Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62959
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 5, 3,4, 1,2, 1,2, 5, 1,2,6, 1,2
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Center for Brain & Disease Research, Laboratory of Neurobiology, , 3VIB Center for Brain & Disease Research, Research Group Molecular Neurobiology, , 4VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 5Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 6Department of Neurology, University Hospitals Leuven

Summary

Vi beskriver en metod för att generera mänskliga motor enheter i kommersiellt tillgängliga microfluidic enheter genom samodling mänskliga inducerad pluripotenta stamcell-härledda motor nervceller med mänskliga primära mesoangioblast-härledda myotubes som resulterar i bildandet av funktionellt aktiva neuromuskulära korsningar.

Abstract

Neuromuskulära korsningar (NMJs) är specialiserade synapser mellan axon av den nedre motoriska neuron och muskeln som underlättar engagemanget av muskelkontraktion. I motoriska neuron störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerera, vilket resulterar i muskelatrofi och progressiv förlamning. Den underliggande mekanismen för NMJ-degeneration är okänd, till stor del på grund av bristen på översättningsbara forskningsmodeller. Denna studie syftade till att skapa en mångsidig och reproducerbar in vitro-modell av en mänsklig motorenhet med funktionella NMJs. Därför var humanduced pluripotent stamcell (hiPSC)-härledda motor nervceller och mänskliga primära mesoangioblast (MAB)-härledda myotubes samkulturerade i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av fluidt isolerade mikrofack möjliggör underhåll av cellspecifika mikromiljö samtidigt som cell-till-cell-kontakt tillåts via mikrogrooves. Genom att tillämpa en chemotactic och volumetric gradient stimulerades tillväxten av motor neuron-neuriter genom mikrogrooves främja myotube interaktion och bildandet av NMJs. Dessa NMJs identifierades immunocytochemically genom samlokalisering av motor neuron presynaptic markör synaptophysin (SYP) och postsynaptic acetylkolin receptor (AChR) markör α-bungarotoxin (Btx) på myotubes och karakteriseras morfologiskt med skanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionen hos NMJs bekräftades genom att mäta kalcium svar i myotubes vid depolarization av motor nervceller. Den motorenhet som genereras med hjälp av vanliga mikrofluidiska enheter och stamcellsteknik kan bidra till framtida forskning med fokus på NMJs inom hälsa och sjukdom.

Introduction

NMJs underlättar kommunikationen mellan lägre spinal motor nervceller och skelettmuskulaturfibrer genom frisättning av signalsubstanser1. I motoriska neuron störningar som ALS och SMA, NMJs degenerera, vilket orsakar en störning i kommunikationen med musklerna2,3,4,5,6,7. Detta resulterar i att patienter gradvis förlorar sin muskelfunktion, vilket gör att de är rullstolsbundna och så småningom beroende av andningslivsstöd på grund av progressiv atrofi av vitala muskelgrupper som membranet. De exakta underliggande mekanismerna som ansvarar för denna djupgående förlust av NMJs i dessa störningar är okända. Många studier har gjorts på transgena djurmodeller, vilket har gett oss några insikter om patogenesen vid NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men för att fullt ut förstå patologin och motverka denervationen är det viktigt att ha ett mänskligt system, vilket möjliggör full tillgänglighet.

Här beskriver protokollet ett relativt enkelt sätt att generera mänskliga NMJs genom samodling av hiPSC-härledda motoriska nervceller och mänskliga primära MAB-härledda myotuber med kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av mikrofluidik för att polarisera och fluidiskt isolera somas och axoner av nervceller har varit känd sedan den första beskrivningen av "Campenot" kamrar12 i slutet av 1970-talet. Sedan dess har mer mikrofluidiska mönster tillverkats, inklusive kommersiella alternativ. De enheter som används i detta protokoll innehåller två fack, och varje fack består av två brunnar anslutna till en kanal13. De två facken är speglade och anslutna till flera mikrogrooves. Dessa mikrogrooves har en storlek som underlättar neurit tillväxt samtidigt upprätthålla fluidisk isolering mellan de två facken genom en kapillär hydrostatiskt tryck13,14. Med hjälp av detta system är det möjligt att odla motoriska nervceller i ett fack och muskelceller i det andra, var och en i deras specifika odlingsmedium, samtidigt som det underlättar en fysisk anslutning genom neuriter som passerar genom mikrogrationerna och engagerar sig med muskelcellerna. Denna modell ger ett fullt tillgängligt och anpassningsbart in vitro-system hos en mänsklig motorenhet, som kan användas för att studera tidig NMJ-patologi vid sjukdomar som ALS och SMA.

Protocol

Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner, som tillhandahöll sina prover för iPSC-generering och MAB-skörd. Förfarandet godkändes av den medicinska etikkommittén vid Universitetssjukhuset Leuven (n° S5732-ML11268) och av Storbritanniens viktigaste forskningsetiska kommitté som en del av StemBANCC-projektet. Alla reagenser och all utrustning som används i detta protokoll anges i materialförteckningen och bör användas sterilt. Media bör värmas upp till rumstemperatur (RT) före användning om inget annat anges. För en översikt över samkulturprotokollet, se figur 1.

1. Differentiering av motoriska neuronprogenitorer från iPSCs

  1. Följ motor neuron differentiering protokollet15, anpassad från en tidigare studie16, tills du når dag 10 neurala stamceller (NPCs) tillstånd. Enligt protokollets tidsram initieras differentieringen på en måndag (dag 0), vilket resulterar i dag 10 NPCs på en torsdag.
  2. Cryopreserve dag 10 NPCs i knock-out serum ersättning med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) med en densitet av 2 x 106- 4 x 106 celler per injektionsflaska.
    VARNING: DMSO är giftigt: hantera i en rökhuv med personlig skyddsutrustning.
    OBS: Cirka 50% av dagen 10 NPCs förväntas vara avgörande vid upptining. Stoppa det motoriska neurondifferentieringsprotokollet vid detta "dag 10 NPC"-tillstånd och kryopreservera NPCs för att generera ett stort antal NPC: er, som kan bankas och användas senare, vilket minskar längden på den totala tidslinjen för samkulturprotokollet från 28 dagar till 19 dagar totalt.

2. Härledning och underhåll av mänskliga MAB

OBS: MABs är fartyg-associerade mesenchymala stamceller, som i detta fall har skördats från tarmbiopsier som erhållits från en 58-årig friska givare. Alternativa kommersiella källor finns tillgängliga. Protokollet för att erhålla MAB förklaras kortfattat. För ytterligare information, se det detaljerade protokollet17. Alla MAB-medier bör värmas upp till 37 °C före användning.

  1. Hacka biopsivävnaden och inkubera på kollagen (från kalvskinn) belagda 6 cm rätter i ett tillväxtmedium (tabell 1) i 2 veckor. Byt medium var fjärde dag.
    1. För att förbereda kollagenbeläggning, lös upp 100 mg kollagen i 20 ml 0,1 M ättiksyra. Kollagen tar tid att lösa upp, så placera blandningen på en gungplattform över natten på RT. Följande dag, fyll på med 80 ml ddH2O till en slutlig volym på 100 ml.
      VARNING: Ättiksyra är giftigt; handtag i en rökhuv med personlig skyddsutrustning.
      OBS: Kollagen från kalvskinnsbeläggning kan återanvändas upp till 5x. Förvara vid 4 °C.
    2. Täck hela ytan av skålen eller kolven med kollagen, stäng och inkubera i 20 minuter vid RT inuti ett laminärt flöde. Efter 20 minuter, återvinn kollagenet i en färsk behållare, stäng den tomma skålen/kolven och lämna i 10 min vid RT i laminärt flöde.
    3. Överför skålen/kolven till inkubatorn för inkubation över natten (eller minst 6 h) inkubation (37 °C, 5 % CO2). Tvätta 5x med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan kalcium eller magnesium (DPBS) innan du pläterar celler.
  2. Efter 14 dagar sorterar FACS (fluorescerande aktiverad cellsortering) MABs för human alkaliska fosfatas17 följt av ytterligare expansion. Behåll MAB på kollagenbelagda T75-flaskor i tillväxtmediet och byt tillväxtmedium varannan dag (10 ml per kolv).
  3. Cryopreserve, passage eller frö MABs i enheter när du når 70% sammanflöde.
    OBS: MABs förlorar sin myogena potential på grund av spontana fusioner vid cell-till-cell kontakt. Se till att inte överskrida 70% sammanflöde när du expanderar MAB. En 70% sammanflytande T75-kolv innehåller cirka 600 000-800 000 celler, som kan kryopreserveras vid 100 000 celler per flaska. Varje injektionsflaska kan senare tinas upp och sås i en T75-kolv för expansion.
  4. För att passera MAB, tvätta dem försiktigt en gång med 7 ml DPBS och inkubera sedan i 7 ml MAB-dissociationslösning i 3 min vid 37 °C i 5% CO2 för att separera cellerna.
    1. Neutralisera MAB-dissociationslösningen med 7 ml av tillväxtmediet, skrapa försiktigt cellerna och överför cellfjädringen till ett 50 ml centrifugrör. Tvätta försiktigt kolven med ytterligare 5 ml av tillväxtmediet för att samla in potentiellt återstående MABs.
    2. Centrifugera cellfjädringen i 3 min vid 300 x g, passage sedan direkt till en ny kollagenbelagd T75-kolv för expansion, kryopreserv i knock-out serum ersättning med 10% DMSO eller räkna till frö i en mikrofluidisk enhet.
      OBS: Passager utförs 1x-2x per vecka för cellexpansion tills ett maximalt passagenummer på 13. Vid dissociation verkar MAB sfäriska och stora i form när de undersöks under mikroskopet.

3. Beredning av förmonterade mikrofluidiska anordningar - Dag 9

OBS: Protokollet är anpassat från den mikrofluidiska enhetstillverkarens neuronenhetsprotokoll och har justerats för användning av både förmonterade och silikonanordningar. Här används förmonterade enheter för immunocytokemi (ICC) och levande kalcium transienta inspelningar, medan silikonanordningar används för SEM. Tidslinjen för protokollet följer tidslinjen för motor neuron differentiering protokollet.

  1. Förbered de mikrofluidiska enheterna dagen före såddceller, eftersom beläggningen måste inkuberas över natten. Enligt motor neuron protokollet, detta kommer att vara en onsdag. Tillsätt ~ 10 ml 70%-100% etanol till en 10 cm Petriskål. Använd tång för att överföra enheten från fraktbehållaren till Petri-skålen för sterilisering.
  2. Dränk enheten i etanol i 10 s och överför enheten med tång till ett papper för att lufttorka i laminärt flöde i ~ 30 min. Vänd enheten några gånger så att båda sidor kan torka. När enheten är torr, använd tång för att flytta varje enhet till en individuell 10 cm Petriskål för enkel hantering
    VARNING: Etanol är giftigt; handtag i rökhuv med personlig skyddsutrustning
  3. Täck anordningen med Poly-L-ornitin (PLO) (100 μg/ml) i DPBS och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 i 3 timmar.
    1. Använd en P200-pipett för att lägga till 100 μL PLO i DPBS i en toppbrunn så nära kanalöppningen som möjligt och observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen. Lägg sedan till 100 μL PLO i DPBS till bottenbrunnen.
    2. Upprepa på andra sidan av mikrogroverna och avsluta med att tillsätta 100 μL på ena sidan av enheten för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att belägga mikrogroverna (t.ex. höger sida 200 μL, vänster sida 300 μL). Tvätta enheten 3x i 5 minuter efter 3 timmar med DPBS. Använd ett sugsystem om det behövs.
      OBS: Se till att undvika luftbubblabildning i kanalerna när som helst under beläggningen eller odlingen av cellerna. Även små bubblor kommer att expandera under en kort tid, vilket hämmar beläggning, cellsådd eller medieflöde över kanalen. Om vätskan stannar i kanalen under beläggningen, återanvänd PLO-lösningen direkt i kanalen från båda sidor. Om det fortfarande finns bubblor, använd 200 μL DPBS för att spola kanalen och upprepa beläggningsprocessen enligt ovan i steg 3.3.1-3.3.2. Om bubblor uppträder efter cellsådd är det omöjligt att återställa enheten, eftersom spolning av kanalen kommer att skada cellerna.
  4. Täck enheten med laminin (20 μg/ml) i ett neurobaserat medium och inkubera över natten vid 37 °C, 5% CO2. Följ samma anvisningar för PLO-beläggning från steg 3.3.1-3.3.2.
  5. Följande dag, använd en P200-pipett och placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen för att ta bort lamininbeläggningen från brunnarna. Lägg till DPBS i alla brunnar och lämna enheterna med DPBS i laminärt flöde vid RT för cellsådd.
    OBS: Från och med nu är det viktigt att inte ta bort vätska (lamininbeläggning, DPBS, media, fixeringslösning etc.) direkt från kanalerna, eftersom detta kan orsaka luftbubblabildning. Inspektera alltid enheterna under mikroskopet innan du sår celler.

4. Beredning av mikrofluidiska silikonanordningar - Dag 9

  1. Förbered silikonmikrofluidiska enheter dagen före såddceller, eftersom beläggningen måste inkuberas över natten. Enligt motor neuron protokollet, detta kommer att vara en onsdag.
    1. Tillsätt ~ 10 ml 70%-100% etanol till en 10 cm Petriskål. Använd en tång för att överföra enheten från fraktbehållaren till Petri-skålen för sterilisering. Dränk enheten i etanol i 10 s och överför med tång till en brunn i en 6-brunnsplatta för att lufttorka i laminärt flöde i ~ 30 min. Placera enheten på sidan så att alla sidor kan torka.
    2. Skär ned SEM-arken till enhetens storlek (lämna några mm på varje sida). Upprepa steriliseringen enligt ovan i steg 4.1.1. Överför sedan med tång till en 10 cm Petri-maträtt för att torka. Två-tre SEM-ark får plats i en rätt.
  2. Täck anordningarna och SEM-arken med PLO (100 μg/ml) i DPBS och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 för 3 timmar.
    1. Tillsätt 1 ml PLO i DPBS per brunn till varje enhet i 6-brunnsplattan. Se till att enheten flyter ovanpå PLO-lösningen med kanal- och mikrogroovsidan vänd nedåt i vätskan. Tillsätt 10 ml PLO i DPBS per 10 cm Petriskål och använd tång för att trycka ner SEM-arken i vätskan.
      OBS: SEM-ark flyter vanligtvis ovanpå beläggningslösningen. Innan du monterar enheten och arket, vänd SEM-arket så att ytan, som har varit i kontakt med PLO, kontaktar enhetens kanal- och mikrogroovyta.
    2. Efter 3 h, tvätta enheten och SEM-arken 2x i 5 min med DPBS följt av ytterligare en tvätt i 5 min med sterilt vatten. Använd ett sugsystem om det behövs. Överför varje SEM-ark till en individuell 10 cm Petriskål för enkel hantering.
      OBS: Både enheter och SEM-ark måste vara helt torra före montering. Den slutliga tvätten med sterilt vatten avlägsnar potentiella saltkristaller från DPBS, vilket annars kan hämma monteringen.
  3. Arbeta under ett mikroskop i ett laminärt flöde. Använd tång för att montera silikonanordningen med kanalen och mikrogroovsidan nedåt i 90° vinkel på SEM-arket, så att alla sidor är i linje. Tryck lätt ner på enheten för att se till att försegla inte bara ytterkanter utan också runt brunnar, kanaler och mikrogrooves.
    OBS: Bonded områden kommer att se gråa, medan de som ännu inte är monterade kommer att visas tydliga under mikroskopet. Se till att alla områden är väl förseglade utan luftbubblor för att undvika att enheten lossnar under odlingen. Vid skräp eller saltkristaller som blockerar monteringen, tvätta om både SEM-ark och anordning i sterilt vatten och torka innan monteringsförfarandet återupptas. Om mikrogrvrarna verkar förvrängda från att trycka för hårt på enheten, ta bort enheten helt från SEM-arket och försök montera igen. Var försiktig när du täcker och byter media när enheten är monterad.
  4. Arbeta under ett mikroskop i ett laminärt flöde. Täck enheten med laminin (20 μg/ml) i ett neurobaserat medium och inkubera över natten vid 37 °C, 5% CO2.
    OBS: Inkubation över natten härdar silikonanordningen och förseglar den ytterligare på SEM-arket.
    1. Använd en P200-pipett för att tillsätta 100 μL av lamininlösningen i en toppbrunn så nära kanalöppningen som möjligt och observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen. Kontrollera om det finns läckage runt brunnen och kanalen.
    2. Tillsätt därefter 100 μL lamininlösning till bottenbrunnen och kontrollera om det finns läckage. Upprepa på andra sidan av mikrogroverna och avsluta med ytterligare 100 μL på ena sidan av enheten för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att belägga mikrogroverna (t.ex. höger sida 200 μL, vänster sida 300 μL).
      OBS: Vid läckage, ta bort lamininbeläggningen, demontera enheten och SEM-arken och tvätta båda i sterilt vatten. Låt dem torka och upprepa från steg 4.3 och framåt.
    3. Följande dag, ta bort beläggningen från brunnarna med en P200-pipett genom att placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen. Lägg till DPBS i alla brunnar och lämna enheterna med DPBS i laminärt flöde vid RT för cellsådd.
      OBS: Från och med nu, ta inte bort vätska (lamininbeläggning, DPBS, media, fixeringslösning etc.) direkt från kanalerna, eftersom detta kan orsaka luftbubblabildning. Inspektera alltid enheterna under mikroskopet innan du sår celler.

5. Plätering av NPC:er i mikrofluidiska enheter - dag 10

OBS: Enligt motor neuron differentiering protokollet15, plätering av dag 10 NPCs sker på en torsdag.

  1. Använd ny dissocierad dag 10 NPCs15, eller tina 1-2 injektionsflaska bankade NPCs per 10 ml dag 10 motor neuron medium (tabell 2 och tabell 3) med ROCK-hämmare (10 μL/ml) lösning, och centrifugera cell suspensionen vid 100 x g i 4 min.
  2. Återanvänd cellpelleten i 500-1000 μL dag 10 motorisk neuronmedium med ROCK-hämmare (10 μL/ml) lösning och räkna levande celler med valfri räkningsmetod.
    OBS: Som anges nedan, se till att återanvända npc:erna till rätt mängd media för att rymma en optimal såddvolym.
  3. Ta bort DPBS från två brunnar på ena sidan av mikrogroverna i enheten med en P200-pipett och frö 250 000 NPC per enhet i 60-100 μL dag 10 motor neuron media.
    1. I den övre högra brunnen, frö 30-50 μL av cellupphängningen (125 000 celler) nära kanalöppningen i 45° vinkel och dra den återstående vätskan försiktigt längs brunnsgolvet mot mitten av brunnen med pipettens spets.
    2. Pausa i några sekunder så att cellupphängningen kan flöda genom kanalen innan du upprepar detta i den nedre brunnen (125 000 celler i 30-50 μL). Använd en penna för att markera den sådda sidan "NPC" eller motsvarande för enkel orientering av enheten utan mikroskop.
    3. Inkubera anordningen vid 37 °C, 5% CO2 i 5 minuter för att tillåta cellfäste innan du fyller på de tvåsådda brunnarna med ytterligare en dag 10 motor neuron medium (totalt 200 μL/brunn) och inkubera igen vid 37 °C, 5% CO2.
      OBS: Varje brunn kan innehålla 200 μL. Såddceller i både brunnar och kanaler säkerställer en robust struktur av kulturen, vilket minskar risken för cellavlossning vid medieförändringar. Det är möjligt att så färre celler i bara kanalen. Detta kommer dock att göra kulturen mer mottaglig för volymströmmen genom kanalerna under varje mediumändring.
  4. Använd en P200-pipett för att ta bort DPBS från de två brunnarna på andra sidan mikrogroverna mittemot de nysådda NPC: erna. Tillsätt sedan 6 ml DPBS per 10 cm skål runt enheten för att förhindra avdunstning av mediet under inkubation.
    Lägg till ytterligare DPBS runt enheten under kulturperioden om det behövs.
  5. Utför en full motor neuron medium förändring i båda facken på enheten på dag 11 (fredag), dag 14 (måndag) och dag 16 (onsdag) (tabell 2 och tabell 3). Lägg till färska medietillskott på dagen för mediumförändringen.
    OBS: Från och med nu utför du alla medelstora ändringar med en P200-pipett. Placera alltid pipettens spets bort från kanalen vid brunnens kant och ta inte bort vätska direkt från kanalen. Var försiktig så att silikonanordningarna inte lossnar. Borttagning och tillsats av medium bör göras långsamt för att förhindra cellavlossning.
    1. Ta försiktigt bort alla medier i båda brunnarna med NPC:er genom att placera P200-pipettspetsen i brunnsväggens underkant mittemot kanalöppningen. Tillsätt långsamt 50-100 μL färsk motorneuronmedium till toppen genom att placera P200-pipettspetsen vid brunnsväggens övre kant mittemot kanalöppningen.
    2. Pausa i några sekunder för att låta mediet flöda genom kanalen innan du lägger till 50-100 μL motorneuronmedium till bottenbrunnen. Upprepa denna process försiktigt tills båda brunnarna innehåller 200 μL/brunn. Upprepa på sidan utan celler.

6. Plätering av MAB i mikrofluidiska enheter - Dag 17

  1. Ungefär 7 dagar före sådd av MAB i mikrofluidiska enheter (dag 10 av motorisk neurondifferentiering), tina MABs och så dem i tillväxtmediet (tabell 1) i en T75-kolv belagd med kollagen för att möjliggöra tillräcklig cellexpansion. Se avsnitt 2.
  2. På dag 17 av motor neuron differentiering (torsdag), dissociate MABs som förklaras i steg 2.4, återanvända cellpellet i ~ 500 μL av tillväxtmediet och räkna levande celler med någon föredragen räkningsmetod.
    OBS: Som anges nedan, se till att återanvända MAB till rätt mängd media för att rymma optimal såddvolym.
  3. Ta bort motorneuronmediet på mikrogrationernas osedda sida i enheten med en P200-pipett, tvätta försiktigt med DPBS och frö 200 000 MAB per enhet i 60-100 μL tillväxtmedium.
    1. I den övre högra brunnen, frö 30-50 μL cellfjädring (100 000 celler) nära kanalöppningen i 45° vinkel och dra den återstående vätskan försiktigt längs brunnsgolvet mot brunnens mitt med pipettens spets. Pausa i några sekunder för att tillåta flödet av celler genom kanalen innan du upprepar i den nedre brunnen (100 000 celler i 30-50 μL).
    2. Inkubera enheten vid 37 °C, 5% CO2 i 5 minuter för att tillåta cellfäste innan de fyller på de två nykära MAB-sådda brunnarna med ytterligare tillväxtmedium (totalt 200 μL/brunn). Inkubera igen vid 37 °C, 5% CO2.
      OBS: Ingen medelstor förändring behövs dag 17 på enhetens motoriska neuronsida. Dag 17 medium förändring enligt den tidigare publicerade motor neuron differentieringsmetoden15 utförs istället på dag 18 (fredag).

7. Införande av en volymetrisk och chemotactic gradient för att främja tillväxten av motoriska neuron neuriter mot MAB-facket

  1. På dag 18, utför en fullständig medium förändring på motor neuron sidan med dag 18 motor neuron medium (200 μL/well). Följ anvisningarna för de medelstora ändringar som nämns i steg 5.5.1-5.5.2. Initiera MAB-differentieringen i enhetens MAB-fack (tabell 2 och tabell 4).
    1. Tvätta noggrant MAB-facken en gång med DPBS innan du lägger till förvärmt MAB-differentieringsmedel (tabell 4) kompletterat med 0,01 μg/ml human agrin (200 μL/brunn).
      OBS: MABs kommer att smälta och bilda multinukleära myotuber under en vecka.
  2. På dag 21, enligt det motoriska neuron differentieringsprotokollet (måndag), initiera den chemotaktiska och volymetriska gradienten (tabell 2 och tabell 3).
    1. Tillsätt 200 μL/brunn av motorisk neuron basalmedium med 30 ng/mL av hjärnan-härledd neurotrofisk faktor (BDNF), gliacelllinje-härledd neurotrofisk faktor (GDNF) och ciliary neurotrofisk faktor (CNTF), human agrin (0,01 μg/mL) och laminin (20 μg/mL) till myotube-facket (tidigare definierat som MAB-facket). Tillsätt motorisk neuron basalmedium (100 μL/brunn) utan tillväxtfaktorer i motorisk neuronfacket.
  3. Upprepa steg 7,2 varannan dag fram till dag 28 av den motoriska neurondifferentiering. Inga medieförändringar behövs under helgerna.

Figure 1
Bild 1: Schematisk översikt över motorenhetsprotokollet i mikrofluidiska enheter. Differentiering tidslinje och samkultur översikt från dag 0 till dag 28 enligt tidslinjen för motor neuron differentiering protokollet22. Motor neuron differentiering från iPSCs initieras på dag 0 och utförs som tidigare anges för följande 10 dagar15. På dag 9 steriliseras enheten och beläggas med PLO-laminin. MABs tinas för expansion i T75-flaskor. På dag 10 pläteras motoriska neuron-NPCs i både brunnar och kanalen för ett fack (ljusgrå) av enheten, där deras differentiering i motoriska nervceller fortsätter i en vecka. MABs är pläterade i både brunnar och kanalen i det motsatta facket (mörkgrå) dag 17. På dag 18 påbörjas MABs differentiering i myotubes. På dag 21 upprättas en volymetrisk och chemotactic gradient för att främja motor neuron-neurit polarisering genom mikrogrooves av enheten. Motor neuron facket fick 100 μL/brunn av motor neuron basal medium utan tillväxtfaktorer (ljusgrönt fack), medan myotube facket fick 200 μL/brunn av motor neuron basal medium med 30 ng/mL tillväxtfaktorer (mörkgrönt fack) (tabell 2 och tabell 3). Kulturen fortsätter med den volymetriska och chemotactic gradienten i ytterligare 7 dagar fram till analys på dag 28. Ljusfältsbilder visar cellmorfologi på dag 0, dag 11, dag 18 och dag 28 odlade i förmonterade mikrofluidiska enheter. Skalstång, 100 μm. Denna siffra har ändrats från Stoklund Dittlau, K. et al.18. Cellillustrationer har ändrats från Smart Server medical Art22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

8. Fixering och ICC

OBS: Alla åtgärder bör göras noggrant för att förhindra att neuronala kulturer lossnar. Ta inte bort vätska från kanalerna under följande steg.

  1. Utför fixering i en rökhuv eller laminärt flöde: Tvätta noggrant alla brunnar i enheten en gång med DPBS före fixering. Fixera med 4 % paraformaldehyd (PFA) i DPBS i 15-20 min vid RT i laminärt flöde (100 μL/brunn).
    VARNING: PFA är giftigt: handtag i en rökhuv med personlig skyddsutrustning.
    1. Tillsätt försiktigt 100 μL till enhetens övre brunn och vänta några sekunder för att låta fixeringslösningen flöda genom kanalen innan du lägger till 100 μL till bottenbrunnen. Upprepa på andra sidan. Efter inkubation, ta bort PFA-lösningen och tvätta försiktigt 3x i 5 min med DPBS. Lämna i 200 μL/well DPBS för förvaring och försegla 10 cm petriskålen med parafilm för att lagra vid 4 °C tills ICC-experimentet.
      OBS: Se till att enheterna inte torkar ut under lagringen.
  2. Inkubera cellerna med en permeabiliseringslösning (100 μL/brunn) på 0,1% Triton X-100 i DPBS i 20 minuter vid RT dag 1 i ICC-proceduren. Ta bort permeabiliseringslösningen och tillsätt 5% normalt åsneserum i 0,1% Triton X-100/DPBS-lösning (100 μL/brunn) i 30 min vid RT.
  3. Ta bort den 5% normala åsneserumlösningen och inkubera enheter med primära antikroppar (Table of Materials) i 2% normalt åsneserum i 0,1% Triton X-100/DPBS-lösning och inkubera vid 4 °C över natten.
    1. Implementera en volymgradient. Tillsätt 100 μL/brunn antikroppslösning på ena sidan av mikrogroverna och 150 μL/brunn på den andra (500 μL totalt per enhet).
      OBS: Det är möjligt att använda olika antikroppar på vardera sidan av mikrogrationerna. I detta fall, implementera inte en volymgradient med primära eller sekundära antikroppar över mikrogrooves för att upprätthålla den fluida isoleringen mellan facken. Neuriterna i mikrogroverna kommer inte att färgas utan gradienten.
  4. Följande dag (dag 2 av ICC-proceduren), ta bort de primära antikropparna och tvätta försiktigt enheten 3x i 5 min med 0,1% Triton X-100/DPBS-lösning.
    OBS: I lätt avtagbara kulturer kan tvättning 3x i 5 min ersättas med 1x i 30 min.
  5. Arbeta i mörkret från och med nu, eftersom sekundära antikroppar (Materialregistret) är ljuskänsliga. Inkubera celler med sekundära antikroppar i 2% normalt åsneserum i 0,1% Triton X-100/DPBS-lösning i 1 h vid RT. Implementera en volymgradient enligt steg 8.3.1. Efter inkubation, ta bort de sekundära antikropparna och tvätta 3x i 5 min med DPBS.
  6. Märk kärn-DNA med DAPI i DPBS (100 μL/well) i 20 min vid RT följt av 3x-4x 5 min tvätt med 0,1% Triton X-100/DPBS lösning. Ta bort 0,1% Triton X-100/DPBS-lösningen från alla brunnar och låt kulturen torka i några sekunder innan du lägger till en droppe fluorescerande monteringsmedier i varje brunn för att täta.
    OBS: Håll enheterna horisontella i minst 24 timmar så att monteringsmediet kan ställas in. Efter 24 timmar kan enheterna förvaras i ett glidhölje vid 4 °C.
  7. Bild i z-staplar med ett inverterat mikroskop.
    1. För att avbilda NMJs, använd ett 40x-mål för att hitta myotuberna markerade med en myotube-antikropp (Table of Materials) och utför z-stackinspelningar för att säkerställa neuronal och myotube vävnad imaging. Ta flera bilder om myotuben är för stor för att passa in i en enda ram.
    2. För NMJ-kvantifiering räknar du manuellt antalet samlokaliseringar mellan en neuronal presynaptisk markör och en AChR-markör genom varje z-stack. Normalisera antalet samlokaliseringar till antalet myotuber som finns i z-stacken.

9. Fixering och förberedelse av enheten för SEM

OBS: Vid byte av vätskor, håll alltid en liten mängd för att täcka kulturen för att undvika cellkollaps. Detta protokoll använder mycket giftiga ämnen, och det är nödvändigt att arbeta med personlig skyddsutrustning och i en rökhuv under hela processen.

  1. Fixering och demontering: Förbered färsk 2,5% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumkacodylatbuffert (pH 7,6), filtrera med ett 0,2 μm-filter och värm upp till 37 °C.
    VARNING: GA och natriumkacodylat är giftiga: hantera i en rökhuv med personlig skyddsutrustning.
    1. Tvätta försiktigt enheten en gång med DPBS för att ta bort media och cellrester och prefix med GA-lösning i 15 min på RT.
    2. Använd en skalpell för att försiktigt skära SEM-arket till enhetens omkrets samtidigt som du stabiliserar enheten med tång. Se till att inte lossa enheten när du klipper. Flytta enheten och SEM-arket med hjälp av tång till en 3 cm Petriskål och placera 3 cm skålen i en 10 cm skål för enkel hantering.
    3. Efter 15 minuters prefix, ta försiktigt bort enheten från SEM-arket med tång. Lossa enheten i ett hörn och ta långsamt bort den i diagonal riktning mot motsatt hörn. Observera cellerna lossnar från enheten.
    4. Tillsätt ytterligare GA-lösning för att täcka hela SEM-arket i 3 cm skålen och fortsätt fixeringen i totalt 2 h vid RT eller över natten vid 4 °C.
      OBS: Tryck försiktigt SEM-arket under GA-lösningen med tång genom att undvika celltäckta ytor.
  2. Fortsätt med ett standardprotokoll för SEM. Kort sagt, inkubera i osmium tetroxid följt av uttorkning med en graderad serie etanol. Sätt in SEM-arket i en täckhållare för torkning av kritisk punkt och montera på stödstubbar för kolklistermärken och beläggning. Använd ett scanningelektronmikroskop för att avbilda vid en accelererande spänning på 5 kV och ett arbetsavstånd på 7 mm.

10. Bedömning av NMJ-funktionalitet med hjälp av kalciumavbildning i levande celler

  1. Förbered enheter: Uppdatera myotubefacket med 200 μL/brunn dag 18 motor neuron basal medium med 30 ng/mL BDNF, GDNF och CNTF och motor neuron facket med 200 μL/brunn av motor neuron basal medium utan tillväxtfaktorer (tabell 2 och tabell 3).
    1. Tillsätt Fluo-4 AM färgämne utspädd i Fluo-4 färglösningsmedel till myotubefacket vid en slutlig koncentration av 5 μM och inkubera enheten i mörker vid 37 °C, 5% CO2 i 25 min. Medan enheten är under inkubation, späd kaliumklorid i motorisk neuron basal medium utan tillväxtfaktorer vid en slutlig koncentration av 450 mM.
      OBS: Fluo-4 AM är en kalciumindikator, som uppvisar en ökning av fluorescens vid kalciumbindning. Arbeta i mörkret från och med nu, eftersom färgämnet är ljuskänsligt.
    2. Efter 25 min, uppdatera myotube facket med 200 μL/brunn dag 18 motor neuron basal medium med 30 ng/mL BDNF, GDNF och CNTF och motor neuron facket med 100 μL/brunn av motor neuron basal medium utan tillväxtfaktorer för att återupprätta chemotactic och volymetrisk gradient.
    3. För att blockera NMJs, komplettera myotubefackets medium med 19 μM av AChR konkurrenskraftiga antagonist tubocurarine hydroklorid pentahydrat.
      VARNING: Tubocurarine hydroklorid pentahydrat är giftigt: hantera i en rökhuv med personlig skyddsutrustning.
  2. Utför inspelningar med ett inverterat konfokalmikroskop utrustat med en inkubator justerad till 37 °C, 5% CO2.
    1. Med ett 10x-mål kan du använda den ljusa fältkanalen för att hitta myotuberna i myotubefacket. Justera lasereffekten, förstärkningen och förskjutningen för 488-kanalen till en nivå där Fluo-4 fluorescens markerar de enskilda myotuberna.
      OBS: Representativa resultat förvärvades genom att justera rullningslisterna i programvarans A1-inställningar till en lasereffekt på 5%, en vinst på 60 (HV) och en förskjutning på 0.
  3. Ställ in inspelningstiden på 1 min med 1 s intervall. Registrera för 5-10 s att ha en baslinje, följt av omedelbart stimulera motoriska nervceller med kaliumkloridlösningen.
    1. Efter 5-10 s i registreringen, tillsätt långsamt 25 μL kaliumkloridlösning till en brunn i motoriska neuronfacket för att nå en slutlig koncentration på 50 mM.
      OBS: Undvik att tillsätta kaliumkloridlösningen för snabbt eftersom detta skapar en våg genom kanalen, vilket orsakar artefakter på inspelningen.
  4. Spela in myotube-facket med motorisk neuronstimulering två gånger med en 2 min paus, följt av direkt stimulering med 25 μL kaliumkloridlösning i myotube-facket för att bedöma direkt myotubeaktivitet oberoende av motorisk neurondepolarisering.
  5. För kvantifieringar, cirkla varje myotube manuellt med inspelningsprogramvaran och analysera Fluo-4 fluorescerande intensitet under 1-min tidsperioden. För att bestämma ökningen av kalciumtillströmningen, subtrahera det genomsnittliga baslinjevärdet (dvs. genomsnittet från de första 10 s före kaliumkloridstimulering) från toppvärdet efter stimulering med kaliumklorid. De representativa resultaten förvärvades med hjälp av programvarans tidsmätningsverktyg.

Representative Results

Generering av NMJs i mikrofluidiska enheter
För att generera en mänsklig motorenhet med funktionella NMJs i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter användes mänskliga iPSC-härledda motoriska nervceller och mänskliga MAB-härledda myotuber. Kvaliteten på startcellmaterialet är viktig, och särskilt fusionsförmågan hos MABs till myotuber är avgörande för ett framgångsrikt resultat av detta protokoll. MABs är lätta att hålla i kulturen. Det är dock viktigt att bedöma varje partis fusionsförmåga innan de appliceras på mikrofluidiska produkter (kompletterande figur 1A,B)18. Några partier, som inte visar myotubebildning efter 10 dagars differentiering, bör inte användas. Fusionsindexet i kompletterande figur 1B fastställdes genom att beräkna procentandelen kärnor inom myotuber positivt för varje myotubemarkör av det totala antalet kärnor per bild. Vi fann att ett fusionsindex på cirka 8% var tillräckligt för vår samkultur i att generera NMJs.

Det är alltid viktigt att påbörja en motorisk neuron differentiering från en ren kultur av iPSCs. Ju renare inmatningen - desto renare resultat. Det motoriska neuron differentieringsprotokollet genererar motoriska neuronkulturer, som vanligtvis är 85%-95% positiva för motoriska neuronmarkörer (Kompletterande figur 1C, D)18. De återstående cellerna kommer vanligtvis att vara odifferentierade prekursorceller, som i vissa fall kommer att genomgå omfattande spridning och därmed ha en negativ inverkan på kulturens kvalitet. För att få det bästa resultatet av detta protokoll bör motor neuron differentiering effektivitet utvärderas innan du tillämpar dag 10 motor neuron-NPCs i enheten. Dessutom kan en NPC-kvalitetskontroll utföras på dag 11 för att utvärdera uttrycket av NPC-markör Olig2 (kompletterande figur 1E,F).

Ursprungligen var motor neuron-NPCs och MABs pläterade vid samma tidpunkt på dag 10. Här inleddes MAB-differentieringen dag 11. Volym- och tillväxtfaktorgradienten som implementerades dag 14 gjorde det möjligt för oss att utvärdera NMJ-formationen på dag 21 och därmed förkorta protokollet med en vecka. Intressant nog kunde vi observera karakteristisk NMJ-bildning av ICC (Kompletterande figur 2A). Vi kunde dock inte förvärva en funktionell utgång via live-cell kalcium inspelningar så här tidigt i motor neuron differentiering (data visas inte). Vi drog slutsatsen att motor nervcellerna ännu inte var mogna nog att bilda funktionella NMJ anslutningar med myotubes, även om NMJ morfologi såg lovande. Detta är i linje med våra tidigare observationer att spontana åtgärder potentialer i motor nervceller, registreras genom patch-clamp elektrofysiologisk analys, endast inträffar på dag 35 av motor neuron differentiering15.

Dessutom försökte vi förlänga motor neuron mognad, liksom co-culture hållbarhet, genom att mogna motor nervcellerna i enheten i 2 veckor (dag 24), innan plätering MABs. Tyvärr observerades en stor mängd spontan motor neuron-neurit korsar genom mikrogrooves, vilket resulterade i hämning av MAB fastsättning (kompletterande figur 2B). På grund av bristen på myotube-formation i kanalen misslyckades vi med att identifiera NMJs på dag 36 och tillämpade därför 28-dagarsprotokollet (figur 1).

Identifiering, kvantifiering och morfologisk karakterisering av in vitro-NMJs
Efter att ha följt 28-dagarsprotokollet (figur 1) kunde fullt fungerande NMJs erhållas. Både in vivo och in vitro, NMJs karakteriseras immunohisto- eller immunocytochemically genom samlokalisering av en presynaptisk markör och en postsynaptisk markör. I denna studie användes en kombination av neurofilament tung kedja (NEFH) och SYP som en presynaptisk markör kombination, vilket tillät följande av en enda neurit från soma av motor neuron mot den mest distala processen. På muskelsidan används Btx ofta som en postsynaptisk markör för AChRs, och användes också i denna studie. Tillskott av agrin och laminin främjar klustring av AChRs vid sarcolemma19,20,21, vilket gör det lättare att identifiera AChRs in vitro och ökar också antalet AChRs och NMJs närvarande18.

För att lokalisera och beräkna NMJs på ett opartiskt sätt identifieras varje myotube genom myosin tung kedja (MyHC)-positivitet och avbildas i z-staplar vid 40x förstoring med hjälp av ett inverterat konfokalt mikroskop. Under mycket lång tid förvärvades myotubes, flera z-staplar. För bildanalys räknas antalet samlokaliseringar mellan NEFH/SYP och Btx manuellt genom varje z-stack, och antalet samlokaliseringar normaliseras till antalet myotuber som finns i z-stacken (figur 2A-C)18. Inte alla myotubes kommer att ha NMJs, som ses i kvantifieringen av innervated myotubes (figur 2D). Följaktligen är det viktigt att utföra en opartisk inspelningsmetod, där alla myotubes är avbildade, oberoende av Btx närvaro.

Det är möjligt att identifiera två typer av morfologier i detta in vitro-system . NMJs visas antingen som en enda kontaktpunkt NMJs, där en neurit berör ett kluster av AChRs vid en interaktionspunkt, eller flera kontaktpunkt NMJs, där en neurit kommer att fläkta ut och engagera sig med AChR-klustret över en större yta. Dessa två morfologier kan identifieras både immunocytokemiskt (figur 2A)18 och med SEM (figur 2B)18, och kan också kvantifieras (figur 2C)18. Sammantaget underlättar de flera kontaktpunkterna en bredare anslutning genom en stor muskelinbäddning, som pekar mot en mer mogen NMJ-formation. Däremot anses den enda kontaktpunkten NMJs vara mindre mogen på grund av kulturens tidiga utvecklingsstadium.

Funktionell utvärdering av in vitro NMJs
För att utvärdera nmjs funktionalitet användes övergående inspelningar av live-cell kalcium (figur 3)18. Genom att dra nytta av det fluidt isolerade systemet av mikrofluidiska enheter stimulerades motorneuron soma sidan med en hög koncentration (50 mM) kaliumklorid samtidigt som en tillströmning av kalcium i myotuberna, som laddades med kalciumkänsliga Fluo-4 färgämnet (figur 3A). Nästan omedelbart vid aktivering av motorisk neuron kunde vi observera en kalciumtillströmning i myotuberna genom en karakteristisk vågbildning, som bekräftar en funktionell anslutning genom motorisk neuron-neurit och myotube (figur 3A-C)18. Inga spontana kalcium vågor eller spontana myotube sammandragningar observerades, även om myotube sammandragning vid direkt stimulering med kaliumklorid observerades. Anslutningens specificitet bekräftades ytterligare genom att lägga till den konkurrenskraftiga AChR-antagonisten, tubocurarine hydroklorid pentahydrat (DTC) till myotube-facket (figur 3A), vilket resulterade i en hämning av kalciumtillströmning (figur 3C). Denna effekt bekräftade att anslutningen mellan motor nervceller och myotubes resulterade i fullt fungerande NMJs. För att utvärdera antalet aktiva myotuber genom NMJ-stimulering stimulerades myotubefacket direkt med kaliumklorid för att identifiera det totala antalet aktiva myotuber i detta fack. Cirka 70% av myotubes var aktiva genom motor neuron-stimulerad aktivering med kaliumklorid (figur 3D)18.

Dessa resultat bekräftar den optimala NMJ-bildandet, antalet, morfologin och funktionaliteten genom samodling av iPSC-härledda motoriska nervceller och MAB-härledda myotubes under ett 28-dagars protokoll.

Figure 2
Figur 2: NMJ-bildning i mikrofluidiska enheter. (A) Konfokala mikrografer av NMJ-bildning i förmonterade mikrofluidiska enheter dag 28. NMJs identifieras genom co-localization (arrowheads) av presynaptic markörer (NEFH och SYP) och postsynaptic AChR markör (Btx) på MyHC-färgade myotubes. NMJs identifieras morfologiskt genom en eller flera kontaktpunktsbildning mellan neuriter och AChR-kluster. DAPI etikettkärnor. Skalstång, 25 μm. Infälld visar en förstoring av en NMJ. Infälld skalstång, 10 μm. (B) SEM NMJ morfologi i mikrofluidiska silikonanordningar dag 28. Pilspetsar avbildar neuritinbäddning i myotuben. Skalstång, 2 μm. Infälld visar en förstoring av NMJ. Infälld skalstång, 1 μm. (C) Kvantifiering av det totala antalet NMJs per myotube samt antalet enstaka och flera kontaktpunkt nmjs per myotube. Grafen visas som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från fyra biologiska replikat. Statistisk signifikans bestäms med Mann-Whitney-test med * p < 0,05. D) Kvantifiering av andelen innervattna myotuber. Grafen visas som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från fyra biologiska replikat. Denna siffra har ändrats från Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Bekräftelse av NMJ-funktionalitet. (A) Schematisk illustration av övergående kalciumregistreringar av NMJ-funktioner i förmonterade mikrofluidiska enheter dag 28 före och efter NMJ-blockering med tubocurarin (DTC)22. Motoriska nervceller i det ljusgröna facket stimuleras med 50 mM kaliumklorid (KCl), vilket orsakar en intracellulär motorisk neuronrespons genom neuriterna. Detta framkallar en tillströmning av kalcium (Ca2+) i myotuber, som är märkta med kalciumkänsligt Fluo-4-färgämne (mörkgrönt fack). (B) Fluo-4 fluorescensmikrografer av prestimulering, intensitet topp och post-stimulering av en myotube som visar en våg av intracellulär kalcium ökning på motor neuron stimulering med KCl. Inset visar en förstoring av en innervated aktiv myotube. Skalstänger, 100 μm. Infälld skalstång, 200 μm. (C) Representativa kalciumtillströmningskurvor i myotuber efter motorisk neuronstimulering med KCl (pil) som bekräftar NMJ-funktionalitet. Myotube 1-3 visar karakteristiska kalcium kurvor genom motor neuron-myotube innervation, medan myotube A-C DTC visar kurvor efter NMJ blockering med DTC. (D) Förhållandet mellan motoriska neuronstimulerade aktiva myotuber på det totala antalet aktiva myotuber. Denna siffra har ändrats från Stoklund Dittlau, K. et al.18. Cellillustrationer har ändrats från Smart Server medical Art22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Verifiering av motorisk neuron, MAB fusion index och NPC kvalitetskontroll. (A) Konfokala bilder av MAB-härledda myotuber 10 dagar efter inledandet av differentiering. Myotubes är märkta med myotube markörer: desmin, MyHC, myogenin (MyoG) och titin. Kärnor är färgade med DAPI. Skalstång, 100 μm. (B) Kvantifiering av MAB fusionsindex 10 dagar efter inledandet av differentiering. Vid svält smälter MABs samman till flernukleära myotuber, som kvantifierades för myotubemarkörpositivitet (AB+). Grafen visar medelvärdet ± standardfel för medelvärdet från tre biologiska replikat. (C) Konfokala bilder av iPSC-härledda motoriska nervceller dag 28 av differentiering, som är märkta med motoriska neuronmarkörer NEFH, kolinacetyltransferas (ChAT) och Islet-1 utöver pan-neuronal markör βIII-tubulin (Tubulin). Kärnor är färgade med DAPI. Skalstänger, 75 μm. (D) Kvantifiering av antalet celler, som är positiva för motoriska neuron- och panneuronmarkörer (AB+). Grafen visar medelvärdet ± standardfel för medelvärdet från tre biologiska replikat. (E) Konfokala bilder av iPSC-härledda npc-produkter dag 11 av motorisk neurondifferentiering, som är märkta med NPC-markör Olig2 och pan-neuronal markör βIII-tubulin (Tubulin). Kärnor är färgade med DAPI. Skalstänger, 50 μm. (F) Kvantifiering av antalet NPC: er, som är positiva för Olig2 och βIII-tubulin (AB+). Grafen visar medelvärdet ± standardfel för medelvärdet från tre biologiska replikat. Denna siffra har ändrats från Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Optimering av samkulturprotokoll (A) Konfokala bilder av NMJ-bildning dag 21 av motorisk neurondifferentiering, när MABs sås vid samma tidpunkt som NPC på dag 10. NMJs identifieras genom co-localization (arrowheads) av presynaptic markörer (NEFH och SYP) och postsynaptic AChR markör (Btx) på MyHC-färgade myotubes. Skalstång (vänster), 10 μm. Skalstång (höger), 5 μm. (B) Ljusfältsbild av myotubekanalen på dag 24 som visar spontan motorisk neuron-neuritkorsning som hämmar fastsättningen av MABs. Skalningsfält, 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Reagens Lagerkoncentration Slutlig koncentration
IMDM 1x 80%
Fetala nötkreatur serum 15%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/ml 0.5%
L-glutamin 50x 1%
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Icke-essentiella aminosyror 100x 1%
Insulin transferrin selen 100x 1%
bFGF (tillagd färsk) 50 μg/ml 5 ng/mL

Tabell 1: Tillväxtmedium för MAB. Medium kan pågå i 2 veckor vid 4 °C. bFGF tillsätts färskt på användningsdagen.

Reagens Lagerkoncentration Slutlig koncentration
DMEM/F12 50%
Neurobasal medium 50%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/ml 1%
L-glutamin 50x 0.5 %
N-2 tillägg 100x 1%
B-27 utan vitamin A 50x 2%
β-mercaptoethanol 50 mM 0.1%
Askorbinsyra 200 μM 0,5 μM

Tabell 2: Motorisk neuron basal medium. Medium kan vara 4 veckor vid 4 °C.

Dag Reagens Lagerkoncentration Slutlig koncentration Fack
Dag 10/11 Utjämnad agonist 10 mM 500 nM Båda
Retinsyra 1 mM 0.1 μM
DAPT 100 mM 10 μM
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
Dag 14 DAPT 100 mM 20 μM Båda
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
Dag 16 DAPT 100 mM 20 μM Båda
BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
CNTF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
Dag 18 BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL Motorisk neuron
GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
CNTF 0,1 mg/ml 10 ng/mL
Dag 21+ BDNF 0,1 mg/ml 30 ng/mL Myotube
GDNF 0,1 mg/ml 30 ng/mL
CNTF 0,1 mg/ml 30 ng/mL
Agrin 50 μg/ml 0,01 μg/ml
Laminin 1 mg/ml 20 μg/ml
Dag 21+ Inga kosttillskott Motorisk neuron

Tabell 3: Motor neuron medium kosttillskott. Kosttillskott läggs till färska på användningsdagen till motor neuron basalmediet.

Dag Reagens Lagerkoncentration Slutlig koncentration Fack
Dag 18 DMEM/F12 97% MAB
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Hästserum 2%
Agrin 50 μg/ml 0,01 μg/ml

Tabell 4: MAB differentieringsmedium. Medium kan vara 2 veckor vid 4 °C. Agrin tillsätts färskt på användningsdagen.

Discussion

Protokollet beskriver en relativt lättanvänd metod, som genererar mänskliga motorenheter med funktionella NMJs i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter på mindre än 30 dagar. Det beskrivs hur NMJs kan bedömas morfologiskt genom standardtekniker som ICC och SEM och funktionellt genom levande cell kalcium inspelningar.

En stor fördel med detta protokoll är användningen av stamcellsteknik. Detta möjliggör full anpassningsförmåga där NMJs kan utvärderas i både hälsa och sjukdom, oberoende av givarprofilen. Modellen har visat sig redan framgångsrik och fördelaktig i ALS forskning, där vi identifierade nedskrivningar i neurit utväxt, återväxt och NMJ nummer som nya fenotyper på grund av mutationer i FUS gen18. Med denna modell är det möjligt att utöka forskningen till att omfatta sporadiska former av ALS, där etiologin är okänd, genom att använda iPSCs från sporadiska ALS-patienter. Detta ger en fördel jämfört med traditionella djurmodeller, som förlitar sig på transgent överuttryck av muterade gener för att rekapitulera mänsklig sjukdom23,24. Dessutom möjliggör vårt helt mänskliga system potentiell rekapitulering av människospecifik fysiologi och sjukdom. Tidigare studier visade skillnaderna mellan gnagare och human NMJ morfologi25, vilket tyder på att försiktighet måste genomföras när man använder gnagare för att ta itu med mänsklig NMJ patologi. Även om detta system är en relativ enkel in vitro-installation, som saknar komplexiteten hos en in vivo-modell, var det möjligt att visa att NMJ-morfologin som visas i de mikrofluidiska enheterna liknade NMJs av mänskliga amputater25. Dessutom tillåter denna modell NMJ-utvärdering under NMJ-bildande och mognad, vilket potentiellt avslöjar tidiga sjukdom fenotyper, som är frånvarande, oidentifierbara eller förbises i mänskliga obduktion prover.

MABs ger ett giltigt alternativ för att generera myotubes, även om deras begränsade överlevnad på 10 dagar är en nackdel med systemet. Myotube överlevnad förlitar sig på deras fastsättning till ytan, som sannolikt äventyras av spontana sammandragningar av myofibers. Efter mer än 10 dagar kommer de flesta myotubes att ha lossnat, vilket gör NMJ-kulturen oanvändbar. Helst skulle myotubes också genereras från iPSCs. Nuvarande protokoll har dock visat sig vara svåra att reproducera26 på grund av variationer i fusionsindex27,28,29,30.

Genom att använda kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter genererade vi ett standardiserat system som är fullt tillgängligt. Andra NMJ-modeller finns31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. De förlitar sig dock vanligtvis på enskilda fack, som saknar compartmentalization och fluidic isolering mellan celltyper, eller på skräddarsydda odlingskärl, vilket sänker tillgängligheten och potentiellt också reproducerbarheten. De mikrofluidiska anordningar som används för detta protokoll kan köpas med mikrogrooves av olika längder, vilket möjliggör ytterligare analys såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersökningar. Den fluidic isolering mellan fack möjliggör ytterligare compartmentalized läkemedelsbehandling av antingen motor neuroner eller myotubes, vilket kan vara gynnsamt i terapi utveckling. Fler företag som specialiserat sig på mikrofluidik har dykt upp, vilket har öppnat upp för ett stort urval av enhetsdesign och funktioner, vilket ytterligare främjar tillgängligheten för in vitro-forskning.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett protokoll som ger en pålitlig, mångsidig och enkel metod för att odla mänskliga motorenheter med funktionella NMJs.

Disclosures

L.V..B D. har ett patent på användning av HDAC-hämmare i Charcot-Marie-Tooth disease (US-2013227717-A1), är en vetenskaplig medgrundare av Augustine Therapeutics, och medlem av dess vetenskapliga rådgivande styrelse. De andra författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Nikky Corthout och Sebastian Munck från LiMoNe, Forskargruppen Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) för deras råd om levande cell kalcium transient fluorescens inspelningar. Denna forskning stöddes av Fulbrightkommissionen i Belgien och Luxemburg, KU Leuven (C1 och "Opening the Future"-fonden), VIB, Byrån för innovation inom vetenskap och teknik (IWT; SBO-iPSCAF), "Fonden för vetenskaplig forskning Flandern" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiska regeringen (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initierat av belgiens federala vetenskapspolitiska kontor), Thierry Latran Foundation och "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. och J.B. stöds av doktorandstipendier som delas ut av FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 Thermo Fisher Scientific B35451 Antibody (1:1000)
Acetic Acid CHEM-Lab NV CL00.0116.1000 Coating component. H226, H314. P280
Aclar 33C sheet (SEM sheet) Electron Microscopy Sciences 50425-25 Thickness: 7.8 mil
Agrin (recombinant human protein) R&D systems 6624-AG-050 Media supplement
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit Thermo Fisher Scientific A21206 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat Thermo Fisher Scientific A21432 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31570 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31571 Antibody (1:1000)
Ascorbic acid Sigma A4403 Media component
βIII-tubulin (Tubulin) Abcam ab7751 Antibody (1:500)
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 Media component. H317. P280.
B-27 without vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010 Media component
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-02B Growth factor
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) Peprotech 100-18B Growth factor
Choline acetyltransferase (ChAT) Millipore ab144P Antibody (1:500)
Collagen from calfskin Thermo Fisher Scientific 17104019 Coating component
CNTF (ciliary neurotrophic factor) Peprotech 450-13B Growth factor
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent Thermo Fisher Scientific R37605 Immunocytochemistry component
DAPT Tocris Bioscience 2634 Media supplement
Desmin Abcam Ab15200 Antibody (1:200)
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330032 Media component
DMSO Sigma D2650-100ML Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 no calcium, no magnesium
Ethanol VWR 20.821.296 Sterilization. H225. P280
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270106 Media component
Fluo-4 AM live cell dye Thermo Fisher Scientific F14201 Calcium imaging dye
Fluorescence Mounting Medium Dako S3023 Immunocytochemistry component
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-10B Growth factor
Glutaraldehyde Agar Scientific R1020 Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050122 Media component
Human alkaline phosphatase R&D systems MAB1448 Antibody
ImageJ software NIH ICC analysis
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440053 Media component
Insulin transferrin selenium Thermo Fisher Scientific 41400045 Media component
Islet-1 Millipore ab4326 Antibody (1:400)
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Cryopreservation component
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020-1MG Coating component and media supplement
Leica SP8 DMI8 confocal microscope Leica ICC confocal microscopy
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024 Media component
Myogenin (MyoG) Abcam Ab124800 Antibody (1:500)
Myosin heavy chain (MyHC) In-house, SCIL Antibody (1:20)
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048 Media component
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Coating and media component
Neurofilament heavy chain (NEFH) Abcam AB8135 Antibody (1:1000)
Nikon A1R confocal microscope Nikon Live-cell calcium imaging microscopy
NIS-Elements AR 4.30.02 software Nikon Live-cell calcium imaging analysis
Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140050 Media component
Normal donkey serum Sigma D9663-10ML Immunocytochemistry component
Olig2 IBL 18953 Antibody (1:1000)
Parafilm M Sigma P7793-1EA Storing equipment
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15070063 Media component
Petri dish (3 cm) nunc 153066 Diameter: 3 cm
Petri dish (10 cm) Sarstedt 833.902 Diameter: 10 cm
Plate (6-well) Cellstar Greiner bio-one 657160 Culture plate
Pluronic F-127 Thermo Fisher Scientific P3000MP Fluo-4 dye solvent
Poly-L-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Coating component
Potassium chloride CHEM-Lab NV CL00.1133.1000 Calcium imaging reagent
Retinoic acid Sigma R2625 Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell supplement Thermo Fisher Scientific A2644501 ROCK inhibitor solution
Smoothened agonist Merch Millipore 566660 Media supplement
Sodium cacodylate buffer Sigma C0250 Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Media component
Synaptophysin (SYP) Cell Signaling 5461S Antibody (1:1000)
T75 flask Sigma CLS3276 Culture plate
Titin Developmental Studies Hybridoma Bank 9D10 Antibody (1:300)
Triton X-100 Sigma T8787-250ML Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE express Thermo Fisher Scientific 12605010 MAB dissociation solution
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379-100G Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.
XonaChips pre-assembled microfluidic device Xona Microfluidics XC150 Microgroove length: 150 μm
Xona Silicone microfluidics device Xona Microfluidics SND75 Microgroove length: 75 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plomp, J. J. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).
  2. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
  3. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
  4. Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
  5. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  6. Martineau, É, Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973 (2018).
  7. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  8. Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
  9. So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
  10. Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
  11. Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
  12. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  15. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861 (2017).
  16. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
  17. Giacomazzi, G., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).
  18. Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
  19. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530 (2019).
  20. Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
  21. Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
  22. Smart Servier Medical Art. , Available from: https://smart.servier.com/ (2021).
  23. Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
  24. Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
  25. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  26. Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681 (2018).
  27. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  28. vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
  29. Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
  30. Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649 (2021).
  31. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  32. Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
  33. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
  34. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  35. Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299 (2019).
  36. Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473 (2015).
  37. Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049 (2012).
  38. Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537 (2019).
  39. Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
  40. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  41. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  42. Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
  43. Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335 (2018).
  44. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993 (2020).
  45. Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
  46. Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).

Tags

Neurovetenskap nummer 175
Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E.… More

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E. N., Fumagalli, L., Vandoorne, T., Baatsen, P., Kerstens, A., Giacomazzi, G., Pavie, B., Rossaert, E., Beckers, J., Sampaolesi, M., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (175), e62959, doi:10.3791/62959 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter