Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering av menneskelige motorenheter med funksjonelle nevromuskulære veikryss i mikrofluidiske enheter

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62959
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 5, 3,4, 1,2, 1,2, 5, 1,2,6, 1,2
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Center for Brain & Disease Research, Laboratory of Neurobiology, , 3VIB Center for Brain & Disease Research, Research Group Molecular Neurobiology, , 4VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 5Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 6Department of Neurology, University Hospitals Leuven

Summary

Vi beskriver en metode for å generere menneskelige motorenheter i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter ved å kokulturere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede motoriske nevroner med humane primære mesoangioblast-avledede myotuber som resulterer i dannelse av funksjonelt aktive nevromuskulære veikryss.

Abstract

Nevromuskulære veikryss (NMJs) er spesialiserte synapser mellom axonen til den nedre motoriske nevronen og muskelen som letter engasjementet av muskelkontraksjon. I motoriske nevronsykdommer, som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskelatrofi (SMA), degener NMJs, noe som resulterer i muskelatrofi og progressiv lammelse. Den underliggende mekanismen for NMJ-degenerasjon er ukjent, hovedsakelig på grunn av mangel på overførbare forskningsmodeller. Denne studien hadde som mål å skape en allsidig og reproduserbar in vitro-modell av en menneskelig motorenhet med funksjonelle NMJs. Derfor ble menneskeskapt pluripotent stamcelle (hiPSC)-avledede motoriske nevroner og humane primære mesoangioblast (MAB)-avledede myotuber samkulturert i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter. Bruken av fluidisk isolerte mikrorom gjør det mulig å opprettholde cellespesifikke mikromiljø samtidig som celle-til-celle-kontakt tillates gjennom mikrogroover. Ved å bruke en kjemosaktisk og volumetrisk gradient ble veksten av motoriske nevron-neuritter gjennom mikrogroovene som fremmer myotube interaksjon og dannelsen av NMJs stimulert. Disse NMJene ble identifisert immunocytokjemisk gjennom samlokalisering av motorisk nevron presynaptisk markørsynaptofysin (SYP) og postsynaptisk acetylkolinreseptor (AChR) markør α-bungarotoxin (Btx) på myotuber og karakterisert morfologisk ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM). Funksjonaliteten til NMJs ble bekreftet ved å måle kalsiumresponser i myotubes ved depolarisering av motornevronene. Motorenheten som genereres ved hjelp av standard mikrofluidiske enheter og stamcelleteknologi kan hjelpe fremtidig forskning med fokus på NMJs innen helse og sykdom.

Introduction

NMJs letter kommunikasjonen mellom lavere spinalmotoriske nevroner og skjelettmuskulaturfibre gjennom frigjøring av nevrotransmittere1. I motoriske nevronforstyrrelser som ALS og SMA degener NMJs, noe som forårsaker en forstyrrelse i kommunikasjonen med musklene2,3,4,5,6,7. Dette resulterer i at pasienter gradvis mister muskelfunksjonen, noe som fører til at de er rullestolbundne og til slutt avhengige av respiratorisk livsstøtte på grunn av progressiv atrofi av vitale muskelgrupper som membranen. De eksakte underliggende mekanismene som er ansvarlige for dette dype tapet av NMJs i disse lidelsene er ukjente. Mange studier har blitt gjort på transgene dyremodeller, noe som har gitt oss litt innsikt i patogenesen av NMJ degenerasjon5,6,8,9,10,11. For å forstå patologien og motvirke denervasjonen, er det imidlertid viktig å ha et menneskelig system, noe som gir full tilgjengelighet.

Her beskriver protokollen en relativt enkel måte å generere menneskelige NMJs gjennom co-culturing av hiPSC-avledede motoriske nevroner og humane primære MAB-avledede myotuber ved hjelp av kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter. Bruken av mikrofluidikk for å polarisere og fluidisk isolere somas og axoner av nevroner har vært kjent siden den første beskrivelsen av 'Campenot' kamrene12 på slutten av 1970-tallet. Siden da har flere mikrofluidiske design blitt fabrikkert, inkludert kommersielle alternativer. Enhetene som brukes i denne protokollen inneholder to rom, og hvert rom består av to brønner koblet til en kanal13. De to rommene er speilet og forbundet med flere mikrogroover. Disse mikrogroovene har en størrelse som letter nevrittvekst samtidig som den opprettholder fluidisk isolasjon mellom de to rommene gjennom et kapillært hydrostatisk trykk13,14. Ved hjelp av dette systemet er det mulig å dyrke motoriske nevroner i ett rom og muskelceller i det andre, hver i deres spesifikke kulturmedium, samtidig som det letter en fysisk forbindelse gjennom nevritter som passerer gjennom mikrogroovene og engasjerer seg med muskelcellene. Denne modellen gir et fullt tilgjengelig og tilpasningsdyktig in vitro-system av en menneskelig motorenhet, som kan brukes til å studere tidlig NMJ-patologi i sykdommer som ALS og SMA.

Protocol

Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle, som ga sine prøver for iPSC-generasjon og MAB-høsting. Prosedyren ble godkjent av den medisinske etikkkomiteen ved Universitetssykehuset Leuven (n° S5732-ML11268) og av Storbritannias viktigste forskningsetiske komité som en del av StemBANCC-prosjektet. Alle reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen er oppført i materialtabellen og bør brukes sterilt. Mediet må varmes opp til romtemperatur (RT) før bruk, med mindre annet er spesifisert. Hvis du vil ha en oversikt over samkulturprotokollen, kan du se figur 1.

1. Differensiering av motoriske nevron forfedre fra iPSCs

  1. Følg motor neuron differensieringsprotokollen15, tilpasset fra en tidligere studie16, til du når dag 10 nevrale stamceller (NPCs) tilstand. I henhold til protokollens tidsramme startes differensieringen på en mandag (dag 0), som resulterer i dag 10 NPCer på en torsdag.
  2. Cryopreserve dag 10 NPCer i knock-out serum erstatning med 10% dimetylsulfoksid (DMSO) med en tetthet på 2 x 106- 4 x 106 celler per hetteglass.
    FORSIKTIG: DMSO er giftig: håndtak i en avtrekkshette med personlig verneutstyr.
    MERK: Omtrent 50% av dagen forventes 10 NPCer å være avgjørende ved opptining. Stopp motor neuron differensieringsprotokollen på denne "dag 10 NPC" -tilstanden og kryopreserver NPCene for å generere et stort antall NPCer, som kan bankes og brukes senere, og reduserer lengden på den generelle tidslinjen til samkulturprotokollen fra 28 dager til 19 dager totalt.

2. Avledning og vedlikehold av menneskelige MAB-er

MERK: MASTER er fartøysrelaterte mesenchymale stamceller, som i dette tilfellet har blitt høstet fra biopsier hentet fra en 58 år gammel sunn donor. Alternative kommersielle kilder er tilgjengelige. Protokollen for å få MABer er kort forklart. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se den detaljerte protokollen17. Alle MAB-medier skal varmes opp til 37 °C før bruk.

  1. Hakk biopsivevet og inkuber på kollagen (fra kalveskinn) belagt 6 cm retter i et vekstmedium (tabell 1) i 2 uker. Bytt medium hver fjerde dag.
    1. For å forberede kollagenbelegg, oppløs 100 mg kollagen i 20 ml 0,1 M eddiksyre. Kollagen tar tid å oppløse, så plasser blandingen på en gyngeplattform over natten på RT. Neste dag, fyll opp med 80 ml ddH2O til et endelig volum på 100 ml.
      FORSIKTIG: Eddiksyre er giftig; håndtaket i en avtrekkshette med personlig verneutstyr.
      MERK: Kollagen fra kalveskinnbelegg kan gjenbrukes opptil 5x. Oppbevars ved 4 °C.
    2. Belegge hele overflaten av parabolen eller kolben med kollagen, lukk og inkuber i 20 min ved RT inne i en laminær strømning. Etter 20 min, gjenopprett kollagenet i en frisk beholder, lukk den tomme parabolen / kolben og la den stå i 10 minutter ved RT i laminærstrømmen.
    3. Overfør parabolen/kolben til inkubatoren over natten (eller minst 6 timer) inkubasjon (37 °C, 5 % CO2). Vask 5x med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann uten kalsium eller magnesium (DPBS) før du plating celler.
  2. Etter 14 dager sorterer FACS (fluorescerende aktivert cellesortering) MAB-ene for human alkalisk fosfatase17 etterfulgt av ytterligere ekspansjon. Oppretthold MAB-ene på kollagenbelagte T75-kolber i vekstmediet og endre vekstmediet annenhver dag (10 ml per kolbe).
  3. Kryopreserve, passasje eller frøMABer i enheter når de når 70% samløp.
    MERK: MAB-er mister sitt myogene potensial på grunn av spontane fusjoner ved celle-til-celle-kontakt. Pass på at du ikke overstiger 70% samløp når du utvider MAB-er. En 70% konfluent T75 kolbe inneholder ca 600,000-800,000 celler, som kan kryopreservert på 100,000 celler per hetteglass. Hvert hetteglass kan senere tines og frøs i en T75-kolbe for utvidelse.
  4. For å passere MABs, vask dem forsiktig en gang med 7 ml DPBS og inkuber deretter i 7 ml MAB dissosiasjonsløsning i 3 min ved 37 °C i 5 % CO2 for å fjerne cellene.
    1. Nøytraliser MAB-dissosiasjonsløsningen med 7 ml vekstmedium, skrap cellene forsiktig og overfør cellefjæringen til et 50 ml sentrifugerør. Vask kolben forsiktig med en ekstra 5 ml av vekstmediet for å samle potensielt gjenværende KARBOHYDRATER.
    2. Sentrifuger cellefjæringen i 3 min ved 300 x g, og gå deretter direkte til en ny kollagenbelagt T75-kolbe for utvidelse, kryopreservering i utslagsserumerstatning med 10% DMSO eller telle til frø i en mikrofluidisk enhet.
      MERK: Passeringer utføres 1x-2x per uke for celleutvidelse til et maksimalt passasjenummer på 13. Ved dissosiasjon fremstår MAB sfærisk og stor i form når de undersøkes under mikroskopet.

3. Tilberedning av ferdigmonterte mikrofluidiske enheter - Dag 9

MERK: Protokollen er tilpasset fra mikrofluidisk enhetsprodusentens nevronenhetsprotokoll og er justert for bruk av både ferdigmonterte og silikoninnretninger. Her brukes forhåndsmonterte enheter til immunocytokjemi (ICC) og levende celle kalsium forbigående opptak, mens silikonenheter brukes til SEM. Tidslinjen til protokollen følger tidslinjen for motor neuron differensieringsprotokollen.

  1. Forbered mikrofluidiske enheter dagen før såddceller, da belegget må inkuberes over natten. Ifølge motornevronprotokollen vil dette være en onsdag. Tilsett ~10 ml 70%-100% etanol til en 10 cm Petri-tallerken. Bruk tang til å overføre enheten fra forsendelsesbeholderen til Petri-parabolen for sterilisering.
  2. Senk enheten ned i etanol i 10 s og overfør enheten med tang til et stykke papir for å lufttørke i laminærstrømmen i ~ 30 min. Snu enheten et par ganger slik at begge sider kan tørke. Når enheten er tørr, bruk tang til å flytte hver enhet til en individuell 10 cm Petri-tallerken for enkel håndtering
    FORSIKTIG: Etanol er giftig; håndtaket i en avtrekkshette med personlig verneutstyr
  3. Belegge enheten med Poly-L-ornitin (PLO) (100 μg/ml) i DPBS og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 3 timer.
    1. Bruk en P200 pipette for å legge til 100 μL PLO i DPBS i en topp så vel som nær kanalåpningen som mulig og observere væsken som passerer fra toppen godt gjennom kanalen til bunnbrønnen. Deretter legger du til 100 μL PLO i DPBS til bunnbrønnen.
    2. Gjenta på den andre siden av mikrogroovene og avslutt med å legge til 100 μL på den ene siden av enheten for å skape en volumgradient mellom de to speilede sidene av enheten for å belegge mikrogroovene (f.eks. høyre side 200 μL, venstre side 300 μL). Etter 3 timer, vask enheten 3x i 5 min med DPBS. Bruk om nødvendig et sugesystem.
      MERK: Sørg for å unngå luftbobledannelse i kanalene når som helst under belegget eller modning av cellene. Selv små bobler vil ekspandere over kort tid, og dermed hemme belegg, cellesåing eller mediestrøm over kanalen. Hvis væsken stopper i kanalen under belegg, må du bruke PLO-oppløsningen direkte inn i kanalen fra begge sider. Hvis det fortsatt finnes bobler, bruker du 200 μL DPBS til å skylle kanalen og gjenta beleggprosessen som angitt ovenfor i trinn 3.3.1-3.3.2. Hvis bobler vises etter cellesåing, er det umulig å gjenopprette enheten, da spyling av kanalen vil skade cellene.
  4. Belegge enheten med laminin (20 μg/ml) i et nevrobasalt medium og inkuber over natten ved 37 °C, 5 % CO2. Følg de samme instruksjonene for PLO-belegg fra trinn 3.3.1-3.3.2.
  5. Neste dag, bruk en P200 pipette og plasser spissen i motsatt side av kanalåpningen for å fjerne lamininbelegget fra brønnene. Tilsett DPBS i alle brønnene og la enhetene være med DPBS i laminærstrømmen ved RT for cellesåing.
    MERK: Fra dette tidspunktet er det viktig å ikke fjerne væske (lamininbelegg, DPBS, media, fikseringsløsning, etc.) direkte fra kanalene, da dette kan forårsake luftbobledannelse. Kontroller alltid enhetene under mikroskopet før såddceller.

4. Tilberedning av silikon mikrofluidiske enheter - Dag 9

  1. Forbered silikonmikrofluidiske enheter dagen før såddceller, da belegget må inkuberes over natten. Ifølge motornevronprotokollen vil dette være en onsdag.
    1. Tilsett ~10 ml 70%-100% etanol til en 10 cm Petri-tallerken. Bruk en tang til å overføre enheten fra forsendelsesbeholderen til Petri-parabolen for sterilisering. Senk enheten ned i etanol i 10 s og overfør med tang til en brønn i en 6-brønns plate for å lufttørke i laminærstrømmen i ~ 30 min. Plasser enheten på siden slik at alle sider kan tørke.
    2. Klipp ned SEM-arkene til størrelsen på enheten (la det være noen mm på hver side). Gjenta steriliseringen som angitt ovenfor i trinn 4.1.1. Deretter overføres med tang til en 10 cm Petri-tallerken for å tørke. To-tre SEM-ark passer i en tallerken.
  2. Belegge enhetene og SEM-arkene med PLO (100 μg/ml) i DPBS og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 3 timer.
    1. Tilsett 1 ml PLO i DPBS per brønn til hver enhet i 6-brønnsplaten. Forsikre deg om at enheten flyter på toppen av PLO-løsningen med kanalen og mikrogroovesiden vendt ned i væsken. Tilsett 10 ml PLO i DPBS per 10 cm Petri-tallerken og bruk tang til å skyve SEM-arkene ned i væsken.
      MERK: SEM-ark vil vanligvis flyte på toppen av beleggløsningen. Før du monterer enheten og arket, snu SEM-arket slik at overflaten, som har vært i kontakt med PLO, kontakter kanalen og mikrogroovoverflaten til enheten.
    2. Etter 3 timer, vask enheten og SEM ark 2x i 5 min med DPBS etterfulgt av en annen vask i 5 min med sterilt vann. Bruk et sugesystem om nødvendig. Overfør hvert SEM-ark til en individuell 10 cm Petri-tallerken for enkel håndtering.
      MERK: Både enheter og SEM-ark må være helt tørre før montering. Den endelige vasken med sterilt vann fjerner potensielle saltkrystaller fra DPBS, noe som ellers kan hemme monteringen.
  3. Arbeid under et mikroskop i en laminær strømning. Bruk tang til å montere silikonenheten med kanal- og mikrogroovsiden ned i en 90° vinkel på SEM-arket, og sørg for at alle sider er justert. Trykk lett ned på enheten for å forsegle ikke bare ytterkanter, men også rundt brønner, kanaler og mikrogroover.
    MERK: Limte områder vil se grå ut, mens de som ennå ikke er montert, vil vises klare under mikroskopet. Sørg for at alle områder er godt forseglet uten luftbobler for å unngå løsrivelse av apparatet under dyrking. Ved blokkering av rusk eller saltkrystaller, må du revaske både SEM-ark og -enheten i sterilt vann og tørke før du prøver monteringsprosedyren på nytt. Hvis mikrogroovene ser ut til å være forvrengt fra å trykke for hardt på enheten, fjerner du enheten helt fra SEM-arket og prøver monteringen på nytt. Vær forsiktig når du har belegget og skiftet medium når enheten er montert.
  4. Arbeid under et mikroskop i en laminær strømning. Belegge enheten med laminin (20 μg/ml) i et nevrobasalt medium og inkuber over natten ved 37 °C, 5 % CO2.
    MERK: Inkubering over natten herder silikonenheten og forsegler den ytterligere på SEM-arket.
    1. Bruk en P200 pipette for å legge til 100 μL lamininoppløsning i en topp så vel som nær kanalåpningen som mulig og observere væsken som passerer fra toppen godt gjennom kanalen til bunnbrønnen. Se etter lekkasje rundt brønnen og kanalen.
    2. Tilsett deretter 100 μL lamininoppløsning i bunnbrønnen og se etter lekkasje. Gjenta på den andre siden av mikrogroovene og avslutt med ytterligere 100 μL på den ene siden av enheten for å skape en volumgradient mellom de to speilede sidene av enheten for å belegge mikrogroovene (f.eks. høyre side 200 μL, venstre side 300 μL).
      MERK: Ved lekkasje, fjern lamininbelegget, demonter enheten og SEM-arkene og vask begge i sterilt vann. La dem tørke og gjenta fra trinn 4.3 og utover.
    3. Neste dag fjerner du belegget fra brønnene med en P200 pipette ved å plassere spissen i brønnen overfor kanalåpningen. Tilsett DPBS i alle brønnene og la enhetene være med DPBS i laminærstrømmen ved RT for cellesåing.
      MERK: Fra dette tidspunktet må du ikke fjerne væske (lamininbelegg, DPBS, media, fikseringsløsning, etc.) direkte fra kanalene, da dette kan forårsake luftbobledannelse. Kontroller alltid enhetene under mikroskopet før såddceller.

5. Plating av NPCer i mikrofluidiske enheter - Dag 10

MERK: I henhold til motor neuron differensieringsprotokollen15 oppstår plating av dag 10 NPCer på en torsdag.

  1. Bruk nydelt dag 10 NPC15, eller tine 1-2 hetteglass med bankede NPCer per 10 ml dag 10 motorisk nevronmedium (tabell 2 og tabell 3) med ROCK-hemmer (10 μL/ml) oppløsning, og sentrifuger cellefjæringen ved 100 x g i 4 minutter.
  2. Resuspend cellepellet i 500-1000 μL av dag 10 motor neuron medium med ROCK inhibitor (10 μL / ml) løsning og telle levende celler ved hjelp av noen foretrukket tellemetode.
    MERK: Som nevnt nedenfor, sørg for å bruke NPC-ene på nytt i riktig mengde medier for å imøtekomme et optimalt såddvolum.
  3. Fjern DPBS fra to brønner på den ene siden av mikrogroovene i enheten med en P200 pipette og frø 250 000 NPCer per enhet i 60-100 μL av dag 10 motoriske nevronmedier.
    1. Øverst til høyre godt frø 30-50 μL av cellefjæringen (125.000 celler) nær kanalåpningen i en 45° vinkel og dra den gjenværende væsken forsiktig langs brønngulvet mot midten av brønnen med pipettespissen.
    2. Pause i noen sekunder for å la celleopphenget strømme gjennom kanalen før du gjentar dette i den nedre brønnen (125 000 celler i 30-50 μL). Bruk en penn til å markere frøsiden "NPC" eller tilsvarende for enkel orientering av enheten uten mikroskop.
    3. Inkuber enheten ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 minutter for å tillate celletilknytning før du fyller opp de tofrøbrønnene med et ekstra dag 10 motorisk nevronmedium (totalt 200 μL/brønn) og inkuberer igjen ved 37 °C, 5 % CO2.
      MERK: Hver brønn kan inneholde 200 μL. Såceller i både brønner og kanaler sikrer en robust struktur av kulturen, noe som reduserer risikoen for celleavløsning under medieendringer. Det er mulig å frø færre celler i bare kanalen. Dette vil imidlertid gjøre kulturen mer utsatt for volumstrømmen gjennom kanalene under hver middels endring.
  4. Bruk en P200 pipette for å fjerne DPBS fra de to brønnene på den andre siden av mikrogroovene på motsatt side av de nyseedede NPCene. Tilsett 200 μL/brønn på dag 10 motoriske nevronmedier og vent noen sekunder mellom topp og bunn godt for å la media strømme gjennom kanalen. Tilsett deretter 6 ml DPBS per 10 cm tallerken rundt enheten for å forhindre fordampning av mediet under inkubasjon.
    MERK: Legg til ekstra DPBS rundt enheten i kulturperioden om nødvendig.
  5. Utfør en full motorisk nevron middels endring i begge rom på enheten på dag 11 (fredag), dag 14 (mandag) og dag 16 (onsdag) (tabell 2 og tabell 3). Tilsett ferske medietilskudd på dagen for medieendringen.
    MERK: Fra dette tidspunktet utfører du alle middels endringer med en P200 pipette. Plasser alltid pipettespissen bort fra kanalen på kanten av brønnen, og ikke fjern væske direkte fra kanalen. Pass på at du ikke løsner silikonenhetene. Fjerning og tilsetning av medium bør gjøres sakte for å forhindre celleavløsning.
    1. Fjern forsiktig alle medier i begge brønnene med NPCer ved å plassere P200 pipettespissen på den nederste kanten av brønnveggen overfor kanalåpningen. Tilsett sakte 50-100 μL fersk motor neuron medium til toppbrønnen ved å plassere P200 pipettespissen på den øvre kanten av brønnveggen motsatt kanalåpningen.
    2. Pause i noen sekunder for å la mediet strømme gjennom kanalen før du legger til 50-100 μL motorisk nevronmedium til bunnbrønnen. Gjenta denne prosessen nøye til begge brønnene inneholder 200 μL/brønn. Gjenta på siden uten celler.

6. Plating av MAB i mikrofluidiske enheter - Dag 17

  1. Omtrent 7 dager før såing av MAB-er i mikrofluidiske enheter (dag 10 av motorisk nevrondifferensiering), tine MAB-er og frø dem i vekstmediet (tabell 1) i en T75-kolbe belagt med kollagen for å muliggjøre tilstrekkelig celleutvidelse. Se avsnitt 2.
  2. På dag 17 av motor neuron differensiering (torsdag), dissociate MABs som forklart i trinn 2.4, resuspend celle pellet i ~ 500 μL av vekst medium og telle levende celler ved hjelp av noen foretrukket tellemetode.
    MERK: Som nevnt nedenfor, sørg for å bruke MAB-ene på nytt i riktig mengde medier for å imøtekomme optimalt såddvolum.
  3. Fjern motornevronmediet på den usynlige siden av mikrogroovene i enheten med en P200-pipette, vask forsiktig med DPBS og frø 200.000 MAB per enhet i 60-100 μL vekstmedium.
    1. Øverst til høyre godt frø 30-50 μL celleoppheng (100.000 celler) nær kanalåpningen i en 45° vinkel og dra den gjenværende væsken forsiktig langs brønngulvet mot midten av brønnen med pipettespissen. Pause i noen sekunder for å tillate strømmen av celler gjennom kanalen før du gjentar i den nedre brønnen (100.000 celler i 30-50 μL).
    2. Inkuber enheten ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 minutter for å tillate celletilknytning før du fyller opp de to nyoppussede MAB-frøbrønnene med ekstra vekstmedium (totalt 200 μL/brønn). Inkuber igjen ved 37 °C, 5 % CO2.
      MERK: Ingen middels endring er nødvendig på dag 17 på motorn neuron-siden av enheten. Dag 17 middels endring i henhold til den tidligere publiserte motor neuron differensieringsmetoden15 utføres i stedet på dag 18 (fredag).

7. Implementering av en volumetrisk og kjemoaktisk gradient for å fremme veksten av motoriske nevron neuritter mot MAB-rommet

  1. På dag 18, utfør en full middels endring på motor neuron side med dag 18 motor neuron medium (200 μL / brønn). Følg instruksjonene for middels endringer som er nevnt i trinn 5.5.1-5.5.2. Start MAB-differensieringen i MAB-rommet på enheten (tabell 2 og tabell 4).
    1. Vask MAB-rommene forsiktig én gang med DPBS før du tilsetter forvarmet MAB-differensieringsmedium (tabell 4) supplert med 0,01 μg/ml human agrin (200 μL/brønn).
      MERK: MASTERB vil smelte sammen og danne multinukleerte myotuber i løpet av en uke.
  2. På dag 21, i henhold til motor neuron differensieringsprotokollen (mandag), initier den kjemoaktiske og volumetriske gradienten (tabell 2 og tabell 3).
    1. Tilsett 200 μL/brønn av motorisk nevronbasal medium med 30 ng/ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF), glialcellelinje-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF) og cili nevrotrofisk faktor (CNTF), human agrin (0,01 μg/ml) og laminin (20 μg/ml) til myotube-rommet (tidligere definert som MAB-rommet). Tilsett motorisk nevron basal medium (100 μL / brønn) uten vekstfaktorer til motor neuron-rommet.
  3. Gjenta trinn 7.2 annenhver dag til dag 28 av motor neuron differensiering. Ingen medieskifte er nødvendig i helgene.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over motorenhetsprotokollen i mikrofluidiske enheter. Differensieringstidslinje og samkulturoversikt fra dag 0 til dag 28 i henhold til tidslinjen for motor neuron differensieringsprotokollen22. Motor neuron differensiering fra iPSCs er initiert på dag 0 og utført som nevnt tidligere for følgende 10 dager15. På dag 9 steriliseres enheten og belegges med PLO-laminin. MAB-er tines for utvidelse i T75-kolber. På dag 10 er motornevron-NPC-ene belagt i begge brønnene og kanalen til ett rom (lysegrå) av enheten, hvor deres differensiering i motornevroner fortsetter i en uke. MAB-er er belagt i begge brønnene og kanalen til det motsatte rommet (mørkegrå) på dag 17. På dag 18 er MABs differensiering i myotubes begynt. På dag 21 etableres en volumetrisk og kjemoaktisk gradient for å fremme motorisk nevron-neurittpolarisering gjennom mikrogroovene til enheten. Motornevronrommet fikk 100 μL/brønn av motorisk nevron basal medium uten vekstfaktorer (lysegrønn rom), mens myotube-rommet fikk 200 μL/brønn av motorisk nevron basal medium med 30 ng/ml vekstfaktorer (mørkegrønn rom) (tabell 2 og tabell 3). Kulturen fortsetter med den volumetriske og kjemosaktiske gradienten i ytterligere 7 dager til analyse på dag 28. Lysfeltbilder viser cellemorfologi på dag 0, dag 11, dag 18 og dag 28 dyrket i forhåndsmonterte mikrofluidiske enheter. Skalastang, 100 μm. Dette tallet er endret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celleillustrasjoner er endret fra Smart Server medical Art22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Fiksering og ICC

MERK: Alle trinn bør gjøres nøye for å forhindre løsrivelse av nevronkulturene. Ikke fjern væske fra kanalene i følgende trinn.

  1. Utfør fiksering i en avtrekkshette eller laminær strømning: Vask forsiktig alle brønnene i enheten en gang med DPBS før fiksering. Fest ved hjelp av 4 % paraformaldehyd (PFA) i DPBS i 15-20 min ved RT i laminærstrømmen (100 μL/brønn).
    FORSIKTIG: PFA er giftig: Håndtak i en avtrekkshette med personlig verneutstyr.
    1. Legg forsiktig 100 μL til toppen av enheten og vent noen sekunder for å la fikseringsløsningen strømme gjennom kanalen før du legger 100 μL til bunnbrønnen. Gjenta på den andre siden. Etter inkubasjon, fjern PFA-oppløsningen og vask forsiktig 3x i 5 min med DPBS. La det stå i 200 μL/brønn DPBS for lagring og forsegle 10 cm petriskål med parafilm for oppbevaring ved 4 °C til ICC-eksperimentet.
      MERK: Pass på at apparatene ikke tørker ut under lagring.
  2. Inkuber cellene med en permeabiliseringsløsning (100 μL/brønn) på 0,1% Triton X-100 i DPBS i 20 minutter ved RT på dag 1 av ICC-prosedyren. Fjern permeabiliseringsløsningen, og tilsett 5% normalt eselserum i 0,1% Triton X-100 / DPBS-løsning (100 μL / brønn) i 30 min ved RT.
  3. Fjern den 5% normale eselserumløsningen, og inkuber enheter med primære antistoffer (Materialtabell) i 2% normalt eselserum i 0,1% Triton X-100 / DPBS-løsning og inkuber ved 4 ° C over natten.
    1. Implementer en volumgradient. Tilsett 100 μL/brønn antistoffoppløsning på den ene siden av mikrogroovene og 150 μL/brønn på den andre (500 μL totalt per enhet).
      MERK: Det er mulig å bruke forskjellige antistoffer på hver side av mikrogroovene. I dette tilfellet må du ikke implementere en volumgradient med primære eller sekundære antistoffer på tvers av mikrogroover for å opprettholde den fluidiske isolasjonen mellom rom. Nevrittene i mikrogroovene vil ikke bli farget uten gradienten.
  4. Neste dag (dag 2 av ICC-prosedyren), fjern de primære antistoffene og vask enheten forsiktig 3x i 5 min med 0,1% Triton X-100 / DPBS-løsning.
    MERK: I lett avtakbare kulturer kan vasking 3x i 5 min erstattes med 1x i 30 min.
  5. Arbeid i mørket fra nå av, da sekundære antistoffer (Tabell over materialer) er lysfølsomme. Inkuber celler med sekundære antistoffer i 2 % normalt eselserum i 0,1 % Triton X-100/DPBS-løsning i 1 t ved RT. Implementer en volumgradient som angitt i trinn 8.3.1. Etter inkubasjon, fjern sekundære antistoffer og vask 3x i 5 min med DPBS.
  6. Merk det kjernefysiske DNA-et med DAPI i DPBS (100 μL/brønn) i 20 minutter ved RT etterfulgt av 3x-4x 5 min vask med 0,1% Triton X-100/DPBS-løsning. Fjern 0,1% Triton X-100/DPBS-løsningen fra alle brønner og la kulturen tørke i noen sekunder før du legger til en dråpe fluorescerende monteringsmedier i hver brønn for å forsegle.
    MERK: Hold enhetene horisontale i minst 24 timer slik at monteringsmediet kan stilles inn. Etter 24 timer kan enhetene lagres i et glidetilfelle ved 4 °C.
  7. Bilde i z-stabler med et invertert mikroskop.
    1. For å bilde NMJs, bruk en 40x mål for å finne myotubes merket med en myotube antistoff (Table of Materials) og utføre z-stack opptak for å sikre nevronal og myotube vev bildebehandling. Ta flere bilder i tilfelle myotuben er for stor til å passe inn i en enkelt ramme.
    2. For NMJ-kvantifisering teller du manuelt antall samlokaliseringer mellom en nevronal presynaptisk markør og en AChR-markør gjennom hver z-stabel. Normaliser antall samlokaliseringer til antall myotuber som finnes i z-stakken.

9. Fiksering og forberedelse av enheten for SEM

MERK: Når du skifter væske, må du alltid holde en liten mengde for å dekke kulturen for å unngå cellekollaps. Denne protokollen bruker svært giftige stoffer, og det er nødvendig å jobbe med personlig verneutstyr og i en avtrekkshette under hele prosessen.

  1. Fiksering og demontering: Forbered fersk 2,5 % glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer (pH 7,6), filtrer med et filter på 0,2 μm og varm opp til 37 °C.
    FORSIKTIG: GA og natriumkaktokylat er giftige: håndtak i en avtrekkshette med personlig verneutstyr.
    1. Vask enheten forsiktig en gang med DPBS for å fjerne mediet og celleavfallet og deretter prefikset med GA-løsning i 15 minutter ved RT.
    2. Bruk en skalpell til å kutte SEM-arket forsiktig til omkretsen av enheten mens du stabiliserer enheten med tang. Pass på at du ikke løsner enheten mens du skjærer. Flytt enheten og SEM-arket ved hjelp av tang til en 3 cm Petri-tallerken og legg 3 cm parabolen i en 10 cm tallerken for enkel håndtering.
    3. Etter 15 min med prefiks, fjern enheten forsiktig fra SEM-arket ved hjelp av tang. Løsne enheten i ett hjørne og fjern den sakte i diagonal retning mot motsatt hjørne. Vær oppmerksom på at cellene løsner fra enheten.
    4. Tilsett ekstra GA-løsning for å dekke hele SEM-arket i 3 cm parabolen og fortsett fikseringen i totalt 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C.
      MERK: Skyv SEM-arket forsiktig under GA-oppløsningen med tang ved å unngå celledekkede overflater.
  2. Fortsett med en standardprotokoll for SEM. Kort sagt, inkuber i osmium tetroxide etterfulgt av dehydrering med en gradert serie etanol. Sett SEM-arket inn i en deksleholder for kritisk punkttørking og montering på støttestubber for karbonklistremerker og belegg. Bruk et skanneelektronmikroskop til å avbilde ved en akselererende spenning på 5 kV og en arbeidsavstand på 7 mm.

10. Vurdering av NMJ-funksjonalitet ved bruk av levende celle kalsiumavbildning

  1. Klargjør enheter: Oppdater myotube-rommet med 200 μL/brønn på dag 18 motorisk nevronbasalmedium med 30 ng/ml BDNF, GDNF og CNTF og motornevronrommet med 200 μL/brønn av motorisk nevron basalmedium uten vekstfaktorer (tabell 2 og tabell 3).
    1. Tilsett Fluo-4 AM fargestoff fortynnet i Fluo-4 fargestoffløsningsmiddel til myotube-rommet ved en endelig konsentrasjon på 5 μM og inkuber enheten i mørket ved 37 °C, 5 % CO2 i 25 minutter. Mens enheten er under inkubasjon, fortynn kaliumklorid i motorisk nevron basal medium uten vekstfaktorer ved en endelig konsentrasjon på 450 mM.
      MERK: Fluo-4 AM er en kalsiumindikator, som viser en økning i fluorescens ved kalsiumbinding. Arbeid i mørket fra nå av, da fargestoffet er lysfølsomt.
    2. Etter 25 min, oppdater myotube-rommet med 200 μL / brønn på dag 18 motor neuron basal medium med 30 ng / ml BDNF, GDNF og CNTF og motor neuron-rommet med 100 μL / brønn av motorisk nevron basal medium uten vekstfaktorer for å gjenopprette den kjemosaktiske og volumetriske gradienten.
    3. For å blokkere NMJs, supplere myotube-kupémediet med 19 μM av AChR-konkurranseantagonisten tubocurarine hydroklorid pentahydrat.
      FORSIKTIG: Tubocurarine hydroklorid pentahydrat er giftig: håndtak i en avtrekkshette med personlig verneutstyr.
  2. Utfør opptak med et invertert konfektmikroskop utstyrt med en inkubator justert til 37 °C, 5 % CO2.
    1. Med en 10x målsetting, bruk den lyse feltkanalen for å finne myotubene i myotube-rommet. Juster laserkraften, forsterkningen og offset for 488-kanalen til et nivå der Fluo-4 fluorescens markerer de enkelte myotubene.
      MERK: Representative resultater ble anskaffet ved å justere rullefeltene i A1-innstillingene til programvaren til en lasereffekt på 5%, en gevinst på 60 (HV) og en offset på 0.
  3. Sett opptakstiden til 1 min med 1 s intervaller. Ta opp for 5-10 s å ha en basislinje, etterfulgt av umiddelbart stimulerende motoriske nevroner med kaliumkloridoppløsningen.
    1. Etter 5-10 s inn i opptaket, tilsett sakte 25 μL kaliumkloridoppløsning til en brønn i motornevronrommet for å nå en endelig konsentrasjon på 50 mM.
      MERK: Unngå å tilsette kaliumkloridoppløsningen for fort, da dette vil skape en bølge gjennom kanalen, noe som forårsaker artefakter på opptaket.
  4. Registrer myotube-rommet med motorisk nevronstimulering to ganger med en 2 min pause, etterfulgt av direkte stimulering med 25 μL kaliumkloridoppløsning av myotube-rommet for å vurdere direkte myotube-aktivitet uavhengig av motorisk nevrondepolarisering.
  5. For kvantifiseringer, ring hver myotube manuelt med opptaksprogramvaren og analyser Fluo-4 fluorescerende intensitet i løpet av 1-min tidsperioden. For å bestemme økningen i kalsiumtilstrømning, trekk den gjennomsnittlige basisverdien (dvs. gjennomsnittet fra de første 10 s før kaliumkloridstimulering) fra toppverdien etter stimulering med kaliumklorid. De representative resultatene ble anskaffet ved hjelp av programvarens Tidsmålingsverktøy.

Representative Results

Generering av NMJs i mikrofluidiske enheter
For å generere en menneskelig motorenhet med funksjonelle NMJs i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter, ble menneskelige iPSC-avledede motornevroner og humane MAB-avledede myotuber brukt. Kvaliteten på startcellematerialet er viktig, og spesielt fusjonsevnen til MAB-ene i myotubes er avgjørende for et vellykket resultat av denne protokollen. MASTERGRADer er enkle å holde i kultur. Det er imidlertid viktig å vurdere fusjonsevnen til hvert parti før du bruker dem på mikrofluidiske enheter (tilleggsfigur 1A, B)18. Eventuelle partier, som ikke viser myotubeformasjon etter 10 dager med differensiering, bør ikke brukes. Fusjonsindeksen i supplemental figur 1B ble bestemt ved å beregne prosentandelen av kjerner i myotubes positive for hver myotube-markør for det totale antall kjerner per bilde. Vi fant at en fusjonsindeks på ca. 8% var tilstrekkelig for vår samkultur i å generere NMJs.

Det er alltid viktig å starte en motorisk nevrondifferensiering fra en ren kultur av iPSCer. Jo renere inngangen - jo renere utfallet. Den motoriske nevrondifferensieringsprotokollen genererer motoriske nevronkulturer, som vanligvis er 85% -95% positive for motoriske nevronmarkører (Supplerende figur 1C, D) 18. De resterende cellene vil vanligvis være undifferentiated forløperceller, som i noen tilfeller vil gjennomgå omfattende spredning og herved ha en negativ innvirkning på kulturens kvalitet. For å få det beste resultatet av denne protokollen, bør motor neuron differensieringseffektivitet evalueres før du bruker dagen 10 motor neuron-NPCer i enheten. I tillegg kan en NPC-kvalitetskontroll utføres på dag 11 for å evaluere uttrykket til NPC-markøren Olig2 (Supplemental Figure 1E,F).

I utgangspunktet ble motornevron-NPCene og MAB-ene belagt samtidig på dag 10. Her ble MAB-differensieringen igangsatt på dag 11. Volum- og vekstfaktorgradienten implementert på dag 14 tillot oss å evaluere NMJ-formasjonen på dag 21, og dermed forkorte protokollen med en uke. Interessant nok kunne vi observere karakteristisk NMJ-formasjon ved ICC (Supplemental Figure 2A). Vi var imidlertid ikke i stand til å skaffe oss en funksjonell utgang via live-celle kalsiumopptakene så tidlig i motor neuron differensiering (data ikke vist). Vi konkluderte med at motornevronene ennå ikke var modne nok til å danne funksjonelle NMJ-forbindelser med myotubene, selv om NMJ-morfologien så lovende ut. Dette er i tråd med våre tidligere observasjoner at spontane virkningspotensialer i motornevroner, registrert gjennom patch-clamp elektrofysiologisk analyse, bare forekommer på dag 35 av motorisk nevrondifferensiering15.

I tillegg forsøkte vi å forlenge motorisk nevronmodning, så vel som samkulturens bærekraft, ved å modne motornevronene i enheten i 2 uker (dag 24), før vi plating MABs. Dessverre ble det observert en stor mengde spontan motor neuron-neuritt som krysset gjennom mikrogroover, noe som resulterte i hemming av MAB-vedlegg (Supplerende figur 2B). På grunn av mangelen på myotubeformasjon i kanalen, lyktes vi ikke med å identifisere NMJs på dag 36 og brukte derfor 28-dagersprotokollen (figur 1).

Identifisering, kvantifisering og morfologisk karakterisering av in vitro NMJs
Etter å ha fulgt 28-dagersprotokollen (figur 1), kunne fullt funksjonelle NMJs oppnås. Både in vivo og in vitro, NMJs er karakterisert immunohisto- eller immunocytokjemisk gjennom samlokalisering av en presynaptisk markør og en postsynaptisk markør. I denne studien ble det brukt en kombinasjon av neurofilament heavy chain (NEFH) og SYP som en presynaptisk markørkombinasjon, noe som tillot følgende av en enkelt nevritt fra soma av motornevronen mot den mest distale prosessen. På muskelsiden er Btx mye brukt som postsynaptisk markør for AChRs, og ble også brukt i denne studien. Tilskuddet av agrin og laminin fremmer klynger av AChRs på sarcolemma19,20,21, noe som gjør det lettere å identifisere AChRs in vitro og øker også antall AChRs og NMJs til stede18.

For å lokalisere og beregne NMJs på en objektiv måte, identifiseres hver myotube gjennom myosin heavy chain (MyHC)-positivitet og avbildet i z-stabler ved 40x forstørrelse ved hjelp av et invertert konfikalt mikroskop. I svært lange myotubes ble flere z-stabler anskaffet. For bildeanalyse telles antall samlokaliseringer mellom NEFH/SYP og Btx manuelt gjennom hver z-stabel, og antall samlokaliseringer normaliseres til antall myotuber som finnes i z-stakken (figur 2A-C)18. Ikke alle myotuber vil ha NMJs, som sett i kvantifiseringen av innervated myotubes (figur 2D). Følgelig er det viktig å utføre en objektiv opptakstilnærming, der alle myotubes er avbildet, uavhengig av Btx tilstedeværelse.

Det er mulig å identifisere to typer morfologier i dette in vitro-systemet . NMJs vises enten som enkeltkontaktpunkt NMJs, hvor en neuritt berører en klynge av AChRs på ett interaksjonspunkt, eller flere kontaktpunkt NMJs, hvor en nevritt vil vifte ut og engasjere seg med AChR-klyngen over en større overflate. Disse to morfologiene kan identifiseres både immunocytokjemisk (figur 2A)18 og med SEM (figur 2B)18, og kan også kvantifiseres (figur 2C)18. Totalt sett legger de mange kontaktpunktene til rette for en bredere forbindelse gjennom en stor muskelinnstøpning, som peker mot en mer moden NMJ-formasjon. Derimot anses enkeltkontaktpunktet NMJs som mindre modne på grunn av kulturens tidlige utviklingstilstand.

Funksjonell evaluering av in vitro NMJs
For å evaluere funksjonaliteten til NMJs ble live-celle kalsium forbigående opptak brukt (figur 3)18. Ved å dra nytte av det fluidisk isolerte systemet til de mikrofluidiske enhetene, ble den motoriske nevron soma-siden stimulert med en høy konsentrasjon (50 mM) kaliumklorid samtidig som den registrerte en tilstrømning i kalsium i myotubene, som ble lastet med kalsiumfølsomt Fluo-4-fargestoff (figur 3A). Nesten umiddelbart ved motorisk nevronaktivering kunne vi observere en kalsiumtilstrømning i myorørene gjennom en karakteristisk bølgeformasjon, som bekrefter en funksjonell forbindelse gjennom motornevron-neuritten og myotuben (figur 3A-C)18. Ingen spontane kalsiumbølger eller spontane myotube-sammentrekninger ble observert, selv om myotube-sammentrekning ved direkte stimulering med kaliumklorid ble observert. Spesifisiteten av forbindelsen ble ytterligere bekreftet ved å legge til den konkurransedyktige AChR-antagonisten, tubocurarine hydroklorid pentahydrate (DTC) til myotube-rommet (figur 3A), noe som resulterte i en hemming av kalsiumtilstrømning (figur 3C). Denne effekten bekreftet at forbindelsen mellom motornevroner og myotuber resulterte i fullt funksjonelle NMJs. For å evaluere antall aktive myotuber gjennom NMJ stimulering, ble myotube-rommet stimulert direkte med kaliumklorid for å identifisere det totale antallet aktive myotuber i dette rommet. Omtrent 70% av myotubene var aktive gjennom motorisk nevron-stimulert aktivering med kaliumklorid (figur 3D)18.

Disse resultatene bekrefter den optimale NMJ-formasjonen, antallet, morfologien og funksjonaliteten gjennom kokulturering av iPSC-avledede motornevroner og MAB-avledede myotuber i løpet av en 28-dagers protokoll.

Figure 2
Figur 2: NMJ-dannelse i mikrofluidiske enheter. (A) Konfokale mikrografer av NMJ-dannelse i ferdigmonterte mikrofluidiske enheter på dag 28. NMJs identifiseres gjennom samlokalisering (pilspisser) av presynaptiske markører (NEFH og SYP) og postsynaptisk AChR-markør (Btx) på MyHC-fargede myotuber. NMJs identifiseres morfologisk gjennom en eller flere kontaktpunktdannelse mellom nevritter og AChR-klynger. DAPI-etikettkjerner. Skalastang, 25 μm. Innsett viser en forstørrelse av en NMJ. Innfelt skala bar, 10 μm. (B) SEM av NMJ morfologi i silikon mikrofluidiske enheter på dag 28. Pilspisser skildrer nevrittinnbygging i myotuben. Skalastang, 2 μm. Innsett viser en forstørrelse av NMJ. Innfelt skala bar, 1 μm. (C) Kvantifisering av totalt antall NMJs per myotube samt antall enkelt- og flere kontaktpunkt NMJs per myotube. Graf vises som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet fra fire biologiske repliker. Statistisk signifikans bestemmes med Mann-Whitney-test med * p < 0,05. (D) Kvantifisering av prosentandelen av innerverte myotuber. Graf vises som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet fra fire biologiske repliker. Dette tallet er endret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bekreftelse av NMJ-funksjonalitet. (A) Skjematisk illustrasjon av live-celle forbigående kalsiumopptak av NMJ-funksjonalitet i forhåndsmonterte mikrofluidiske enheter på dag 28 før og etter NMJ-blokkering med tubocurarine (DTC)22. Motornevroner i det lysegrønne rommet stimuleres med 50 mM kaliumklorid (KCl), noe som forårsaker en intracellulær motorisk nevronrespons gjennom nevrittene. Dette fremkaller en tilstrømning av kalsium (Ca2+) i myotubes, som er merket med kalsiumfølsomme Fluo-4 fargestoff (mørkegrønn rom). (B) Fluo-4 fluorescensmikrografer av prestimulering, intensitetstopp og etterstimulering av en myotube som viser en bølge av intracellulær kalsiumøkning ved motorisk nevronstimulering med KCl. Inset viser en forstørrelse av en innervated aktiv myotube. Skalastenger, 100 μm. Innfelt skala bar, 200 μm. (C) Representative kalsium tilstrømning kurver i myotubes etter motor neuron stimulering med KCl (pil) bekrefter NMJ funksjonalitet. Myotube 1-3 viser karakteristiske kalsiumkurver gjennom motorisk nevron-myotube-innervasjon, mens myotube A-C DTC viser kurver etter NMJ-blokkering med DTC. (D) Forholdet mellom motor neuron-stimulerte aktive myotuber på totalt antall aktive myotuber. Dette tallet er endret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celleillustrasjoner er endret fra Smart Server medical Art22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Verifisering av motornevron, MAB-fusjonsindeks og NPC-kvalitetskontroll. (A) Konfokale bilder av MAB-avledede myotuber 10 dager etter oppstart av differensiering. Myotubes er merket med myotube markører: desmin, MyHC, myogenin (MyoG) og titin. Nuclei er farget med DAPI. Skalastang, 100 μm. (B) Kvantifisering av MAB fusjonsindeks 10 dager etter oppstart av differensiering. Ved sult smelter MABs inn i multinukleerte myotuber, som ble kvantifisert for myotube-markørpositivitet (AB +). Graf skildrer gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet fra tre biologiske repliker. (C) Konfokale bilder av iPSC-avledede motoriske nevroner på dag 28 av differensiering, som er merket med motoriske nevronmarkører NEFH, kolin acetyltransferase (ChAT) og Islet-1 i tillegg til pan-neuronal markør βIII-tubulin (Tubulin). Nuclei er farget med DAPI. Skalastenger, 75 μm. (D) Kvantifisering av antall celler, som er positive for motorisk nevron og pan-neuronal markører (AB +). Graf skildrer gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet fra tre biologiske repliker. (E) Konfokale bilder av iPSC-avledede NPCer på dag 11 av motorisk nevrondifferensiering, som er merket med NPC-markør Olig2 og pan-neuronal markør βIII-tubulin (Tubulin). Nuclei er farget med DAPI. Skalastenger, 50 μm. (F) Kvantifisering av antall NPCer, som er positive for Olig2 og βIII-tubulin (AB+). Graf skildrer gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet fra tre biologiske repliker. Dette tallet er endret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Optimalisering av samkulturprotokoll (A) Konfokale bilder av NMJ-dannelse på dag 21 av motorisk nevrondifferensiering, når MAB-er blir sådd samtidig som NPCer på dag 10. NMJs identifiseres gjennom samlokalisering (pilspisser) av presynaptiske markører (NEFH og SYP) og postsynaptisk AChR-markør (Btx) på MyHC-fargede myotuber. Skalastang (venstre), 10 μm. Skala bar (høyre), 5 μm. (B) Bright-field bilde av myotube-kanalen på dag 24 som viser spontan motor neuron-neuritt kryssing hemmer vedlegg av MAB. Skalalinje, 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Reagent Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon
IMDM 1x 80%
Fetal bovin serum 15%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/ml 0.5%
L-glutamin 50x 1%
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Ikke-essensielle aminosyrer 100x 1%
Insulin transferrin selen 100x 1%
bFGF (lagt til frisk) 50 μg/ml 5 ng/ml

Tabell 1: MAB vekstmedium. Medium kan vare 2 uker ved 4 °C. bFGF tilsetts friskt på bruksdagen.

Reagent Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon
DMEM/F12 50%
Nevrobasalt medium 50%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/ml 1%
L-glutamin 50x 0.5 %
N-2 supplement 100x 1%
B-27 uten vitamin A 50x 2%
β-mercaptoetanol 50 mM 0.1%
Askorbinsyre 200 μM 0,5 μM

Tabell 2: Motorisk nevron basal medium. Medium kan vare 4 uker ved 4 °C.

Dag Reagent Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Kupé
Dag 10/11 Utjevnet agonist 10 mM 500 nM Begge
Retinoinsyre 1 mM 0,1 μM
DAPT 100 mM 10 μM
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
Dag 14 DAPT 100 mM 20 μM Begge
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
Dag 16 DAPT 100 mM 20 μM Begge
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
CNTF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
Dag 18 BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Motorisk nevron
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
CNTF 0,1 mg/ml 10 ng/ml
Dag 21+ BDNF 0,1 mg/ml 30 ng/ml Myotube
GDNF 0,1 mg/ml 30 ng/ml
CNTF 0,1 mg/ml 30 ng/ml
Agrin 50 μg/ml 0,01 μg/ml
Laminin 1 mg/ml 20 μg/ml
Dag 21+ Ingen kosttilskudd Motorisk nevron

Tabell 3: Motor neuron medium kosttilskudd. Kosttilskudd legges friskt på bruksdagen til motor neuron basal medium.

Dag Reagent Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Kupé
Dag 18 DMEM/F12 97% MAB
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Hest serum 2%
Agrin 50 μg/ml 0,01 μg/ml

Tabell 4: MAB differensieringsmedium. Medium kan vare 2 uker ved 4 °C. Agrin tilsetts friskt på bruksdagen.

Discussion

Protokollen beskriver en relativt brukervennlig metode, som genererer menneskelige motorenheter med funksjonelle NMJs i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter på mindre enn 30 dager. Det er beskrevet hvordan NMJs kan vurderes morfologisk gjennom standardteknikker som ICC og SEM og funksjonelt gjennom live-celle kalsiumopptak.

En stor fordel med denne protokollen er bruk av stamcelleteknologi. Dette gir full tilpasningsevne der NMJs kan evalueres i både helse og sykdom, uavhengig av giverprofilen. Modellen har vist seg allerede vellykket og gunstig i ALS-forskning, der vi identifiserte svekkelser i nevrittutvekst,gjenvekst og NMJ-tall som nye fenotyper på grunn av mutasjoner i FUS-genet18. Med denne modellen er det mulig å utvide forskningen til å omfatte sporadiske former for ALS, hvor etiologien er ukjent, ved å bruke iPSCer fra sporadiske ALS-pasienter. Dette gir en fordel i forhold til tradisjonelle dyremodeller, som er avhengige av transgen overekspressering av muterte gener for å rekapitulere menneskelig sykdom23,24. I tillegg muliggjør vårt fullt menneskelige system potensiell recapitulation av menneskelig spesifikk fysiologi og sykdom. Tidligere studier viste forskjellene mellom gnager og human NMJ morfologi25, noe som antyder at forsiktighet må implementeres ved bruk av gnagere for å adressere menneskelig NMJ-patologi. Selv om dette systemet er et relativt enkelt in vitro-oppsett, som mangler kompleksiteten til en in vivo-modell, var det mulig å demonstrere at NMJ-morfologien som vises i mikrofluidiske enheter lignet NMJs av menneskelige amputater25. Videre tillater denne modellen NMJ-evaluering under NMJ-dannelse og modning, og potensielt avslører tidlige sykdomsfenotyper, som er fraværende, uidentifiserbare eller oversett i menneskelige post-mortem prøver.

MASTER gir et gyldig alternativ for å generere myotubes, selv om deres begrensede overlevelse på 10 dager er en ulempe med systemet. Myotube-overlevelsen er avhengig av deres tilknytning til overflaten, som sannsynligvis er kompromittert av spontane sammentrekninger av myofibers. Etter mer enn 10 dager vil de fleste myotubes ha løsnet, noe som gjør NMJ-kulturen ubrukelig. Ideelt sett vil myotubene også bli generert fra iPSCer. Dagens protokoller har imidlertid vist seg vanskelige å reprodusere26 på grunn av variasjon i fusjonsindeksen27,28,29,30.

Ved å bruke kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter genererte vi et standardisert system, som er fullt tilgjengelig. Andre NMJ-modeller finnes31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Imidlertid er de vanligvis avhengige av enkeltrom, som mangler oppdeling og fluidisk isolasjon mellom celletyper, eller på skreddersydde kulturfartøy, noe som reduserer tilgjengeligheten og potensielt også reproduserbarheten. De mikrofluidiske enhetene som brukes til denne protokollen kan kjøpes med mikrogroover av forskjellige lengder, noe som muliggjør videre analyse som axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersøkelser. Den fluidiske isolasjonen mellom rom muliggjør videre inndelt legemiddelbehandling av enten motoriske nevroner eller myotuber, noe som kan være gunstig i terapiutviklingen. Flere selskaper som spesialiserer seg på mikrofluidikk har dukket opp, som har åpnet opp for et stort utvalg av enhetsdesign og funksjoner, noe som ytterligere fremmer tilgjengeligheten for in vitro-forskning.

Til slutt har vi utviklet en protokoll som gir en pålitelig, allsidig og enkel metode for å dyrke menneskelige motorenheter med funksjonelle NMJs.

Disclosures

L.V.D.B. har patent på bruk av HDAC-hemmere i Charcot-Marie-Tooth sykdom (US-2013227717-A1), er en vitenskapelig medgrunnlegger av Augustine Therapeutics, og medlem av dets vitenskapelige rådgivende styre. De andre forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Nikky Corthout og Sebastian Munck fra LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) for deres råd om levende celle kalsium forbigående fluorescensopptak. Denne forskningen ble støttet av Fulbright-kommisjonen til Belgia og Luxembourg, KU Leuven (C1 og "Opening the Future" Fund), VIB, Agency for Innovation by Science and Technology (IWT; SBO-iPSCAF), "Fund for Scientific Research Flanders" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiske regjeringen (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initiert av Det belgiske føderale vitenskapspolitiske kontor), Thierry Latran Foundation og "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. og J.B. støttes av ph.d.-stipender tildelt av FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 Thermo Fisher Scientific B35451 Antibody (1:1000)
Acetic Acid CHEM-Lab NV CL00.0116.1000 Coating component. H226, H314. P280
Aclar 33C sheet (SEM sheet) Electron Microscopy Sciences 50425-25 Thickness: 7.8 mil
Agrin (recombinant human protein) R&D systems 6624-AG-050 Media supplement
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit Thermo Fisher Scientific A21206 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat Thermo Fisher Scientific A21432 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31570 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31571 Antibody (1:1000)
Ascorbic acid Sigma A4403 Media component
βIII-tubulin (Tubulin) Abcam ab7751 Antibody (1:500)
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 Media component. H317. P280.
B-27 without vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010 Media component
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-02B Growth factor
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) Peprotech 100-18B Growth factor
Choline acetyltransferase (ChAT) Millipore ab144P Antibody (1:500)
Collagen from calfskin Thermo Fisher Scientific 17104019 Coating component
CNTF (ciliary neurotrophic factor) Peprotech 450-13B Growth factor
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent Thermo Fisher Scientific R37605 Immunocytochemistry component
DAPT Tocris Bioscience 2634 Media supplement
Desmin Abcam Ab15200 Antibody (1:200)
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330032 Media component
DMSO Sigma D2650-100ML Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 no calcium, no magnesium
Ethanol VWR 20.821.296 Sterilization. H225. P280
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270106 Media component
Fluo-4 AM live cell dye Thermo Fisher Scientific F14201 Calcium imaging dye
Fluorescence Mounting Medium Dako S3023 Immunocytochemistry component
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-10B Growth factor
Glutaraldehyde Agar Scientific R1020 Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050122 Media component
Human alkaline phosphatase R&D systems MAB1448 Antibody
ImageJ software NIH ICC analysis
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440053 Media component
Insulin transferrin selenium Thermo Fisher Scientific 41400045 Media component
Islet-1 Millipore ab4326 Antibody (1:400)
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Cryopreservation component
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020-1MG Coating component and media supplement
Leica SP8 DMI8 confocal microscope Leica ICC confocal microscopy
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024 Media component
Myogenin (MyoG) Abcam Ab124800 Antibody (1:500)
Myosin heavy chain (MyHC) In-house, SCIL Antibody (1:20)
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048 Media component
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Coating and media component
Neurofilament heavy chain (NEFH) Abcam AB8135 Antibody (1:1000)
Nikon A1R confocal microscope Nikon Live-cell calcium imaging microscopy
NIS-Elements AR 4.30.02 software Nikon Live-cell calcium imaging analysis
Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140050 Media component
Normal donkey serum Sigma D9663-10ML Immunocytochemistry component
Olig2 IBL 18953 Antibody (1:1000)
Parafilm M Sigma P7793-1EA Storing equipment
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15070063 Media component
Petri dish (3 cm) nunc 153066 Diameter: 3 cm
Petri dish (10 cm) Sarstedt 833.902 Diameter: 10 cm
Plate (6-well) Cellstar Greiner bio-one 657160 Culture plate
Pluronic F-127 Thermo Fisher Scientific P3000MP Fluo-4 dye solvent
Poly-L-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Coating component
Potassium chloride CHEM-Lab NV CL00.1133.1000 Calcium imaging reagent
Retinoic acid Sigma R2625 Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell supplement Thermo Fisher Scientific A2644501 ROCK inhibitor solution
Smoothened agonist Merch Millipore 566660 Media supplement
Sodium cacodylate buffer Sigma C0250 Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Media component
Synaptophysin (SYP) Cell Signaling 5461S Antibody (1:1000)
T75 flask Sigma CLS3276 Culture plate
Titin Developmental Studies Hybridoma Bank 9D10 Antibody (1:300)
Triton X-100 Sigma T8787-250ML Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE express Thermo Fisher Scientific 12605010 MAB dissociation solution
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379-100G Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.
XonaChips pre-assembled microfluidic device Xona Microfluidics XC150 Microgroove length: 150 μm
Xona Silicone microfluidics device Xona Microfluidics SND75 Microgroove length: 75 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plomp, J. J. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).
  2. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
  3. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
  4. Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
  5. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  6. Martineau, É, Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973 (2018).
  7. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  8. Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
  9. So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
  10. Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
  11. Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
  12. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  15. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861 (2017).
  16. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
  17. Giacomazzi, G., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).
  18. Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
  19. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530 (2019).
  20. Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
  21. Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
  22. Smart Servier Medical Art. , Available from: https://smart.servier.com/ (2021).
  23. Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
  24. Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
  25. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  26. Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681 (2018).
  27. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  28. vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
  29. Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
  30. Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649 (2021).
  31. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  32. Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
  33. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
  34. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  35. Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299 (2019).
  36. Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473 (2015).
  37. Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049 (2012).
  38. Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537 (2019).
  39. Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
  40. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  41. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  42. Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
  43. Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335 (2018).
  44. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993 (2020).
  45. Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
  46. Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 175
Generering av menneskelige motorenheter med funksjonelle nevromuskulære veikryss i mikrofluidiske enheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E.… More

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E. N., Fumagalli, L., Vandoorne, T., Baatsen, P., Kerstens, A., Giacomazzi, G., Pavie, B., Rossaert, E., Beckers, J., Sampaolesi, M., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (175), e62959, doi:10.3791/62959 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter