Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell in vitro-modell for brystkreftforskning

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

Krysstale mellom pattedyr epitelceller og endotelceller bidrar viktig til brystkreftprogresjon, tumorvekst og metastase. I denne studien er sfæroider laget av brystkreftceller sammen med vaskulære og/eller lymfatiske endotelceller og viser deres anvendbarhet som et in vitro-system for brystkreftforskning.

Abstract

Brystkreft er den ledende årsaken til dødelighet hos kvinner. Veksten av brystkreftceller og deres påfølgende metastase er en nøkkelfaktor for progresjonen. Selv om mekanismene for å fremme brystkreftvekst har blitt intensivt studert ved hjelp av monokulturer av brystkreftceller som MCF-7-celler, har bidraget fra andre celletyper, som vaskulære og lymfatiske endotelceller som er intimt involvert i tumorvekst, ikke blitt undersøkt i dybden. Cellecelleinteraksjon spiller en nøkkelrolle i tumorvekst og progresjon. Neoangiogenese, eller utvikling av fartøy, er avgjørende for tumorvekst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kreftcellemigrasjon og påfølgende metastase. Nyere studier gir bevis på at vaskulære og lymfatiske endotelceller kan påvirke kreftcelleveksten betydelig. Disse observasjonene innebærer et behov for å utvikle in vitro-modeller som mer realistisk vil gjenspeile brystkreftvekstprosesser in vivo. Videre krever restriksjoner i dyreforskning utvikling av ex vivo-modeller for å belyse bedre mekanismene som er involvert.

Denne artikkelen beskriver utviklingen av brystkreft sfæroider sammensatt av både brystkreftceller (østrogenreseptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfatiske endotelceller. Protokollen beskriver en detaljert trinnvis tilnærming til å lage tocellede sfæroider ved hjelp av to forskjellige tilnærminger, hengende fall (gullstandard og billig) og 96-brønns U-bunnplater (dyrt). Grundige instruksjoner er gitt for hvordan du delikat kan plukke opp de dannede sfæroidene for å overvåke vekst ved mikroskopisk størrelse og vurdere levedyktighet ved hjelp av død og levende cellefarging. Videre avgrenses prosedyrer for å fikse sfæroidene for seksjonering og farging med vekstspesifikke antistoffer for å skille vekstmønstre i sfæroider. I tillegg er detaljer for å forberede sfæroider med transfekterte celler og metoder for å trekke ut RNA for molekylær analyse gitt. Til slutt gir denne artikkelen grundige instruksjoner for å forberede flercellede sfæroider for brystkreftforskning.

Introduction

Bruken av dyr til eksperimenter har begrensninger. Dyrestudier kan ikke nøyaktig etterligne sykdomsprogresjon hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske svar på patogener. I tillegg er restriksjoner i dyreforsøk på grunn av bekymringer for dyrelidelse og etiske problemer1,2 i økende grad begrense forskningsprogrammer. In vitro systemer har blitt mye utviklet for å omgå bruken av dyr; Videre har bruken av humane celler gjort at in vitro modeller som er mer relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøkelsen. Konvensjonelle monolayer (2D) cellekulturer er mye brukt fordi de etterligner menneskelig vev til en viss grad. Imidlertid klarer ikke 2D-monokulturer å etterligne menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til å simulere det komplekse mikromiljøet i de opprinnelige organene og etterligne in vivo situasjon3,4,5,6. I tillegg, i monolayer cellekulturer, narkotika behandlinger kan lett ødelegge / skade alle cellene. Det er viktig at noen av disse begrensningene overvinnes ved å bytte til tredimensjonale cellekulturer med flere lag (3D)7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist seg å bedre gjenspeile cellulær struktur, layout og funksjon av celler i primærvev. Disse 3D-kulturene kan dannes ved hjelp av en rekke cellelinjer, som ligner et funksjonelt organ. Faktisk er det to modeller av 3D-kulturer. En modell produserer sfæroider av aggregerte celler som danner klynger og omorganiserer dem til sfærer (stillasfrie modeller). Den andre gir organoider, som har en mer kompleks struktur og består av kombinasjoner av flere organspesifikke celler, som betraktes som en miniatyrversjon av organer.9,10. På grunn av dette representerer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske applikasjoner. Dermed har sfæroider og organoider mange anvendelser for sykdomsmodellering og studier relatert til regenerativ medisin, legemiddelscreening og toksikologiske studier.6,11,12,13,14,15. Kreftfremkallende sfæroider, avledet fra 3D-teknologi, gjenskaper morfologien og fenotypen til relevante celletyper, etterligner in vivo tumormikromiljø, og modellcellekommunikasjon og signalveier som er operative under tumorutvikling16,17,18. I tillegg, for å forbedre kreftbiologiforståelsen, kan tumorsfæroider/organoider også brukes til å identifisere en potensiell pasientspesifikk antikreftbehandling (personlig) og vurdere effekt, toksisitet og langsiktige effekter.19,20,21,22. Sfæroider har åpnet fremtredende muligheter for å undersøke patofysiologi, sykdomsmodellering og legemiddelscreening på grunn av deres evne til å bevare cellulær og tredimensjonal vevsarkitektur, evnen til å etterligne in vivo og cellecelleinteraksjonene. Imidlertid må man også være klar over begrensningene i dette systemet, for eksempel mangel på vaskulær / systemisk komponent, funksjonelt immun- eller nervesystem, og systemet representerer en reduksjonistisk tilnærming sammenlignet med dyremodeller. Faktisk, i motsetning til dyremodeller, gir 3D-strukturer bare en tilnærming av biologien i en menneskekropp. Å forstå begrensningene i 3D-metoden kan hjelpe forskere med å designe mer raffinerte og gyldige prosesser for å produsere sfæroider som bedre representerer et organ i større skala.23,24,25.

Kreft er den ledende dødsårsaken over hele verden, og brystkreft er den vanligste kreftformen hos kvinner26,27,28. For å etterligne den komplekse mikromiljøet av brystkreft, bør brystkreftsfæroider dyrkes ved hjelp av celler som spiller en fremtredende rolle i brysttumorer, det vil si epitelceller, endotelceller, fibroblaster og / eller immunceller. Videre, for en sfæroid som representerer brystkreft, bør uttrykket av kvinnelige hormonreseptorer (østrogen / progesteronreseptorer), evne til å bevare pasientens tumor histologisk status, og evne til å etterligne respons på terapi også vurderes. Studier har vist at 3D-samkultursystemer har en cellulær organisasjon som ligner på det primære vevet in vivo, har evnen til å reagere i sanntid på stimuli, og har funksjonelle androgenreseptorer29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilnærming være nyttig for å etterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nåværende protokollen er å etablere en ny metode for å generere brystkreftsfæroider. Denne metoden benytter østrogenreseptorpositive MCF-7-celler (en udødeliggjort human cellelinje av epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVEC) eller lymfatiske endotelceller (HMVEC-DNeo) for å lage en modell som etterligner eller reflekterer samspillet mellom disse cellene i en svulst. Selv om MCF-7 (østrogenresponsive) og endotelceller har blitt brukt til å utvikle sfæroider i den nåværende studien, kan andre celler som fibroblaster som representerer ~ 80% av brystsvulstmassen, også kombineres i fremtiden for bedre å representere og etterligne brystsvulst.

Det finnes flere metoder for å danne sfæroider, for eksempel: 1) den hengende dråpemetoden som bruker tyngdekraften33,34; 2) den magnetiske levitasjonsmetoden som bruker magnetiske nanopartikler utsatt for en ekstern magnet35, og 3) sfæroidmikroplatemetoden som utføres av såingsceller på lavfesteplater36,37. På grunnlag av de eksisterende metodene, som bare bruker en celletype, har den nåværende protokollen blitt optimalisert ved hjelp av epitelceller og endotelceller for bedre å etterligne vekstforholdene til brystkreftsvulster i vivo38,39,40,41. Denne metoden kan enkelt oppnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale utstyrskrav. Basert på laboratoriets behov/mål ble ulike tilnærminger brukt til å danne sfæroider og få relevant cellulært materiale fra disse sfæroidene. I denne sammenhengen, for DNA-, RNA- eller proteinanalyse, produseres 3D-sfæroidene ved å kokulturere endotelceller og epitelceller med hengende dråpemetode. Men for funksjonelle studier, for eksempel for å overvåke cellevekst etter kort forstyrrende (siRNA) transfeksjon og / eller hormonbehandling, genereres sfæroidene ved hjelp av U-bunnplater.

Formålet med denne tekniske protokollen er å gi en detaljert trinnvis beskrivelse for 1) som danner multicellulære sfæroider av brystkreft, 2) forberede prøver for histologisk farging, og 3) samling av celler for utvinning av RNA, DNA og proteiner. Både den billige hengende dråpemetoden og de dyrere U-bunnplatene brukes til å danne sfæroider. Her er det gitt en protokoll for å forberede (fikse) sfæroider for seksjonering og påfølgende immunostaining med markører for å vurdere celleproliferasjon, apoptose og distribusjon av epitelceller og endotelceller i en sfæroid. I tillegg viser denne protokollen en komplett trinnvis analyse av histologiske data ved hjelp av ImageJ-programvare. Tolkning av biologiske data varierer avhengig av type eksperiment og antistoffene som brukes. Seksjonering av faste sfæroider og etterfølgende farging av seksjonene ble utført av et rutinemessig patologilaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

MERK: Utfør cellehåndtering under sterile forhold.

  1. Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC) subkultur
    1. Strøk 75 cm2 kolber med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) over natten (ON) ved romtemperatur (RT) eller 2-3 t ved 37 °C, skyll med vann og la kolben tørke.
    2. Vokse HUVECs i vekstmedium (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) supplert med glutamin (1x = 2 mM), antibiotika-antimykotisk løsning (AA; 100 μg/ml streptomycin, 100 μg/ml penicillin og 0,025 μg/ml amfotericin B), LSGS (2 % v/v FCS, 1 μg/ml hydrokortison, 10 ng/ml menneskelig epidermal vekstfaktor, 3 ng/ml av menneskets grunnleggende fibroblastvekstfaktor, 10 μg/ml heparin) og 10 % FCS (Fetal Calf Serum) under standard vevskulturforhold (37 °C, 5 % CO2). Endre mediet annenhver dag til cellene når 70%-80% samløp.
    3. Vask de subsamlende kulturene med 5 ml HBSS (uten Ca2+ og Mg2+) og tilsett 3 ml trypsin (0,25% fortynnet i HBSS (uten Ca2+ og Mg2+)).
      MERK: HBSS kan også erstattes med PBS.
    4. Inkuber cellene ved 37 °C i 2 minutter (kontroller mikroskopisk om cellene er løsnet og avrundet opp) og stopp avløsningsreaksjonen ved å tilsette 6 ml 10 % FCS-medium (DMEM-F12 eller EBM-2, 10 % FCS).
    5. Sentrifuger cellefjæringen ved 250 x g i 5 minutter ved RT og kast supernatanten.
    6. Suspender cellene i vekstmedium og frø i 75 cm2 kolber eller kulturretter.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, humane bryst adenokarsinomceller) subkultur
    1. Vokse menneskelige brystkreft cellelinjer i 75 cm2 kolber i vekstmedium (DMEM / F12 medium supplert med en kommersiell glutamin (1x), antibiotika-antimykotisk løsning (AA; 100 μg/ml streptomycin, 100 μg/ml penicillin og 0,025 μg/ml amfotericin B) og 10 % FCS under standard vevskulturforhold (37 °C, 5 % CO2). Bytt medium hver 2-3 dager.
    2. Vask underkonfluente cellekulturene (70%-80% sammenløp) med 5 ml HBSS (uten Ca2+ og Mg2+) og tilsett 3 ml trypsin (0,5% fortynnet i HBSS (uten Ca2 + og Mg2 +) ved 37 °C i 5 (min. mikroskopisk kontrollere at cellene er løsrevet).
      MERK: HBSS kan også erstattes med PBS.
    3. Tilsett 8 ml 10 % FCS-medium for å stoppe avløsningsreaksjonen, sentrifuger ved 250 x g i 5 minutter ved RT og kast supernatanten.
    4. Suspender pelletsen i vekstmedium og tallerken i 75 cm2 kolber eller kulturretter.

2. Sfæroiddannelse

  1. Plate 5 x 105 celler/ml (HUVEC og MCF-7) i en 3,5 cm rund tallerken og kultur i 48 timer.
  2. Behandle eller transfekt de belagte cellene i 24 timer eller etter ønske.
  3. Valgfritt trinn utført i 96-brønns U-bunnplate: Vask cellene med 1 ml HBSS(Ca. 2+ og Mg2+) og flekk HUVEC med et blått fargestoff (0,5 μg/ml) og MCF-7 celler ved hjelp av et grønt fargestoff (0,5 μM) fortynnet i det respektive vekstmediet og plasser i en 37 °C og 5 % CO2-inkubator i 30–40 minutter.
  4. Vask cellene med 1 ml HBSS (uten Ca2+ og Mg2+),tilsett 1 ml enzymatisk avløsningsreagens (0,25% trypsin for HUVEC og 0,5% trypsin for MCF-7) til hver runde tallerken ved hjelp av en P1000 pipette, og inkuber deretter i 2-5 min til cellene er løsnet.
  5. Samle hver celletype separat i et 5 ml rundbunns polystyrenrør og tilsett 1 ml 10% FCS-medium ved hjelp av en P1000 pipette for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Sentrifuger cellesuspensjonene ved 250 x g i 5 minutter.
  6. Aspirer forsiktig supernatanten og suspender cellene i 1 ml steroidfritt medium (EBM-2, glutamin , antibiotika-antimykotisk, 0,4% FCS sf (kull-strippet)).
    MERK: Steroidfritt medium kan erstattes med normalt vekstmedium.
  7. Bruk 100 μL av hver celleoppheng fortynnet med 10 ml fortynningsmiddel II (se Materialfortegnelse) for å bestemme det totale cellenummeret og beregne mengden behandlingsmedium (EBM-2, glutamin, antibiotika-antimykotisk, 0,4% FCS sf, kjøretøy /behandling) nødvendig for å oppnå en celle suspensjon på 5 x 103 celler / ml eller 3,4 x 105 celler / ml per celletype.
    1. Antall celler
      1. Slå på maskinen og skyll ved å trykke på funksjons- og startknappene (oppsett S3), med Fortynnings II-oppløsning i et hetteglass med celleteller.
      2. Bruk oppsett S4 og trykk start for å måle det tomme med fersk Diluent II-løsning.
      3. Endre hetteglasset med scintillasjon med 100 μL celleoppheng i 10 ml fortynningsmiddel II-oppløsning og mål prøvene: sett opp S4 og trykk på Start.
      4. Legg merke til antall celler per ml på det digitale displayet.
        MERK: Celletelling kan også utføres ved hjelp av andre manuelle eller automatiske systemer: Hemocytometer-rutenett, lysspredningscelletellingsteknologi, elektrisk impedans, bildebehandlingsbaserte systemer ved hjelp av cellefarging, for eksempel trypanblå.
    2. 96-brønns U-bunnplater
      1. Forbered 5 ml av hver cellesuspensjon (5 x 103 celler /ml) og bland dem for å få et sluttvolum på 10 ml i forholdet 1:1.
      2. Bruk en manuell gjentatt pipette for å pipette ut 100 μL av celleopphenget i hver brønn på de 96-brønns U-bunnplatene.
      3. Plasser platen i en inkubator under standard vevskulturforhold og se etter sfæroiddannelse etter 48 timer.
      4. Valgfritt trinn: Ta bilder av sfæroidene (40x) ved hjelp av et fluorescenssterekroskop.
        MERK: Denne metoden genererer 96 sfæroider (en sfæroid / brønn) etter 48 timer (område 1-2 piksel2), og den brukes vanligvis til vekststudier.
    3. Hengende dråpe
      1. Bland cellesuspensjonene (3,4 x 105 celler/ml) i forholdet 1:1 for å få et endelig volum på 2 ml.
      2. Bruk en P20 pipette til å frø celleblandingen i form av 15 μL dråper på det inverterte lokket på en 10 cm Petri-tallerken.
      3. Snu lokket med dråpene og tilsett 5 ml basemedium (EBM-2) på bunnen av parabolen for å unngå fordampning av dråpene.
        MERK: Denne metoden genererer en sfæroid / dråpe etter 48 timer. Pass på at dråpene er tilstrekkelig atskilt fra hverandre, slik at de ikke smelter sammen mens du bytter lokket. Bruk mer enn en 10 cm Petri-tallerken om nødvendig.

3. Spheroid vekststudie

  1. Plate 100 μL HUVEC og MCF-7 celleblanding (5 x 102 celler/brønn) i 96-brønns U-bunnplater og legg dem i inkubatoren.
  2. 48 timer etter plating, se etter sfæroiddannelse med et invertert mikroskop (Bright field). Ta bilder (minst seks bilder per behandling, 40x) ved 96 timers kultur.
  3. Åpne bildene ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare og behandle bildet til 300 piksler / tomme og lagre bildet som en tiff-fil.
  4. Last ned ImageJ-programvaren og åpne den. Klikk filalternativet og gå til Åpne.
  5. Konverter områdene av interesse til mettede svarte områder på en ensartet måte for å ha et binært bilde (svart og hvitt). Velg alternativet Bilde for dette ved å velge Skriv inn | 8-biters. Nå er bildet svart-hvitt.
  6. Bruk verktøyet for frihåndsmerking til å tegne kantlinjen på sfæroidene.
  7. Hvis du vil beregne interesseområdet og skille objektet eller forgrunnsbildepunktene fra bakgrunnspikslene, bruker du terskelfunksjonen: Velg alternativet Bilde , velg Juster og klikk Terskelverdi.
  8. Nå åpnes et popup-vindu for terskelverdi. Den øverste linjen angir minimumsverdien for terskelverdi: Sett verdien til null. Den nederste linjen angir den maksimale terskelverdien: Flytt stolpen til interesseområdet blir helt rødt.
    MERK: Hvis fargen ikke er rød, velger du Rød fra Terskelverdi-vinduet.
  9. Gå til Analysere | Angi mål, og velg Område og perimeter.
  10. Hvis du vil måle interesseområdet, velger du Analyser og bruker verktøyet Analyser partikler. I vinduet Analyser partikler angir du størrelsen som skal måles (0,00003-Infinity eller 3-Infinity, avhengig av størrelsen på sfæroidene), velger du Oppsummer og vis resultater. Klikk deretter OK.
  11. Resultatene vises i et diagram. Kopier målene til et regneark for å analysere dataene.
    MERK: Området beregnes som antall totale piksler. Bruk Totalområde til beregning.

4. Spheroid immunhiistokjemi studie

  1. Prøvepreparering
    1. Plate celleblandingen av HUVECs og MCF-7 (5 x 103 celler / brønn) i 96-brønns U-bunnplater i HUVEC vekstmedium i 96 timer.
    2. Samle ca. 50 sfæroider i et 1,5 ml rør med en kuttet spiss av en P200 μL pipette; la dem slå seg ned på bunnen av røret med tyngdekraften, og kast deretter supernatanten.
    3. Fest sfæroidene med 500 μL 4% PFA i 1 time, RT.
    4. Kok 2% Nobel Agar-oppløsning i PBS ved hjelp av en varm plate med magnetisk omrører i 3-5 min for å oppløse agarosepulveret helt og avkjøle ned til rundt 60 °C.
    5. Fjern PFA med en P1000 pipette, vask sfæroidene med 500 μL PBS, og la dem sedimentere. Kast supernatanten.
    6. Rør forsiktig 600 μL agaroseoppløsning i 1,5 ml-røret med sfæroider og plasser røret umiddelbart i en sentrifuge med en horisontal rotor på 177 x g i 2 minutter.
    7. Tilsett en kort streng midt i agaroseløsningen for enkelt å fjerne pluggen fra røret.
    8. Størkne agaroseplugg på is eller ved 4 °C. Tilsett 500 μL PBS i 1,5 ml-røret for å unngå å tørke ut pelletsen.
      MERK: Prøvene er klare for etterfølgende dehydrering, parafininnbygging, seksjonering, overføring på mikroskopets lysbilder og IHC-farging (utført av Sophistolab).
  2. Bildeanskaffelse og -behandling
    1. Skaff deg bilder av sfæroide seksjoner ved hjelp av et stereomikroskop.
    2. Lagre tre bilder for hvert eksempel som .jpg filer.
    3. Åpne ImageJ-programvaren. Åpne JPEG-bildet, klikk Fil og deretter på Åpne.
    4. Velg Farge- og fargedekonvolusjon i bildealternativet.
    5. Velg H DAB-vektorer i vinduet Color Deconvolution 1.7, og de tre bildene vises.
      MERK: De tre bildene er: Farge 1 representerer bare Hematoxylin-fargingen (blå/lilla), og Farge 2 representerer bare DAB-fargingen (brun). Farge 3 er ikke nødvendig for bildeanalysen med to flekker.
    6. Velg Farge 1-vinduet, og angi Terskelverdi: Gå til Bilde | Juster og klikk Terskelverdi. Terskel-vinduet vises.
    7. La minimumsverdien for terskelverdien være satt til null, og juster den maksimale terskelverdien for å fjerne bakgrunnssignalet uten å påvirke det sanne signalet. Klikk Bruk.
      1. Måling av område
        1. Klikk Analyser, velg Angi mål. Velg Område, Gjennomsnittlig grå verdiog Min og Maks grå verdi, og klikk OK for å bekrefte.
        2. Mål størrelsen på kjernen ved hjelp av alternativet Analyser , og velg deretter Mål.
          MERK: Resultatvinduet gir navnet på bildet (Etikett), størrelsen på bildet (Område), gjennomsnittlig pikselintensitet for IHC-bildet (Middelverdi) og minimums- og maksimumsgråverdiene (Min, Maks). Bruk middelverdi for beregning.
        3. Gjenta trinn 4.2.6-4.7.1.2 for vinduet Farge 2 (og Farge 3 hvis det er dobbel farging).
      2. Celle kvantifisering
        1. Klikk på Prosess, velg alternativet Binær og velg Vannskille for å skille celler.
        2. Gå til Analyser og klikk analyser partikler. I popup-vinduet Analyser partikler angir du størrelsen på cellene slik at de utelukker uspesifiserte partikler. Deretter klikker du rullegardinlisten på Vis -alternativet og velger Disposisjoner. Klikk deretter OK.
        3. Gjenta trinn 4.2.6-4.2.7 og cellekarantifiseringstrinn (avsnitt 4.2.7.2) for vinduet Farge 2 (og Farge 3 hvis det er dobbel farging).
          MERK: Nå vises tre vinduer: 1) Oppsummeringsresultater (antall celler telt, totalareal, gjennomsnittsstørrelse, % av areal og gjennomsnitt), 2) Resultater (respektive til cellene som telles), og 3) Tegningsvindu (avbildet bilde av cellene som telles).

5. Levende / død farging i sfæroider

  1. Forbered 4 mM lagerløsninger av Calcein AM i DMSO (flekker levende celler grønn) og 2 mM Ethidium homodimer i DMSO (flekker døde celler røde) i 1,5 ml rør.
  2. Beregn mengden løsning som er nødvendig for å legge til 10 μL / brønn av en blanding av Calcein AM og Ethidium homodimer fortynnet 1:50 i EBM-2.
  3. Tilsett fargingsblandingen til sfæroidene og legg platen i inkubatoren under standard vevskulturforhold i 30-60 min.
  4. Hent bilder (40x) ved hjelp av Fluorescence stereomikroskop.

6. Sfæroids protein og RNA-isolasjon

  1. Forbered cellesuspensjoner ved 3,4 x 105 celler / ml per celletype, bland dem i et forhold på 1:1, og frø celleblandingen ved hjelp av en P20 pipette i form av 15 μL dråper på lokket på en 10 cm Petri-tallerken. Snu lokket og plasser det i inkubatoren under standard vevskulturforhold i 96 timer.
  2. Bruk 5-6 ml PBS for å samle sfæroider i et 15 ml rundbunns polystyrenrør ved hjelp av 5 ml sterile polystyrenpipetter.
    MERK: Det er også mulig å bruke 15 ml koniske rør.
  3. Sentrifuger sfæroidene suspensjon ved 250 x g i 5 min, og aspirer deretter forsiktig supernatanten.
  4. Tilsett 500 μL trypsin (100%) og pipette opp og ned ved hjelp av en P1000 pipette i 30 s for å deaggregate sfæroider, oppnå en celle suspensjon.
  5. Nøytraliser trypsin med 10% FCS medium, sentrifuger rørene på 250 x g i 5 min, og aspirer supernatanten.
  6. I henhold til produsentens protokoll (spesifikt sett for DNA-fri RNA-isolasjon), bruk 300 μL RNA lysisbuffer for å lyse cellepellet.
    MERK: Lysis buffer kan også legges direkte til de intakte sfæroidene (ingen trypsin trinn kreves) for å trekke ut RNA. Tilsett 300 μL av lysisbufferen til de pelleterte sfæroidene, legg rørene i is og trianturer 10 ganger ved hjelp av en P200 pipette. Deretter isolerer du RNA som ovenfor. Sfæroid dissosiasjon kan være nødvendig hvis RNA-utvinningen er lav på grunn av matriseforstyrrelser.
  7. Alternativt kan du bruke 70 μL av Lysis-bufferen for proteinisolasjon. Homogeniser i 2-4 s ved sonikering og bestem proteinkonsentrasjonen i henhold til produsentens protokoll ved hjelp av et BCA-analysesett.
    MERK: For proteinisolasjon kan pelleterte sfæroider lyses direkte i lysisbuffer etterfulgt av sonikering. Bruk 25 μg totalt protein for å utføre vestlig blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sfæroidmodellen ved hjelp av epitel- og endotelkulturer er nødvendig for å etterligne in vivo-forhold av brystsvulster for in vitro-eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen for å danne sfæroider med brystkreft epitelceller og vaskulære eller lymfatiske endotelceller (figur 1). Hver celletype frøes separat i en 3,5 cm rund tallerken og behandles med vekststimulatorer/-hemmere eller transfektert med oligonukleotider ved hjelp av Lipofectamine. De sammenfallende monolayers av epitelceller eller endotelceller høstes etter trypsinisering, vaskes og blandes med et 1:1-forhold. Cellene er deretter belagt i 96-brønns U-bunnplater (Figur 1A) eller på det inverterte lokket på en 10 cm diameter rund kulturrett for å lette hengende fallkultur (Figur 1B). Kort tid etter sådd vises cellene som flate, tette ark med celler på bunnen av hver brønn eller dråpe, og deretter aggregerer de med tiden (24-48 h), og danner dermed intakte sfæroider ved 48 timer. For å forhindre skade på de løst dannede celleaggregatene, må platene ikke forstyrres i minst 24 timer.

I U-bunnplater resulterte såing av MCF-7-celler, men ikke endotelceller eller lymfatiske celler, i sfæroiddannelse etter henholdsvis 48 timer (figur 2A, B). Videre resulterte såing av MCF-7 pluss endotelceller eller lymfatiske celler med et 1:1-forhold også i sfæroiddannelse ( henholdsvisfigur 2C,D). For å validere sfæroider som modell for å studere tumorvekst, ble tidsavhengige endringer i sfæroidstørrelse som respons på vekststimulerende løsning målt/kvantifisert og sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 2). Fotomikrografer i figur 2E viser tidsavhengig (24-120 t) sekvensiell vekst av en representativ MCF-7 sfæroid. Linjegrafen i figur 2F viser endringen i området MCF-7 sfæroider over tid når de behandles med eller uten vekststimulator. Sfæroidstørrelsen økte fra ~ 100 μm til ~ 200 μm over 5 dager; Videre ble det observert en økt vekstrate hos sfæroider behandlet med vekststimulatoren (figur 2F). Fordi langvarig behandling (168 h) resulterte i redusert MCF-7 levedyktighet, potensielt på grunn av hypoksiske forhold i midten av sfæroidene (figur 3), ble 3D-strukturvekst studert til 96 timer. Sfæroider dannet med MCF-7 celler og HUVECer viser et lavere antall døde celler ved 168 timer sammenlignet med sfæroider dannet med MCF-7 alene.

I de første forsøkene ble bare en liten vekst i sfæroiders størrelse observert etter 4 dager med kultur. Det ble hypoteset at dette kan skyldes det høye antallet celler frøet for å danne sfæroider. I U-bunnkulturplatene kunne veksten av sfæroider ha vært begrenset av brønnens konkave form. Siden veksten var avhengig av det første antallet celler sådd, ble forskjellige celletall brukt til å danne sfæroider for å teste og etablere forhold som ville være optimale for å overvåke sfæroid vekst. Som vist i figur 4, tyder funnene på at for sfæroid vekststudier var såing av 500 celler / brønn for å danne sfæroider pålitelig og reproduserbar for overvåking av sfæroiders vekst i 4-6 dager som svar på vekstmodulerende faktorer. Sfæroider som var mest egnet for histologiske eller immun-histologiske observasjoner ble oppnådd på dag 4, etter sådd av 5 x 103 celler / brønn. Den samme innledende konsentrasjonen ble brukt til celleprotein eller RNA-ekstraksjoner. Å øke den første cellekonsentrasjonen med mer enn 7,5 x10 3 celler / brønn forbedret ikke sfæroiddannelse, og cellene aggregerte ikke riktig og antok uregelmessige strukturer (Figur 4).

For å evaluere cellesammensetning, spredning og apoptosestatus ble histologiske seksjoner av sfæroider dannet med brystkreftceller pluss endotelceller undersøkt ved hjelp av H&E og Ki67 (fortynning 1:300) og Cleaved Caspase-3 (fortynning 1:500) antistoffer. Prosessen for endelig prøvepreparering krever omsorg/oppmerksomhet og presisjon. Figur 5A viser arbeidsflyten for innsamling og inkorporering av sfæroider i agarose for seksjonering. Fotomikrografer i figur 5B-C viser forskjellen i MCF-7 sfæroiddannelse i nærvær ( figur5B) og fravær (figur 5C) av lipofektamin (0,17% endelig konsentrasjon), et vanlig brukt transfeksjonsmiddel. Lyse felt mikroskopiske bilder av histologiske seksjoner viser en sirkulær, kompakt struktur av en homogen blanding av to celletyper (Figur 5D-G). Strukturen av sfæroidene og formen på cellene deres viste ingen abnormiteter etter transfeksjon med kontroll oligonukleotider i nærvær av Lipofectamine (Figur 5D). Videre ble celler som uttrykker den proliferative markøren, Ki67, fordelt homogent i sfæroidene; Imidlertid ble det også observert en ring av proliferative celler på overflaten av sfæroidene (Figur 5E). Cleaved Caspase-3 farging viste apoptotiske celler etter 4 dager med kultur (Figur 5F). Histologiske seksjoner er nyttige for å evaluere fordelingen av epitelceller og endotelceller i sfæroider ved hjelp av spesifikke markører. Ved å bruke CD31 som en bestemt markør for endotelceller, er det mulig å bestemme distribusjonen i 3D-strukturen. Siden alle cellene er farget med Hematoxylin (blå farging av cellens kjerne), kan beregningen av CD31-uttrykket gi arealet av sfæroidene som inneholder endotelceller etter behandling eller transfeksjon (protokoll avsnitt 4.2.7.1.). Videre, ved å utføre en dobbel fargingsanalyse, er det mulig å ha enda mer informasjon, for eksempel som vist i figur 5G, CD31 flekker endotelceller (rød) og Ki67 flekker proliferative celler (brun). Etter protokollen pkt. 4.2.7.2 viste figur 5G at 55 % er epitelceller, 45 % er endotelceller og 25 % av cellene sprer seg.

Strukturen av sfæroider kan også studeres ved hjelp av immunfluorescensanalyse etter merking av celler med levende fargestoffer. Konfluente 2D-kulturer av HUVEC- og MCF-7-celler ble separat farget med blå (HUVEC) og grønne (MCF-7) fargestoffer. Deretter ble de fargede cellene samlet og blandet med et 1:1-forhold og frø i brønner for sfæroiddannelse. Bilder av fluorescerende celler farget ble tatt umiddelbart etter sådd (Figur 6A) og etter 3 dager med kultur (Figur 6B). Med sikte på å vurdere prosentandelen levende og døde celler, ble 4-dagers gamle sfæroider farget med calcein-AM (grønn) og med ethidium homodimer (rød) (Figur 6C). Sfæroider dannet med MCF-7 og HUVEC kunne ikke fryses/bevares ved hjelp av standardprotokollene for fryseceller (vekstmedium supplert med 10% DMSO og 10% FCS) for fryseceller. I frosne og tinte sfæroider var det tydelig å rupturere cellemengder og økt tap av celle levedyktighet. Det representative bildet i figur 6D viser en ny tint sfæroid farget for døde og levende celler. Det viser at sfæroider er svært følsomme for fryseforholdene.

Etter 5 dager med kultur under eksperimentelle forhold var lysis på rundt 100 sfæroider nødvendig for å samle nok protein (~ 3 μg / ml) eller RNA (~ 60 ng / μL) for analyse. Figur 7 representerer en arbeidsflyt fra sfæroider samling (generert med hengende dråper metode) til celle lysis for protein ekstraksjon for å utføre vestlig blotting eller RNA isolasjon for fremtidige Microarray analyser eller analyse av RT-PCR. Isolering av RNA/DNA fra en heterogen cellepopulasjon i en sfæroid for mikroarrayanalyse kan gi nyttig informasjon. For å identifisere viktige cellespesifikke mekanismer eller cellecelleinteraksjoner, kan imidlertid sfæroidcellene skilles etter enzymatisk (trypsin eller accutase) dissosiasjon, ved hjelp av FACS-analyse og RNA fra spesifikke celler som brukes til mikroarrayanalyse. Videre kan antibiotikaresistente cellelinjer (f.eks. ved å bruke EGFP og/eller puromycinresistenscellelinjer) brukes i sfæroider for å adressere rollen som en bestemt celletype cellecelleinteraksjon. I tillegg kan genaktiveringsverktøy brukes til å konstruere cellene for å løse spesifikke cellecelleinteraksjonsproblemer.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt av sfæroiddannelse. MCF-7- og HUVEC- eller LEC-celler i 2D-kulturer dyrkes separat og samles etter ulike ønskede behandlinger. Sfæroider genereres deretter ved direkte blanding av celler i (A) 96-brønns U-bunnplater, som fremmer dannelsen av 3D-struktur ved celle-til-celle aggregering, eller ved å bruke (B) hengende dråpekultur som støtter sfæroider dannelse via tyngdekraften. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sfæroiddannelse og utvikling over tid. Bilder viser dannelsen av en sfæroid av MCF-7 celler (Panel A), mangelen på sfæroiddannelse ved endotelceller eller lymfatiske celler (HUVECer; (Panel B)) belagt med samme tetthet, og sfæroiddannelse av MCF-7 celler pluss HUVECer eller LYSDIOCER blandet med et 1:1-forhold (Panel C,D). Også avbildet er veksten i størrelsen på en sfæroid over tid (24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer). Denne sfæroiden ble dannet av en blanding av MCF-7 pluss HUVECer i et 1:1-forhold og frø med en tetthet på 500 celler / brønn av en 96-brønns U-bunnplate (Panel E), (skalastang = 200 μm, 40x). Linjediagram (panel F) viser den tidsavhengige veksten av kontroll (CTR) kontra vekststimulerte (behandlings)sfæroider. Sfæroidens områder ble målt og sammenlignet mellom ubehandlede og behandlede sfæroider. Resultatene representerer ± SEM, *** p < 0,001 sammenlignet med den respektive kontrollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sfæroider langsiktig kultur og levedyktighet. Fotomikrograf viser celle levedyktighet i sfæroider dannet med MCF-7 celler alene ved 96 h (Panel A) og 168 h (Panel C), mens Paneler B og D skildrer celle levedyktighet i sfæroider laget med MCF-7 pluss HUVECs (1:1 ratio) ved 96 h (Panel B) og 168 h ( PanelD) (skala bar = 100 μm). Celler ble farget med Calcein (røde, døde celler) og Ethidium homodimer (grønne, levende celler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cellefrøtetthet og tidsavhengig vekstprofil for MCF-7 pluss HUVEC-sfæroid. HUVECer og MCF-7 celler blandet med et 1: 1-forhold ble sådd ved økende tetthet (102-104 celler / brønn), og veksten av sfæroider ble overvåket over 24-96 timer. Mikroskopiske lysfeltbilder ble tatt (skalalinje = 200 μm, 40x) for å vurdere sfæroid vekst over tid. Celler med en tetthet på 500 celler /brønn ga optimal størrelse for å studere sfæroid vekst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sfæroid innebygging for seksjonering og histologiske flekker. Panel A: Tegneserie som viser arbeidsflyten for innsamling og inkorporering av HUVECer /MCF-7 sfæroider i agarose. Etter parafininnbygging av sfæroidene i en agaroseplugg og seksjonering av parafinblokker, ble prøvene brukt til standard histologisk farging. Panel B og C viser representative MCF-7 pluss HUVEC sfæroider behandlet uten og med Lipofectamine 2000, henholdsvis (skala bar = 200 μm, 40x). Paneler D-G viser representative bilder av sfæroidseksjoner farget med spesifikke markører. Panel D viser sfæroider farget med hematoksylin-eosin for å vurdere sfæroidstruktur (skalastang = 100 μm). Farging i panel E viser spredningsceller som er positivt farget med Ki67. Panel F viser apoptotiske celler i en sfæroid som er positivt farget med Cleaved Caspase-3 (skalastang = 50 μm). Panel G viser sfæroide seksjoner med dobbel farging: CD31 (endotelceller markør) og Ki67 (proliferativ markør) (skalalinje = 100 μm). Seksjonering av sfæroider og farging ble utført av Sophistolab (info@sophistolab.ch). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Fluorescensbilder av MCF-7/HUVEC-sfæroider som viser cellefordeling og levedyktighet. Paneler A og B skildrer representative sfæroider med HUVECer farget med et blått fargestoff og MCF-7 celler farget med et grønt fargestoff. Lokaliseringen av HUVEC og MCF-7 i sfæroiden varierer umiddelbart etter sådd (A) og etter sfæroiddannelse (B) (skalastang = 250 μm). Paneler C-D viser sfæroider farget med Calcein / Ethidium Homodimer for å identifisere levende (grønne) og døde celler (røde) i 3D-strukturer i normal kulturtilstand (C) og etter frysing (D) (Skalastang = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Skjematisk representasjon av sfæroidinnsamling for biokjemisk analyse. Tegneserie som viser ordningen for å høste sfæroider, skille eller frigjøre celler, og suspendere dem i lysis-løsning for proteinanalyse eller RNA-ekstraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolusjonerende 3D-sfæroidkulturteknologi et bedre og kraftigere verktøy for å rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraksjoner og legemiddelresponser in vitro. Dette er den første protokollen som beskriver dannelsen av sfæroider fra multicellulære (epiteliale og endoteliale) cellelinjer for brystkreftforskning. Denne protokollen sikrer sfæroidal 3D-vekst av sfæroider i opptil 5 dager, og sfæroider kan undersøkes etter parafininnbygging, seksjonering og histologisk farging. Interessant nok uttrykker de cellulære elementene i sfæroidet fortsatt reseptorer som fremmer cellevekst og reagerer på proliferative og apoptotiske stimuli. Den beskrevne protokollen genererer tilstrekkelig biologisk materiale for protein- eller RNA/DNA-analyse. Ovennevnte samkultursystem, lett oppnådd i laboratorieforhold og til lave kostnader, kan være en fordel for fremtidige applikasjoner, spesielt i brystkreftbehandling og for testing av legemiddelfølsomhet. I tillegg kan denne protokollen brukes på forskjellige epitel- og endotelcelletyper.

Det er ekstremt vanskelig å etterligne in vitro et komplekst vev som eksisterer in vivo. Dette skyldes at in vivo vev består av mange interagerende komponenter, inkludert nerver, blodkar, mesenchyme og immunceller30,42. Målet med denne protokollen er å overvinne noen av disse begrensningene ved å bruke et 3D-samkultursystem med to forskjellige celletyper for å nærme seg den faktiske tumortilstanden. Her har sfæroider blitt dannet med epitel tumorceller i kombinasjon med endotelceller eller lymfatiske celler for å etterligne in vivo-situasjonen så mye som mulig, inkludert cellecelleinteraksjoner, følsomhet for apoptotiske faktorer som slippes ut i intercellulære rom ved døende celler, og hypoksiske forhold i midten av sfæroidene. Denne protokollen er optimalisert for testing av cellulære responser på vekstfaktorer, signalfaktorer og hormoner, som raskt aktiverer signalkaskader og målgentranskripsjon og stimulerer proteinuttrykk og transport30,31. I sfæroider, men ikke in vivo, kan responser av tumorceller til stimuli vurderes raskt og ofte.

I den nåværende studien ser det ikke ut til at endotelceller i sfæroidene danner kapillærlignende strukturer. Siden endotelceller har vist seg å danne kapillærer når de er belagt med lav tetthet og monolayers ved høy tetthet, er det mulig at senking av forholdet mellom MCF-7 og endotelceller kan resultere i kapillærdannelse i sfæroidene. Alternativt kan tilsetning av spesifikke matriseproteiner eller matrigell fremme kapillærdannelse. Mangelen på kapillærlignende struktur i sfæroidet fortynner ikke fordelen med MCF-7 pluss endotelceller versus MCF-7-celler i seg selv, da faktorene som frigjøres av MCF-7-celler kan fremme endotelcelleproliferasjon og omvendt; slike interaksjoner ville forbli uoppdaget i MCF-7 bare sfæroider.

Flere studier har vist at 5 x 103 celler / brønn var riktig konsentrasjon til frøceller for å danne sfæroider43,44,45,46,47; Men i 96-brønns U-bunnplater begrenset dette antall celler den koordinerte veksten av sfæroider under eksperimentelle forhold. Derfor, i hver ny studie, for hver ny celletype, er det viktig å overvåke veksten av 3D-systemet etter medikamentell behandling, for å bestemme effekten av behandlingen på sfæroid størrelse.

Begrensningen av den nåværende protokollen er at kulturen til tidligere dannede sfæroider ikke kan fortsette etter frysing og opptining av den klassiske DMSO-metoden. Faktisk, når de ble tint, var de fleste cellene døde. Vitrifisering kan vise seg å være et alternativ til å holde cellene i live48.

Nøye oppmerksomhet på tekniske detaljer er nødvendig for å unngå feil og produsere og opprettholde velformede sfæroider. En utfordring er prøveprepareringen for immunstaining (pkt. 4.1). For å lette overføringen ved å pipettere sfæroidene inn i 1,5 ml-røret, er det viktig å bruke en P200-spiss kuttet med saks slik at hullets område er større enn sfæroidene selv. Ellers kan overføringen ødelegge kulene. En annen utfordring er hvordan man aspirerer mediet etter at sfæroidene har lagt seg til bunnen av et reagensrør. I denne forbindelse er det bedre å bruke en P1000 pipette i stedet for en vakuumpumpe for å unngå sfæroiders aspirasjon. Et viktig og delikat skritt i å forberede sfæroidene for seksjonering er å legge agarose til pelleted sfæroider. Sfæroidene, når de er suspendert i agarose, må pelleteres raskt til bunnen av mikrofugerøret ved hjelp av horisontal sentrifugering ved romtemperatur og før agarosepolymererer.

Totalt sett gir tocellet sfæroid laget av MCF-7 og endotelceller et levedyktig alternativ for å undersøke cellecelleinteraksjoner og mekanismer som driver veksten av enten kreftceller eller endotelceller i en svulst. Sfæroidene kan fungere som en modell for å vurdere effekten av terapeutiske midler rettet mot svulst eller kreftvekst. Det er viktig at denne tocellemodellen improviseres ytterligere for å inkludere andre celletyper som er relevante for tumorvekst. I denne sammenhengen kan fibroblaster som utgjør 80% av brystsvulstmassen inkluderes for å danne en MCF-7, endotelceller og fibroblast sfæroid. Videre kan genaktivering og genmodifiserte celler brukes til å adressere rollen som cellecelleinteraksjon, hormonreseptorer (østrogen / progesteron), vekstfaktorer og signalveier for tumor / kreftvekst, samt å teste effekten av nye kreftmolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 til RKD og National Institute of Health grant DK079307 til EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

Kreftforskning Utgave 173 brystkreft svulst sfæroider neovascularization lymfatiske kar tumorvekst endotelceller epitelceller celleproliferasjon
Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell <em>in vitro-modell</em> for brystkreftforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter