Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell in vitro-modell for brystkreftforskning

Brystkreftcellesfæroidene som er beskrevet her, vil tillate forskere å undersøke molekylære mekanismer for kreftcelle endotelcelleinteraksjoner som er involvert i spredning og metastase av kreftceller. Den største fordelen med denne 3D-modellen er at den gir et mer realistisk cellulært arrangement som forbedrer påliteligheten av slutninger angående patofysiologi og behandling av brystkreft. Å demonstrere prosedyren vil være Giovanna Azzarito, en stipendiat fra laboratoriet mitt.

Begynn med å behandle eller transfektere de belagte cellene i 24 timer, eller etter ønske. For å identifisere cellefordeling i sfæroid, vask cellene med en milliliter Hanks’Balansert saltløsning eller HBSS, som inneholder kalsium og magnesium og bli i HUVECer ved hjelp av 0,5 mikrogram per milliliter blått fargestoff. Og MCF-7 celler som bruker 0,5 mikromolargrønn fargestoff fortynnet med hensyn til vekstmedium.

Plasser platen i en 37 grader celsius og fem prosent CO2-inkubator i 30 til 40 minutter. Vask cellene med en milliliter HBSS uten kalsium og magnesium. Tilsett deretter en milliliter enzymatisk løsrivelsesmiddel, som er 0,25% trypsin for HUVEC og 0,5% turer i fire MCF-7 til hver brun tallerken ved hjelp av en P1000 pipette.

Velg hver celletype separat i et fem milliliter rundbunnspolystyrenrør, og tilsett en milliliter 10% fetal kalveserum eller FCS-medium ved hjelp av en P1000 pipette for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Sentrifuger deretter cellesuspensjonene ved 250 ganger G i fem minutter. Forsiktig aspirere supernatant og suspendere cellene i en milliliter steroidfritt medium.

Bruk 100 mikroliter av hver celleoppheng fortynnet med 10 milliliter Diluent 2 for å bestemme det totale cellenummeret. Slå på maskinen og skyll ved å trykke på funksjonen og startknappene, med Fortynningsoppløsning 2 i et celletellerhette hetteglass. Bruk oppsett som fire og trykk på start for å måle det tomme med fersk Fortynningsløsning 2.

Bytt scintillation hetteglasset med 100 mikroliter celle suspensjon i 10 milliliter diluent 2 løsning. Bruk set up som fire, og trykk start for å måle prøvene. Legg merke til antall celler per milliliter på det digitale displayet, Forbered deretter fem milliliter av hver cellefjæring og bland dem for å få et sluttvolum på 10 milliliter i et en-til-en-forhold, ved hjelp av manuell gjentatt pipette for å pipette ut 100 mikroliter av celleopphenget i hver brønn av den 96-brønns U-bunnplaten.

Plasser platen i en inkubator under standard vevskulturforhold og se etter en sfæroiddannelse etter 48 timer. Ta bilder av disse sfæroidene med 40 X forstørrelse ved hjelp av en fasekontrast eller fluorescens stereomikroskop. For å forberede hengende dråpekultur blander cellesuspensjonene i et en-til-en-forhold for å få et sluttvolum på to milliliter.

Bruk en P20 pipette for å se celleblandingen i form av 15 mikroliterdråper på den omvendte ledningen til en 10 centimeter Petri-tallerken. Snu lokket med dråpene og tilsett fem milliliter EBM-2 basemedium på bunnen av parabolen for å unngå fordampning av dråpene. Samle ca 50 sfæroider i et 1,5 milliliterrør med en tarmspiss av en P200 mikroliterpipette.

La dem slå seg ned på bunnen av røret med tyngdekraften og kast deretter supernatanten. Fest disse sfæroidene med 500 mikroliter 4% PFA i en time ved romtemperatur. Kok 2%Nobel Algor Solution i PBS ved hjelp av en varm plate med magnetisk røre i tre til fem minutter for å oppløse det augurøse pulveret helt og avkjølt ned til rundt 60 grader Celsius.

Fjern PFA med en P1000 pipette, vask disse sfæroidene med 500 mikroliter PBS og la dem sedimentere. Når den er avgjort, kast den supernatante forsiktig pipetten 600 mikroliter Agora-løsningen i 1,5 milliliterrøret med sfæroider og plasser røret umiddelbart i en sentrifuge med en horisontal rotor ved 177 ganger G i to minutter. Tilsett en kort streng midt i Agro Solution for enkelt å fjerne pluggen fra røret.

Størk Agros-pluggen på is, eller ved fire grader celsius tilsett 500 mikroliter PBS i 1,5 milliliterrøret for å unngå å tørke ut pelletsen. Skaff bilder av sfæroide seksjoner ved hjelp av et stereomikroskop. Beregn mengden løsning som er nødvendig for å legge til en 10 mikroliter per brønn av en blanding av kalsium Aam og ethidium homodimers fortynnet ved hjelp av EBM-2 i forholdet en til 50.

Tilsett fargingsblandingen til sfæroidene og legg platen i inkubatoren under standarden, vevskulturforholdene i 30 til 60 minutter. Hent bilder med 40 X forstørrelse ved hjelp av fluorescens stereomikroskopet. I U-bunnplater ble sfæroidformasjonen observert 48 timer etter sådd av MCF syv celler.

Sfæroidenes dannelse ble imidlertid ikke observert i tilfelle endotelceller eller lymfatiske celler. Såing av MCF syv pluss endotelceller eller MCF syv pluss lymfatiske celler ved en-til-en-forhold resulterte også i sfæroiddannelse. Tidsavhengig sekvensiell vekst av MCF syv sfæroid ble registrert fra 24 til 120 timer.

Sfæroidenes størrelse økte fra rundt 100 mikrometer til rundt 200 mikrometer over på fem dager. Med en økt vekstrate observert i sfæroidene behandlet med vekststimulatoren. Strukturen av sfæroidene og formen på cellene deres viste ingen abnormiteter etter transfeksjon med kontroll oligonukleotider i nærvær av Lipofectamine.

Celler som uttrykker sin proliferative markør Ki-67 ble distribuert homogent i denne sfæroidene. Cleave til caspase tre farging av denne sfæroider viste apatiske celler etter fire dager med kultur. Studier av cellene i denne sfæroiden med CD-31 og Ki-67 viste at 55% av cellene er epiteliale 45% er endoteliale og 25% av cellene sprer seg.

For å vurdere prosentandelen levende og døde celler ble fire dager gamle sfæroider farget med kalsium Aam og ethidium-homodimer. En nytenkt sfæroid flekker også for døde og levende celler avslørte at sfæroider er svært følsomme for fryseforhold. Når du følger hans protokoll, sørg for at sunne celler brukes til å blande afrodite En annen ting å huske ville være å unngå å skade disse afrodite under DP-hetten for å få en god seksjon sikrer også å gane afrodite før over polymeriserer.

Denne modellen kan forbedres ytterligere ved å inkludere andre celler, for eksempel fibroblaster involvert i tumorprogresjon og bruke den til å vurdere effekten av terapeutiske midler rettet mot en kreftvekst.