância em relação aos métodos existentes ou alternativos
Exemplos alterativos de avaliações clinicamente relevantes e não invasivas da função muscular que poderiam ser usadas para modelos suínos incluem distância de caminhada da esteira, EMG e eletrografia de onda muscular ativa. Como o teste de caminhada de 6 minutos em humanos, um teste de caminhada na esteira pode avaliar a progressão da doença e o sucesso da intervenção em animais de grande porte 33,34,35. Normalmente, após um período de aclimatação, os animais são caminhados até o fim da conformidade em diferentes velocidades de esteira e/ou níveis inclinados. Recompensas alimentares são muitas vezes necessárias para alcançar a motivação máxima. No entanto, os resultados da caminhada na esteira oferecem apenas interpretações indiretas da função contratil muscular devido a limitações como motivação do sujeito, recrutamento de unidades motoras não máximas e co-dependência inerente a outros sistemas corporais, como os sistemas cardiovascular, esquelético e respiratório.
Por outro lado, a EMG oferece uma avaliação direta ligeiramente melhor do sistema muscular esquelético, uma vez que os eletrodos EMG são colocados diretamente no grupo muscular de interesse 36,37,38. Emg eletrodos então medem a atividade muscular coletiva (fibras musculares despolarizadas). Esta atividade muscular é baseada no recrutamento de unidades motoras e codificação de taxas (a frequência de potenciais de ação enviados para unidades motoras recrutadas). No entanto, separar as contribuições relativas do recrutamento de unidades motoras versus codificação de taxas é impossível com o EMG de superfície. Além disso, a EMG se baseia na disposição do sujeito para gerar contrações máximas, e esse nível de cooperação é improvável em modelos de animais grandes. Embora possa ser informativo avaliar alterações no EMG durante o ciclo de marcha, esses dados não representam uma capacidade funcional máxima do grupo de interesse muscular esquelético. A imagem baseada em ultrassom utilizando o modo B e a elastografia de ondas de cisalhamento é outra modalidade não invasiva usada para avaliar a função muscular. Há uma boa correlação entre o módulo de Young medido pela elastografia e o aumento das cargas musculares 39,40. A elastografia cisalhamento-onda foi validada e utilizada como medida quantitativa da rigidez passiva do tecido 41,42,43,44,45, inclusive em uma lesão de perda muscular volumétrica porcina modelo 23. Também pode ser usado como uma medição indireta da produção de força muscular ativa39. No entanto, ainda existem limitações semelhantes à EMG para a disposição do sujeito e a cooperação para a realização de contrações.
O protocolo in vivo descrito aqui, em contraste com a distância de caminhada da esteira e o EMG, fornece uma avaliação confiável, reprodutível e máxima da função muscular. Este protocolo evoca contrações musculares de forma controlada e quantificável independente da motivação. Especificamente, eletrodos percutâneos são usados para estimular axônios nervosos contornando o sistema nervoso central. A despolarização dos axônios nervosos envolve todas as unidades motoras eliminando a variabilidade associada ao recrutamento de unidades motoras. Além disso, o investigador controla a codificação da taxa (frequência de estimulação). A fisiologia neuromuscular resultante que se aplica a esta abordagem começa com a ativação do canal de sódio fechado por tensão nos nódulos de Ranvier. Toda a fisiologia subsequente (ou a jusante) está engajada, incluindo acoplamento excitação-contração e ciclismo transfronteiriço. Uma vantagem significativa da análise muscular in vivo não invasiva é que a função muscular contratil pode ser medida repetidamente, por exemplo, semanalmente, para monitorar a força muscular após lesão, intervenção ou sobre uma progressão da doença.
Limitações do método
O equipamento in vivo descrito neste protocolo permite o torque isométrico passivo e ativo como função de ângulo articular e frequência de estimulação. O aparelho de teste utilizado não suporta a medição de contrações dinâmicas (por exemplo, contrações excêntricas ou concêntricas isozitinas). O aparelho permite uma faixa de movimento de 105° para caracterizar a relação ângulo de torque-articulação e usa uma célula de carga com uma faixa máxima de torque de ~50 N·m. Questões experimentais específicas podem exigir características de desempenho fora dessas especificações. Notavelmente, a célula de carga deste aparelho descrito pode ser trocada por maiores faixas de torque, se necessário.
O protocolo aqui descrito para medir a força neuromuscular máxima in vivo tem limitações notáveis. Em primeiro lugar, este método requer anestesia, que pode ser conduzida de forma diferente por protocolos e recursos de instalações animais. Os anestésicos são conhecidos por ter efeitos variados na função neuromuscular e têm sido mostrados para alterar a produção de torque do rato in vivo dorsiflexor de forma anestésico e dependente de dose29. Os efeitos diferenciais dos anestésicos no binário in vivo de animais grandes não são claros; portanto, os grupos de controle e experimentais devem ter os mesmos agentes de anestesia (por exemplo, todos os grupos administrados cetamina) para controlar essa variabilidade. Em segundo lugar, a dependência de padrões de difusão in vivo limita a exploração de mecanismos celulares de disfunção contratil e toxicidades agudas de drogas. Por exemplo, a cafeína pode ser usada durante testes in vitro de banho de órgãos de um músculo isolado para estimular a liberação de cálcio órticulo sarcoplasmático, contornando o acoplamento de excitação-contração46 diretamente. A quantidade de cafeína para induzir esse efeito (mM) é letal em um ambiente in vivo . Influências medicamentosas em todo o corpo (por exemplo, estresse renal/hepático) e fatores subsequentes secretados em circulação precisarão ser considerados se essa abordagem for usada para triagem de drogas na força muscular aguda23. Em terceiro lugar, o uso de estimulação máxima do nervo elétrico desvia-se das estratégias de recrutamento voluntário, como discutido acima, e, portanto, não reflete mudanças de força que podem ser decorrentes de adaptações de recrutamento neuromuscular.
As medições de torque in vivo também podem ser limitadas no que diz respeito ao estabelecimento de um mecanismo específico para observações experimentais. Por exemplo, o torque sobre a articulação do tornozelo depende não apenas da produção de força muscular, mas também das propriedades do tendão e da articulação e do tecido conjuntivo. Além disso, a força é gerada por grupos de músculos, especificamente os flexores plantares (músculos gastrocnemius, soleus e plantaris) e os dorsiflexores (peroneus tertius, tibialis e músculos de digitorum) em suínos. Portanto, interpretações de dados máximos de torque in vivo requerem consideração de possíveis alterações musculotensas e anatômicas e se limitam a grupos musculares, não músculos individuais. Relacionados, os grupos musculares são frequentemente compostos por uma mistura de fibras predominantemente rápidas e lentas musculares, como o músculo gastrocnemius e soleus, respectivamente, dos flexores plantar. Propriedades contratuais, como taxa de contração e relaxamento (ou contração de tempo para pico e tempo de meia-descontração) não são indicadores confiáveis de fisiologia do tipo fibra usando preparações musculares in vivo versus isoladas, como protocolos de teste in vitro ou in situ 47. Preparações musculares isoladas também são superiores na compreensão da influência dos parâmetros biomecânicos na função muscular, pois propriedades como o comprimento muscular podem ser precisamente controladas; é importante ressaltar que a relação ângulo-torque articular não é diretamente equivalente à relação comprimento-força muscular, pois as propriedades do tendão (por exemplo, folga), músculo (por exemplo, ângulo de pennation, sobreposição de sarcomere) e articulação (por exemplo, braço de momento) que contribuem para a produção de torque dependem do ângulo articular. Para isso, o teste funcional in situ 48 pode ser uma adição valiosa aos testes in vivo, tendo em vista que o teste in situ é um experimento terminal. Outros avanços ao protocolo atual que podem ser explorados no futuro para melhorar a visão mecanicista dos achados experimentais incluem o uso de imagens no modo B do ultrassom para medir propriedades arquitetônicas musculares e tendinosas e a implantação de um transdutor de força tendão para medir a força muscular durante contrações voluntárias e eletricamente estimuladas49.
Importância e aplicações potenciais do método
Este protocolo avalia a capacidade de produção de torque in vivo do grupo muscular dorsiflexor suíno, demonstrando um método não invasivo para avaliar o ganho ou perda da função muscular em um ambiente fisiológico. Como a metodologia não é terminal para o suíno, também pode ser usada para avaliar a função muscular nos mesmos sujeitos longitudinalmente durante a progressão de uma doença, ou antes, durante, e seguindo uma estratégia de tratamento. Como tal, um projeto experimental de medidas repetidas pode permitir comparações estatísticas robustas com maior potência e menos animais em comparação com medidas independentes. Além disso, a disfunção muscular esquelética é um componente saliente de diversos processos e condições da doença, como o perda muscular associado à doença crônica (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, AIDS, câncer, etc.), distrofia muscular, doenças neurodegenerativas (por exemplo, Esclerose lateral Amiotrófica ou Amiotrófica; ELA), envelhecimento (ou seja, sarcopenia) e toxicidades medicamentosas. A capacidade funcional do músculo esquelético é uma medida crítica de desfecho primário para intervenções como exercícios, nutrição e terapias medicamentosas e medicina regenerativa. Assim, o protocolo aqui descrito para avaliar de forma confiável a capacidade de produção de torque suíno in vivo pode ser utilizado em inúmeras aplicações de estudo. Pode ser fundamental na aquisição de dados animais extensos para a tradução de terapias em desenvolvimento.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho e os dados apresentados foram amplamente apoiados pelo Comando de Pesquisa Médica e Material do Exército dos EUA para o BTC e SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); e o Departamento de Assuntos de Veteranos, Administração de Saúde de Veteranos, Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento (I21 RX003188) para JAC e Dr. Luke Brewster. Os autores reconhecem com gratidão o Serviço Veterinário USAISR e ramos de patologia comparativa e o Centro Avançado de Imagem Pré-Clínica umn para assistência técnica na conclusão desses estudos.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |