Vi beskriver en metode til at generere menneskelige motorenheder i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder ved at co-culturing human induceret pluripotente stamcelle-afledte motor neuroner med menneskelige primære mesoangioblast-afledte myotubes resulterer i dannelsen af funktionelt aktive neuromuskulære knudepunkter.
Neuromuskulære vejkryds (NMJs) er specialiserede synapser mellem axon af den lavere motoriske neuron og musklen lette engagement muskelsammentrækning. I motoriske neuron lidelser, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerere, hvilket resulterer i muskelatrofi og progressiv lammelse. Den underliggende mekanisme for NMJ degeneration er ukendt, hovedsagelig på grund af manglen på omsættelige forskningsmodeller. Denne undersøgelse havde til formål at skabe en alsidig og reproducerbar in vitro model af en menneskelig motor enhed med funktionelle NMJs. Derfor blev menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte motornanoner og menneskelige primære mesoangioblast (MAB)-afledte myotubes co-dyrket i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af flydende isolerede mikrorum giver mulighed for vedligeholdelse af cellespecifikke mikromiljø, samtidig med at celle-til-celle kontakt tillades gennem mikrogroove. Ved at anvende en chemotactic og volumetrisk gradient, væksten af motoriske neuron-neurites gennem mikrogroove fremme myotube interaktion og dannelsen af NMJs blev stimuleret. Disse NMJs blev identificeret immunocytokemisk gennem co-lokalisering af motor neuron præsynaptisk markør synaptophysin (SYP) og postsynaptisk acetylcholin receptor (AChR) markør α-bungarotoxin (Btx) på myotubes og karakteriseret morfologisk ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionaliteten af NMJs blev bekræftet ved at måle calcium svar i myotubes ved depolarisering af motoriske neuroner. Den motoriske enhed, der genereres ved hjælp af standard mikrofluidiske enheder og stamcelleteknologi, kan støtte fremtidig forskning med fokus på NMJs inden for sundhed og sygdom.
NMJs lette kommunikationen mellem lavere spinal motor neuroner og skeletmuskulaturfibre gennem frigivelse af neurotransmittere1. I motoriske neuron lidelser som ALS og SMA, NMJs degenerere, hvilket forårsager en forstyrrelse i kommunikationen med musklerne2,3,4,5,6,7. Dette resulterer i, at patienter gradvist mister deres muskelfunktion, hvilket får dem til at være kørestolsbundne og i sidste ende afhængige af respiratorisk livsunderstøttelse på grund af progressiv atrofi af vitale muskelgrupper som mellemgulvet. De nøjagtige underliggende mekanismer, der er ansvarlige for dette dybe tab af NMJs i disse lidelser, er ukendte. Mange undersøgelser er blevet udført på transgene dyremodeller, hvilket har givet os en vis indsigt i patogenesen af NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men for fuldt ud at forstå patologien og modvirke denervation er det vigtigt at have et menneskeligt system, som giver fuld tilgængelighed.
Her beskriver protokollen en relativt enkel måde at generere menneskelige NMJs gennem co-dyrkning af hiPSC-afledte motor neuroner og menneskelige primære MAB-afledte myotubes ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af mikrofluidics til at polarisere og flydende isolere somaer og axoner af neuroner har været kendt siden den første beskrivelse af ‘Campenot’ kamre12 i slutningen af 1970’erne. Siden da er flere mikrofluidiske designs blevet fremstillet, herunder kommercielle muligheder. De enheder, der anvendes i denne protokol indeholder to rum, og hvert rum består af to brønde forbundet med en kanal13. De to rum er spejlet og forbundet med flere mikrogroove. Disse mikrogroove har en størrelse, der letter neuritvæksten, samtidig med at den flydende isolation mellem de to rum opretholdes gennem et kapillært hydrostatisk tryk13,14. Ved hjælp af dette system er det muligt at dyrke motoriske neuroner i et rum og muskelceller i det andet, hver i deres specifikke kulturmedium, mens det stadig letter en fysisk forbindelse gennem neuritter, der passerer gennem mikrogrooves og engagerer sig med muskelcellerne. Denne model giver et fuldt tilgængeligt og fleksibelt in vitro-system af en menneskelig motorisk enhed, som kan bruges til at studere tidlig NMJ patologi i sygdomme som ALS og SMA.
Protokollen beskriver en relativt brugervenlig metode, som genererer menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder på mindre end 30 dage. Det beskrives, hvordan NMJs kan vurderes morfologisk gennem standard teknikker såsom ICC og SEM og funktionelt gennem live-celle calcium optagelser.
En stor fordel ved denne protokol er brugen af stamcelleteknologi. Dette giver mulighed for fuld tilpasningsevne, hvor NMJs kan evalueres i både sundhed og sygdom, uafhængigt af donorprofilen. Modellen har vist sig allerede vellykket og gavnlig i ALS forskning, hvor vi identificerede værdiforringelser i neurit udvækst, genvækst, og NMJ numre som nye fænotyper på grund af mutationer i FUS genet18. Med denne model er det muligt at udvide forskningen til at omfatte sporadiske former for ALS, hvor ætiologien er ukendt, ved hjælp af iPSCs fra sporadiske ALS-patienter. Dette giver en fordel i forhold til traditionelle dyremodeller, som er afhængige af transgen overekspression af muterede gener for at generobre menneskers sygdom23,24. Derudover giver vores fuldt menneskelige system mulighed for potentiel rekapitulation af menneskespecifik fysiologi og sygdom. Tidligere undersøgelser viste forskellene mellem gnaver og human NMJ morfologi25, hvilket tyder på, at forsigtighed skal gennemføres, når man bruger gnavere til at løse menneskelige NMJ patologi. Selv om dette system er en relativ simpel in vitro setup, som mangler kompleksiteten af en in vivo model, var det muligt at påvise, at NMJ morfologi vises i mikrofluidiske enheder lignede NMJs af menneskelige amputater25. Desuden giver denne model mulighed for NMJ evaluering under NMJ dannelse og modning, potentielt afslørende tidlige sygdom fænotyper, som er fraværende, uidentificerbare, eller overset i menneskelige post mortem prøver.
MABs giver en gyldig mulighed for at generere myotubes, selv om deres begrænsede overlevelse på 10 dage er en ulempe for systemet. Myotube overlevelse afhænger af deres tilknytning til overfladen, som sandsynligvis er kompromitteret af spontane sammentrækninger af myofibers. Efter mere end 10 dage, vil de fleste myotubes have løsrevet, hvilket gør NMJ kultur ubrugelig. Ideelt set ville myotubes også blive genereret fra iPSCs. De nuværende protokoller har imidlertid vist sig vanskelige at reproducere26 på grund af variation i fusionsindekset27,28,29,30.
Ved at bruge kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder genererede vi et standardiseret system, som er fuldt tilgængeligt. Andre NMJ-modeller findes31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Men de er typisk afhængige af enkelte rum, som mangler opdeling og flydende isolation mellem celletyper eller på skræddersyede kulturfartøjer, hvilket sænker tilgængeligheden og potentielt også reproducerbarheden. De mikrofluidiske enheder, der anvendes til denne protokol, kan købes med mikrogroove af forskellig længde, hvilket giver mulighed for yderligere analyse såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersøgelser. Den fluidiske isolation mellem rum muliggør yderligere opdelt lægemiddelbehandling af enten motoriske neuroner eller myotubes, som kan være gunstig i terapiudvikling. Flere virksomheder med speciale i mikrofluidics er opstået, som har åbnet op for et stort udvalg af enhed design og funktioner, yderligere fremme tilgængeligheden for in vitro forskning.
Afslutningsvis har vi udviklet en protokol, der giver en pålidelig, alsidig og nem metode til at dyrke menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Nikky Corthout og Sebastian Munck fra LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) for deres råd om levende celle calcium forbigående fluorescens optagelser. Denne forskning blev støttet af Fulbright-kommissionen til Belgien og Luxembourg, KU Leuven (C1 og “Opening the Future”-fonden), VIB, Agenturet for Innovation af Videnskab og Teknologi (IWT; SBO-iPSCAF), “Fonden for Videnskabelig Forskning Flandern” (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiske regering (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 iværksat af den belgiske Federal Science Policy Office), Thierry Latran Foundation og “Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires” (ABMM). T.V. og J.B. støttes af ph.d.-stipendier tildelt af FWO-Vlaanderen.
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |