Настоящий протокол описывает краткие экспериментальные детали оценки и интерпретации данных о крутящем моменте in vivo , полученных с помощью электрической стимуляции общего малоберцового нерва у обезболенных свиней.
Надежная оценка силы скелетных мышц, возможно, является наиболее важным показателем результатов в исследованиях нервно-мышечных и скелетно-мышечных заболеваний и травм, особенно при оценке эффективности регенеративной терапии. Кроме того, критическим аспектом перевода многих регенеративных методов лечения является демонстрация масштабируемости и эффективности на большой животной модели. Различные физиологические препараты были созданы для оценки свойств внутренней мышечной функции в фундаментальных научных исследованиях, в первую очередь на моделях мелких животных. Практики могут быть классифицированы как: in vitro (изолированные волокна, пучки волокон или целые мышцы), in situ (мышцы с интактной васкуляризацией и иннервацией, но дистальное сухожилие, прикрепленное к преобразователю силы) и in vivo (структуры мышцы или мышечной единицы остаются нетронутыми). У каждого из этих препаратов есть свои сильные и слабые стороны; однако явным преимуществом испытаний на прочность in vivo является возможность выполнения повторных измерений на одном и том же животном. Здесь представлены материалы и методы достоверной оценки изометрического крутящего момента, создаваемого задними мышцами дорсифлексора in vivo в ответ на стандартную малоберцовую электрическую стимуляцию у обезболенных свиней.
Основной функцией скелетных мышц является выработка силы, что в конечном итоге делает возможными такие действия, как дыхание, еда и амбулация. Условия, которые снижают функциональную способность скелетных мышц, могут привести к снижению производительности (профессиональной или спортивной), инвалидности или смерти. Например, поддержание мышечной массы и функции у стареющих популяций положительно связано с качеством жизни и способностью выполнять основные и инструментальные действия повседневной жизни 1,2. А снижение мышечной силы у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна приводит к неспособности к амбулации и дыхательной недостаточности, что в конечном итоге способствует преждевременной смертности 3,4,5. Таким образом, измерение мышечной силы является критическим показателем результата в исследованиях, связанных с нервно-мышечными заболеваниями или травмами.
Максимальный произвольный изометрический или изокинетический крутящий момент (и/или индекс усталости) часто используется в качестве индекса функциональной способности в клинических исследованиях6. В исследованиях на животных аналогичные измерения могут быть сделаны in vivo с использованием электрической стимуляции нервов под наркозом. Примечательно, что препараты in vivo являются минимально инвазивными с мускулатурой, сухожилиями, сосудистой системой и иннервацией, остающимися нетронутыми и, следовательно, позволяют проводить повторные функциональные оценки 7,8,9,10,11. Этот препарат обычно используется в моделях мелких грызунов и в меньшей степени в более крупных моделях животных, таких как кролики12, собаки 13,14, овцы15 и свиньи16,17. Общее использование такой методологии может оказать влияние на многие трансляционные исследования, такие как генетически модифицированные модели спинальной мышечной атрофии (СМА)18. При этом представлены способы оценки максимального изометрического крутящего момента инстимуляции нервов группы мышц дорсифлексора свиней in vivo. Представленные методы были первоначально адаптированы из тех, которые были разработаны первоначально для оценки крутящего момента передней мышцы мыши19,20 и впоследствии усовершенствованы благодаря опыту исследования способности производить крутящий момент после травмы 17,21,22,23,24,25,26,27,28 и в ходе разработки16 в различных моделях свиней.
Этот протокол выделяет in vivo изометрическое измерение крутящего момента с использованием методологии, которая требует компьютера, интегрированного с тензодатчиком и электрическим стимулятором. Методы, представленные здесь, используют коммерчески доступный интегрированный аппарат для испытания изометрических подножек свиней, платформенный аппарат и соответствующее программное обеспечение (см. Таблицу материалов). Однако методология может быть адаптирована для использования другого коммерчески доступного или изготовленного на заказ программного обеспечения, устройств сбора данных и стимуляторов. Эти методы предназначены для использования в специализированном хирургическом комплексе для животных, изобилующем стандартным оборудованием, таким как: запирающий хирургический стол, второй запирающий стол равной высоты для испытательной платформы, вентилятор и устройства мониторинга, а также нагревательный мат или другие устройства для поддержания температуры тела.
Для проведения этих методов необходимы следующие члены команды: один квалифицированный анестезиолог и два исследовательских персонала для выполнения функционального тестирования. Эти люди будут работать вместе для первоначальной стабилизации конечности на платформе аппарата. Затем один из двух сотрудников будет отвечать за размещение / позиционирование электрода, а другой – за компьютерные приложения во время тестирования.
Критические шаги, изменения и устранение неполадок
Для сведения к минимуму изменчивости данных и максимизации успеха подхода выделяются следующие важнейшие шаги.
Оптимальная стимуляция нервов
Этот экспериментальный подход начинается с деполяризации аксона нерва и опирается на правильное размещение электродов и оптимизированную электрическую стимуляцию. Посмертный анализ анатомии нервов, связанных с костными ориентирами, может помочь визуализировать правильное размещение электродов во время тестирования. Получение максимального крутящего момента подергивания помогает определить соответствующий ток (в миллиамперах; мА), подаваемый на нервный аксон. При оптимизации стимуляции нервов в начале тестирования следует иметь в виду два значения: (1) отношение подергивания к тетанику составляет ~1:5, например, ~2 Н·м крутящего момента соответствует 10 Н·м тетаникового крутящего момента (рисунок 3); и (2) типичный крутящий момент к массе тела составляет ~0,3 Н·м на кг массы тела (рисунок 4). Если пиковые крутящие моменты подергивания кажутся низкими, снимите электроды и попробуйте другое размещение. Обязательно проверьте настройки стимулятора, соединения BNC и подключения электродов. Повторное размещение электрода может потребоваться между сокращениями, если во время позиционирования конечности между углами сустава происходит слишком большое движение, как отмечалось выше (рисунок 2). Обратите внимание, что экспериментальные и интервенционные подходы могут повлиять на эти значения.
Правильное биомеханическое выравнивание
Начальная длина мышц влияет на сократительную силу мышц (соотношение длина-напряжение), а длина мышц может изменяться в зависимости от выравнивания тазобедренного, коленного и голеностопного суставов. Углы сустава должны быть стандартизированы между конечностями и среди свиней. Угол голеностопного сустава 90° настоятельно рекомендуется для бедра и колена. Слегка подошвенное положение лодыжки (~ 30 ° от нейтрального угла голеностопного сустава 0 °) оптимально для пиковой силы. Он отражает естественное анатомическое положение голеностопного сустава как у свиней, так и у собак стоя. Все соединения также должны быть параллельны ножной педали и датчикам крутящего момента, чтобы избежать потери измеримого крутящего момента из-за вклада перпендикулярного вектора крутящего момента. Проверка углов тазобедренного-коленно-голеностопного суставов и выравнивания стопы-педали-сустава настоятельно рекомендуется после закрепления стопы на ножной педали и закрепления коленного сустава с помощью зажимных стержней конечности (рисунок 1). Если есть перекос, разблокируйте и снимите бруски и переместите свинью на хирургический стол. Хотя стандартизация совместных углов в исследованиях имеет решающее значение для минимизации дисперсии данных, существуют ограничения на биомеханическое выравнивание, которые являются заметными, обсуждаемыми ниже.
Значение по отношению к существующим или альтернативным методам
Альтернативные примеры клинически значимых и неинвазивных оценок мышечной функции, которые могут быть использованы для моделей свиней, включают дистанцию ходьбы на беговой дорожке, ЭМГ и активную электрографию мышечных сдвиговых волн. Как и тест на 6-минутную ходьбу у людей, тест на ходьбу на беговой дорожке может оценить прогрессирование заболевания и успех вмешательства у крупных животных 33,34,35. Как правило, после периода акклиматизации животных выгуливают до конца соответствия на разных скоростях беговой дорожки и/или уровнях наклона. Пищевые вознаграждения часто необходимы для достижения максимальной мотивации. Тем не менее, результаты ходьбы на беговой дорожке предлагают только косвенные интерпретации сократительной функции мышц из-за таких ограничений, как мотивация субъекта, немаксимальный набор двигательных единиц и присущая им созависимость от других систем организма, таких как сердечно-сосудистая, скелетная и дыхательная системы.
С другой стороны, ЭМГ предлагает немного лучшую прямую оценку системы скелетных мышц, так как электроды ЭМГ размещаются непосредственно на интересующей группе мышц 36,37,38. Затем электроды ЭМГ измеряют коллективную мышечную активность (деполяризованные мышечные волокна). Эта мышечная активность основана на наборе двигательных единиц и кодировании скорости (частота потенциалов действия, посылаемых на набранным двигательным единицам). Однако разделение относительного вклада набора двигательных единиц и кодирования скорости невозможно с помощью поверхностной ЭМГ. Кроме того, ЭМГ опирается на готовность субъекта генерировать максимальные сокращения, и такой уровень сотрудничества маловероятен в моделях крупных животных. Хотя оценка изменений ЭМГ во время цикла походки может быть информативной, эти данные не представляют максимальную функциональную способность интересующей группы скелетных мышц. Ультразвуковая визуализация с использованием B-моды и эластографии сдвиговых волн является еще одним неинвазивным методом, используемым для оценки мышечной функции. Существует хорошая корреляция между модулем Юнга, измеренным эластографией, и увеличением мышечных нагрузок39,40. Эластография сдвиговых волн была проверена и использована в качестве количественной меры пассивной жесткости тканей 41,42,43,44,45, в том числе в модели23 повреждения объемной мышечной потери свиней. Он также может быть использован в качестве косвенного измерения активной выработки мышечной силы39. Тем не менее, ограничения, подобные ЭМГ, для готовности субъекта и сотрудничества для выполнения сокращений все еще присутствуют.
Протокол in vivo, описанный здесь, в отличие от дистанции ходьбы на беговой дорожке и ЭМГ, обеспечивает надежную, воспроизводимую и максимальную оценку мышечной функции. Этот протокол вызывает мышечные сокращения контролируемым, поддающимся количественной оценке способом, который не зависит от мотивации. В частности, чрескожные электроды используются для стимуляции нервных аксонов в обход центральной нервной системы. Деполяризация нервных аксонов задействует все двигательные единицы, устраняя изменчивость, связанную с набором двигательных единиц. Кроме того, исследователь контролирует кодирование скорости (частоту стимуляции). Полученная нервно-мышечная физиология, которая применяется к этому подходу, начинается с активации натриевого канала с напряжением в узлах Ранвье. Задействована вся последующая (или нисходящая) физиология, включая связь возбуждение-сокращение и поперечный цикл. Существенным преимуществом неинвазивного анализа мышц in vivo является то, что функция сократительных мышц может быть измерена многократно, например, еженедельно, для мониторинга мышечной силы после травмы, вмешательства или прогрессирования заболевания.
Ограничения метода
Оборудование in vivo , описанное в этом протоколе, допускает пассивный и активный изометрический крутящий момент в зависимости от угла соединения и частоты стимуляции. Используемая испытательная аппаратура не поддерживает измерение динамических сокращений (например, изокинетических эксцентрических или концентрических сокращений). Аппарат допускает диапазон движения 105° для характеристики отношения угла крутящего момента и шарнира и использует тензодатчик с максимальным диапазоном крутящего момента ~50 Н·м. Конкретные экспериментальные вопросы могут потребовать эксплуатационных характеристик за пределами этих спецификаций. Примечательно, что тензодатчик на этом описанном устройстве может быть заменен на большие диапазоны крутящего момента, если это необходимо.
Протокол, описанный в настоящем описании для измерения максимальной нервно-мышечной силы in vivo , имеет заметные ограничения. Во-первых, этот метод требует анестезии, которая может проводиться по-разному в зависимости от протоколов и ресурсов животного учреждения. Известно, что анестетики оказывают различное влияние на нервно-мышечную функцию и, как было показано, изменяют выработку крутящего момента дорсифлексора мыши in vivo анестетиком и -дозозависимым способом29. Дифференциальное воздействие анестетиков на крутящий момент in vivo крупного животного неясно; поэтому контрольные и экспериментальные группы должны иметь одни и те же агенты анестезии (например, все группы, вводимые кетамином) для контроля этой изменчивости. Во-вторых, зависимость от паттернов диффузии in vivo ограничивает исследование клеточных механизмов сократительной дисфункции и острой токсичности лекарств. Например, кофеин может быть использован во время тестирования изолированной мышцы в органе in vitro для стимуляции высвобождения кальция саркоплазматического ретикулума, минуя непосредственно связь возбуждения-сокращения46 . Количество кофеина, вызывающего этот эффект (мМ), смертельно опасно в условиях in vivo . Лекарственное воздействие на весь организм (например, стресс почек / печени) и последующие факторы, секретируемые в кровообращение, необходимо будет учитывать, если этот подход используется для скрининга лекарств на острую мышечную силу23. В-третьих, использование максимальной электрической стимуляции нервов отклоняется от добровольных стратегий вербовки, как обсуждалось выше, и, следовательно, не отражает изменения в силе, которые могут быть вызваны нервно-мышечной адаптацией к набору.
Измерения крутящего момента in vivo также могут быть ограничены в отношении установления конкретного механизма экспериментальных наблюдений. Например, крутящий момент вокруг голеностопного сустава зависит не только от выработки мышечной силы, но и от свойств сухожилия и сустава и соединительной ткани. Кроме того, сила генерируется группами мышц, в частности подошвенными сгибателями (икроножные, камбаловидные и подошвенные мышцы) и дорсифлекторами (peroneus tertius, tibialis и digitorum мышцы) у свиней. Поэтому интерпретации максимальных данных о крутящем моменте in vivo требуют рассмотрения потенциальных мышечно-мышечных и анатомических изменений и ограничиваются группами мышц, а не отдельными мышцами. Соответственно, группы мышц часто состоят из смеси преимущественно быстрых и медленных мышечных волокон, таких как икроножная и камбалочная мышцы, соответственно, подошвенных сгибателей. Сократительные свойства, такие как скорость сокращения и расслабления (или время сокращения до пика и время полурелаксации), не являются надежными показателями физиологии типа волокон с использованием in vivo по сравнению с изолированными мышечными препаратами, такими как протоколы тестирования in vitro или in situ 47. Изолированные мышечные препараты также превосходят в понимании влияния биомеханических параметров на функцию мышц, поскольку такие свойства, как длина мышц, можно точно контролировать; Важно подчеркнуть, что соотношение угол сустава к крутящему моменту не является прямо эквивалентным соотношению длина мышцы-сила, поскольку свойства сухожилия (например, слабины), мышцы (например, угол пеннации, перекрытие саркомера) и сустава (например, момент руки), которые способствуют производству крутящего момента, зависят от угла сустава. С этой целью функциональное тестирование48 на крупных животных in situ может стать ценным дополнением к тестированию in vivo, учитывая, что тестирование in situ является терминальным экспериментом. Другие достижения в текущем протоколе, которые могут быть изучены в будущем для улучшения механистического понимания экспериментальных результатов, включают использование ультразвуковой визуализации B-режима для измерения архитектурных свойств мышц и сухожилий и имплантацию датчика силы сухожилия для измерения мышечной силы во время произвольных и электрически стимулированных сокращений49.
Важность и потенциальные области применения метода
Этот протокол оценивает in vivo крутящую способность группы мышц дорсифлексора свиней, демонстрируя неинвазивный метод оценки усиления или потери мышечной функции в физиологических условиях. Поскольку методология не является терминальной для свиньи, она также может быть использована для оценки мышечной функции у тех же субъектов продольно во время прогрессирования заболевания или до, во время и после стратегии лечения. Таким образом, экспериментальный дизайн повторных измерений может позволить провести надежные статистические сравнения с большей мощностью и меньшим количеством животных по сравнению с независимыми показателями. Кроме того, дисфункция скелетных мышц является заметным компонентом различных болезненных процессов и состояний, таких как хроническое истощение мышц, связанное с хроническим заболеванием (например, сердечная недостаточность, почечная недостаточность, СПИД, рак и т. Д.), Мышечная дистрофия, нейродегенеративные заболевания (например, СМА или боковой амиотрофический склероз; БАС), старение (т.е. саркопения) и лекарственная токсичность. Функциональная способность скелетных мышц является критически важным первичным показателем исхода для таких вмешательств, как физические упражнения, питание, а также медикаментозная и регенеративная терапия. Таким образом, протокол, описанный в настоящем описании для надежной оценки производительности крутящего момента свиней in vivo , может быть использован в многочисленных исследовательских приложениях. Это может сыграть важную роль в получении обширных данных о животных для трансляции развивающихся методов лечения.
The authors have nothing to disclose.
Работа и представленные данные были широко поддержаны Командованием медицинских исследований и материалов армии США для BTC и SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); и Департамент по делам ветеранов, Управление здравоохранения ветеранов, Управление исследований и разработок (I21 RX003188) при JAC и д-ра Люка Брюстера. Авторы с благодарностью выражают благодарность Ветеринарной службе USAISR и отделениям сравнительной патологии и Центру передовой доклинической визуализации UMN за техническую помощь в завершении этих исследований.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |