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Neuroscience

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के साथ मानव मोटर इकाइयों का उत्पादन

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62959
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 5, 3,4, 1,2, 1,2, 5, 1,2,6, 1,2
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Center for Brain & Disease Research, Laboratory of Neurobiology, , 3VIB Center for Brain & Disease Research, Research Group Molecular Neurobiology, , 4VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 5Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 6Department of Neurology, University Hospitals Leuven

Summary

हम मानव प्राथमिक मेसोएंजियोब्लास्ट-व्युत्पन्न मायोट्यूब के साथ मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स को सह-संवर्धित करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मानव मोटर इकाइयों को उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक रूप से सक्रिय न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का गठन होता है।

Abstract

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (NMJs) कम मोटर न्यूरॉन के अक्षतंतु और मांसपेशियों के संकुचन की सगाई की सुविधा प्रदान करने वाली मांसपेशियों के बीच विशेष synapses हैं। मोटर न्यूरॉन विकारों में, जैसे कि एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) और स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए), एनएमजे पतित हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों में शोष और प्रगतिशील पक्षाघात होता है। एनएमजे अध: पतन का अंतर्निहित तंत्र अज्ञात है, मोटे तौर पर अनुवाद योग्य अनुसंधान मॉडल की कमी के कारण। इस अध्ययन का उद्देश्य कार्यात्मक NMJs के साथ एक मानव मोटर इकाई के विट्रो मॉडल में एक बहुमुखी और पुनरुत्पादक बनाना था। इसलिए, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSC) - व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और मानव प्राथमिक मेसोएंजियोब्लास्ट (एमएबी) - व्युत्पन्न मायोट्यूब को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सह-सुसंस्कृत किया गया था। तरल रूप से अलग-थलग माइक्रो-डिब्बों का उपयोग सेल-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, जबकि माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से सेल-टू-सेल संपर्क की अनुमति देता है। एक कीमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट को लागू करके, मायोट्यूब इंटरैक्शन को बढ़ावा देने वाले माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट्स के विकास और एनएमजे के गठन को उत्तेजित किया गया था। इन NMJs को मोटर न्यूरॉन presynaptic मार्कर synaptophysin (SYP) और पोस्टसिनेप्टिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (ACHR) मार्कर α-bungarotoxin (Btx) के सह-स्थानीयकरण के माध्यम से immunocytochemically की पहचान की गई थी मायोट्यूब पर और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करके रूपात्मक रूप से विशेषता थी। NMJs की कार्यक्षमता मोटर न्यूरॉन्स के विध्रुवीकरण पर मायोट्यूब में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने के द्वारा पुष्टि की गई थी। मानक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों और स्टेम सेल प्रौद्योगिकी का उपयोग करके उत्पन्न मोटर इकाई स्वास्थ्य और बीमारी में एनएमजे पर ध्यान केंद्रित करने वाले भविष्य के शोध में सहायता कर सकती है।

Introduction

NMJs न्यूरोट्रांसमीटर 1 की रिहाई के माध्यम से कम रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल की मांसपेशी तंतुओं के बीच संचार की सुविधा प्रदान करते हैं। एएलएस और एसएमए जैसे मोटर न्यूरॉन विकारों में, एनएमजे पतित हो जाते हैं, जो मांसपेशियों के साथ संचार में व्यवधान पैदा करता है2,3,4,5,6,7। इसके परिणामस्वरूप रोगियों ने धीरे-धीरे अपनी मांसपेशियों के कार्य को खो दिया, जिससे उन्हें व्हीलचेयर-बाध्य होना पड़ता है और अंततः डायाफ्राम जैसे महत्वपूर्ण मांसपेशी समूहों के प्रगतिशील शोष के कारण श्वसन जीवन-समर्थन पर निर्भर होता है। इन विकारों में एनएमजे के इस गहन नुकसान के लिए जिम्मेदार सटीक अंतर्निहित तंत्र अज्ञात हैं। ट्रांसजेनिक पशु मॉडल पर कई अध्ययन किए गए हैं, जिसने हमें एनएमजे अध: पतन 5,6,8,9,10,11 के रोगजनन में कुछ अंतर्दृष्टि दी है। हालांकि, पैथोलॉजी को पूरी तरह से समझने और denervation का मुकाबला करने के लिए, एक मानव प्रणाली होना महत्वपूर्ण है, जो पूर्ण पहुंच की अनुमति देता है।

यहां, प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके hiPSC-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और मानव प्राथमिक MAB-व्युत्पन्न मायोट्यूब के सह-संवर्धन के माध्यम से मानव NMJs उत्पन्न करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीके का वर्णन करता है। न्यूरॉन्स के सोमा और अक्षतंतुओं को ध्रुवीकृत और तरल रूप से अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग 1970 के दशक के अंत में 'कैम्पेनॉट' कक्षों 12 के पहले विवरण के बाद से जाना जाता है। तब से, वाणिज्यिक विकल्पों सहित अधिक माइक्रोफ्लुइडिक डिजाइन बनाए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों में दो डिब्बे होते हैं, और प्रत्येक डिब्बे में एक चैनल 13 से जुड़े दो कुएं होते हैं। दो डिब्बों को प्रतिबिंबित किया जाता है और कई माइक्रोग्रूव के साथ जोड़ा जाता है। इन माइक्रोग्रूव्स का एक आकार होता है जो एक केशिका हाइड्रोस्टेटिक दबाव 13,14 के माध्यम से दो डिब्बों के बीच तरल अलगाव को बनाए रखते हुए न्यूराइट विकास की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रणाली का उपयोग करके, एक डिब्बे में मोटर न्यूरॉन्स और दूसरे में मांसपेशियों की कोशिकाओं को संस्कृति करना संभव है, प्रत्येक अपने विशिष्ट संस्कृति माध्यम में, जबकि अभी भी माइक्रोग्रूव्स से गुजरने वाले न्यूराइट्स के माध्यम से एक शारीरिक संबंध की सुविधा प्रदान करता है और मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ संलग्न होता है। यह मॉडल मानव मोटर इकाई की एक पूरी तरह से सुलभ और अनुकूलनीय इन विट्रो सिस्टम प्रदान करता है, जिसका उपयोग एएलएस और एसएमए जैसी बीमारियों में प्रारंभिक एनएमजे पैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

सभी विषयों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, जिन्होंने आईपीएससी पीढ़ी और एमएबी कटाई के लिए अपने नमूने प्रदान किए थे। प्रक्रिया को विश्वविद्यालय अस्पताल ल्यूवेन (एन ° S5732-ML11268) की चिकित्सा नैतिकता समिति और STEMBANCC परियोजना के हिस्से के रूप में यूके की मुख्य अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है और इसका उपयोग बाँझ किया जाना चाहिए। मीडिया को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। सह-संस्कृति प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए, कृपया चित्र1 देखें।

1. iPSCs से मोटर न्यूरॉन पूर्वजों का भेदभाव

  1. मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 15 का पालन करें, जो पिछले अध्ययन 16 से अनुकूलित है, जब तक कि दिन 10 तंत्रिका पूर्वज (एनपीसी) राज्य तक नहीं पहुंच जाता है। प्रोटोकॉल की समय सीमा के अनुसार, भेदभाव सोमवार (दिन 0) पर शुरू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप गुरुवार को दिन 10 एनपीसी होते हैं।
  2. क्रायोप्रिजर्व डे 10 एनपीसी नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन में 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ 2 x 106- 4 x 106 कोशिकाओं प्रति शीशी के घनत्व पर।
    सावधानी: डीएमएसओ विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभालें।
    नोट: दिन 10 एनपीसी का लगभग 50% पिघलने पर महत्वपूर्ण होने की उम्मीद है। इस 'दिन 10 एनपीसी' राज्य में मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल को रोकें और बड़ी संख्या में एनपीसी उत्पन्न करने के लिए एनपीसी को क्रायोप्रिजर्व करें, जिसे बाद में बैंक किया जा सकता है और उपयोग किया जा सकता है, सह-संस्कृति प्रोटोकॉल की समग्र समयरेखा की लंबाई को 28 दिनों से 19 दिनों तक कम कर देता है।

2. व्युत्पत्ति और मानव MABs के रखरखाव

नोट: एमएबी पोत से जुड़े मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं हैं, जिन्हें इस मामले में 58 वर्षीय स्वस्थ दाता से प्राप्त बायोप्सी से काटा गया है। वैकल्पिक वाणिज्यिक स्रोत उपलब्ध हैं। MABs प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल संक्षेप में समझाया गया है। अधिक जानकारी के लिए, विस्तृत प्रोटोकॉल 17 देखें। सभी MAB मीडिया को उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए।

  1. बायोप्सी ऊतक कीमा बनाने और कोलेजन पर इनक्यूबेट (बछड़े की खाल से) 2 सप्ताह के लिए एक विकास माध्यम (तालिका 1) में 6 सेमी व्यंजन लेपित। माध्यम को हर 4 दिनों में बदलें।
    1. कोलेजन कोटिंग तैयार करने के लिए, 0.1 एम एसिटिक एसिड के 20 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम कोलेजन को भंग करें। कोलेजन को भंग करने में समय लगता है, इसलिए मिश्रण को आरटी पर रात भर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। अगले दिन, 100 एमएल की अंतिम मात्रा में डीडीएच 2 ओ के 80 एमएल के साथ टॉप अप करें।
      सावधानी: एसिटिक एसिड विषाक्त है; व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक धुएं हुड में संभाल.
      नोट: बछड़े की खाल कोटिंग से कोलेजन 5x तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. कोलेजन के साथ पकवान या फ्लास्क की पूरी सतह को कोट करें, एक लैमिनर प्रवाह के अंदर आरटी पर 20 मिनट के लिए बंद और इनक्यूबेट करें। 20 मिनट के बाद, एक ताजा कंटेनर में कोलेजन को ठीक करें, खाली डिश / फ्लास्क को बंद करें और लैमिनर प्रवाह में आरटी पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
    3. डिश / फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रात भर (या कम से कम 6 घंटे) इनक्यूबेशन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए स्थानांतरित करें। प्लेटिंग कोशिकाओं से पहले कैल्शियम या मैग्नीशियम (DPBS) के बिना Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के साथ 5x धोएं।
  2. 14 दिनों के बाद, FACS (फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग) मानव क्षारीय फॉस्फेट 17 के लिए MABs को सॉर्ट करता है, जिसके बाद आगे का विस्तार होता है। विकास माध्यम में कोलेजन-लेपित T75 फ्लास्क पर MABs बनाए रखें और हर 2 दिनों में विकास माध्यम (10 mL प्रति फ्लास्क) बदलें।
  3. 70% संगम तक पहुंचने पर उपकरणों में क्रायोप्रिजर्व, मार्ग, या बीज एमएबी।
    नोट: MABs सेल-टू-सेल संपर्क पर सहज संलयन के कारण अपनी मायोजेनिक क्षमता खो देते हैं। सुनिश्चित करें कि MABs का विस्तार करते समय 70% संगम से अधिक न हो। एक 70% confluent T75 फ्लास्क में लगभग 600,000-800,000 कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें प्रति शीशी 100,000 कोशिकाओं पर क्रायोप्रिज़र्व किया जा सकता है। प्रत्येक शीशी को बाद में विस्तार के लिए एक T75 फ्लास्क में पिघलाया और बीज दिया जा सकता है।
  4. एमएबी को पारित करने के लिए, धीरे से उन्हें 7 एमएल डीपीबीएस के साथ एक बार धोएं और फिर कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए एमएबी पृथक्करण समाधान के 7 मिलीलीटर में इनक्यूबेट करें।
    1. विकास माध्यम के 7 मिलीलीटर के साथ एमएबी पृथक्करण समाधान को बेअसर करें, धीरे से कोशिकाओं को स्क्रैप करें, और सेल निलंबन को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। संभावित रूप से शेष एमएबी एकत्र करने के लिए विकास माध्यम के अतिरिक्त 5 मिलीलीटर के साथ फ्लास्क को धीरे से धोएं।
    2. 300 x g पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर विस्तार के लिए सीधे एक नए कोलेजन-लेपित T75 फ्लास्क के लिए पारित करें, 10% डीएमएसओ के साथ नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन में क्रायोप्रिजर्व करें या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीज की गिनती करें।
      नोट:: मार्ग 1x-2x प्रति सप्ताह सेल विस्तार के लिए 13 की एक अधिकतम मार्ग संख्या तक किया जाता है। पृथक्करण पर, माइक्रोस्कोप के नीचे जांच किए जाने पर एमएबी गोलाकार और आकार में बड़े दिखाई देते हैं।

3. पूर्व इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तैयारी - दिन 9

नोट:: प्रोटोकॉल microfluidic डिवाइस निर्माता के न्यूरॉन डिवाइस प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और दोनों पूर्व इकट्ठे और सिलिकॉन उपकरणों के उपयोग के लिए समायोजित किया गया है। यहां, पूर्व-इकट्ठे उपकरणों का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) और लाइव-सेल कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के लिए किया जाता है, जबकि सिलिकॉन उपकरणों का उपयोग एसईएम के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल की समयरेखा मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए समयरेखा का पालन करती है।

  1. कोशिकाओं को सीडिंग करने से एक दिन पहले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को तैयार करें, क्योंकि कोटिंग को रात भर इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। मोटर न्यूरॉन प्रोटोकॉल के अनुसार, यह एक बुधवार होगा। एक 10 सेमी पेट्री पकवान के लिए 70% -100% इथेनॉल के ~ 10 मिलीलीटर जोड़ें। नसबंदी के लिए पेट्री डिश में शिपिंग कंटेनर से डिवाइस को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  2. 10 s के लिए इथेनॉल में डिवाइस को डुबोएं और ~ 30 मिनट के लिए लैमिनर प्रवाह में हवा सूखने के लिए कागज के एक टुकड़े में संदंश के साथ डिवाइस को स्थानांतरित करें। दोनों पक्षों को सूखने की अनुमति देने के लिए डिवाइस को कुछ बार फ्लिप करें। जब डिवाइस सूखा होता है, तो प्रत्येक डिवाइस को आसान हैंडलिंग के लिए एक व्यक्तिगत 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें
    सावधानी: इथेनॉल विषाक्त है; व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक धुएं हुड में संभाल
  3. DPBS में Poly-L-ornithine (PLO) (100 μg / mL) के साथ डिवाइस को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 3 घंटे के लिए 5% CO2 ।
    1. एक P200 पिपेट का उपयोग करें एक शीर्ष में DPBS में PLO के 100 μL जोड़ने के लिए के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में चैनल खोलने के करीब और ऊपर से अच्छी तरह से नीचे के लिए चैनल के माध्यम से अच्छी तरह से पारित तरल पदार्थ का निरीक्षण अच्छी तरह से अच्छी तरह से. इसके बाद, नीचे अच्छी तरह से DPBS में PLO के 100 μL जोड़ें।
    2. माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दोहराएं और डिवाइस के एक तरफ 100 μL जोड़कर समाप्त करें ताकि माइक्रोग्रूव्स को कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाया जा सके (उदाहरण के लिए, दाईं ओर 200 μL, बाईं ओर 300 μL)। 3 घंटे के बाद, डिवाइस को DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो लें। यदि आवश्यक हो तो एक सक्शन प्रणाली का उपयोग करें।
      नोट: कोटिंग या कोशिकाओं की खेती के दौरान किसी भी बिंदु पर चैनलों में किसी भी हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए सुनिश्चित करें। यहां तक कि छोटे बुलबुले भी थोड़े समय में विस्तार करेंगे, जिससे चैनल में कोटिंग, सेल सीडिंग, या मीडिया प्रवाह को बाधित किया जा सकेगा। यदि कोटिंग के दौरान चैनल में तरल पदार्थ बंद हो जाता है, तो दोनों पक्षों से सीधे चैनल में पीएलओ समाधान को फिर से निलंबित करें। यदि बुलबुले अभी भी मौजूद हैं, तो चैनल को फ्लश करने के लिए DPBS के 200 μL का उपयोग करें और कोटिंग प्रक्रिया को दोहराएं जैसा कि ऊपर 3.3.1-3.3.2 चरणों में कहा गया है। यदि सेल सीडिंग के बाद बुलबुले दिखाई देते हैं, तो डिवाइस को पुनर्प्राप्त करना असंभव है, क्योंकि चैनल को फ्लश करने से कोशिकाओं को नुकसान होगा।
  4. एक Neurobasal माध्यम में लैमिनिन (20 μg / mL) के साथ डिवाइस कोट और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट। चरण 3.3.1-3.3.2 से PLO कोटिंग के लिए एक ही निर्देशों का पालन करें।
  5. अगले दिन, एक P200 पिपेट का उपयोग करें और कुओं से लैमिनिन कोटिंग को हटाने के लिए चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप को स्थिति दें। सभी कुओं के लिए DPBS जोड़ें और सेल सीडिंग के लिए आरटी पर लैमिनर प्रवाह में DPBS के साथ उपकरणों को छोड़ दें।
    नोट: इस बिंदु से, चैनलों से सीधे तरल (लैमिनिन कोटिंग, डीपीबीएस, मीडिया, फिक्सेशन समाधान, आदि) को हटाना महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि यह हवा के बुलबुले के गठन का कारण बन सकता है। कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले हमेशा माइक्रोस्कोप के नीचे उपकरणों का निरीक्षण करें।

4. सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तैयारी - दिन 9

  1. सीडिंग कोशिकाओं से एक दिन पहले सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को तैयार करें, क्योंकि कोटिंग को रात भर इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। मोटर न्यूरॉन प्रोटोकॉल के अनुसार, यह एक बुधवार होगा।
    1. एक 10 सेमी पेट्री पकवान के लिए 70% -100% इथेनॉल के ~ 10 मिलीलीटर जोड़ें। नसबंदी के लिए पेट्री डिश में शिपिंग कंटेनर से डिवाइस को स्थानांतरित करने के लिए एक संदंश का उपयोग करें। डिवाइस को 10 s के लिए इथेनॉल में डुबोएं और ~ 30 मिनट के लिए लैमिनर प्रवाह में हवा में सूखने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से संदंश के साथ स्थानांतरित करें। सभी पक्षों को सूखने की अनुमति देने के लिए डिवाइस को अपनी तरफ रखें।
    2. डिवाइस के आकार के लिए SEM शीट को काटें (प्रत्येक पक्ष पर कुछ मिमी छोड़ दें)। चरण 4.1.1 में ऊपर बताए गए अनुसार नसबंदी को दोहराएं। फिर, सूखने के लिए 10 सेमी पेट्री डिश में संदंश के साथ स्थानांतरित करें। एक डिश में दो-तीन एसईएम शीट फिट होंगी।
  2. DPBS में PLO (100 μg / mL) के साथ उपकरणों और SEM शीट को कोट करें और 37 °C पर इनक्यूबेट करें, 3 घंटे के लिए 5% CO2 ।
    1. 6-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक डिवाइस के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से DPBS में PLO के 1 mL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि डिवाइस चैनल और माइक्रोग्रोव पक्ष के साथ पीएलओ समाधान के शीर्ष पर तैर रहा है जो तरल में नीचे का सामना कर रहा है। DPBS प्रति 10 सेमी पेट्री डिश में PLO के 10 mL जोड़ें और तरल में SEM शीट को नीचे धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें।
      नोट: SEM चादरें आमतौर पर कोटिंग समाधान के शीर्ष पर तैरती हैं। डिवाइस और शीट को असेंबल करने से पहले, SEM शीट को चारों ओर घुमाएं ताकि सतह, जो PLO के संपर्क में रही है, डिवाइस के चैनल और माइक्रोग्रोव सतह से संपर्क करे।
    2. 3 घंटे के बाद, डिवाइस और SEM शीट्स को DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 2x धोएं, इसके बाद बाँझ पानी के साथ 5 मिनट के लिए एक और धोएं। यदि आवश्यक हो तो एक सक्शन प्रणाली का उपयोग करें। आसान हैंडलिंग के लिए एक व्यक्ति 10 सेमी पेट्री डिश के लिए प्रत्येक SEM शीट स्थानांतरित करें।
      नोट: दोनों उपकरणों और SEM पत्रकों को असेंबली से पहले पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। बाँझ पानी के साथ अंतिम धोने से DPBS से संभावित नमक क्रिस्टल को हटा दिया जाता है, जो अन्यथा असेंबली को बाधित कर सकता है।
  3. एक लैमिनर प्रवाह में एक माइक्रोस्कोप के तहत काम करें। चैनल के साथ सिलिकॉन डिवाइस को माउंट करने के लिए संदंश का उपयोग करें और SEM शीट पर 90 ° कोण पर माइक्रोग्रोव पक्ष नीचे, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी पक्ष संरेखित हैं। न केवल बाहरी किनारों को सील करना सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस पर हल्के से नीचे दबाएं, बल्कि कुओं, चैनलों और माइक्रोग्रूव्स के आसपास भी।
    नोट: बंधुआ क्षेत्र भूरे रंग के दिखाई देंगे, जबकि जो अभी तक घुड़सवार नहीं हैं, वे माइक्रोस्कोप के नीचे स्पष्ट दिखाई देंगे। सुनिश्चित करें कि सभी क्षेत्रों को अच्छी तरह से हवा के बुलबुले के बिना सील कर रहे हैं culturing के दौरान डिवाइस की टुकड़ी से बचने के लिए. बढ़ते को अवरुद्ध करने वाले मलबे या नमक क्रिस्टल के मामले में, बढ़ते प्रक्रिया को पुन: प्रयास करने से पहले बाँझ पानी में SEM शीट और डिवाइस दोनों को फिर से धोएं और सूखा दें। यदि microgrooves डिवाइस पर बहुत मुश्किल दबाने से विकृत दिखाई देते हैं, तो SEM शीट से डिवाइस को पूरी तरह से हटा दें और फिर से बढ़ते का प्रयास करें। डिवाइस माउंट होने के बाद मीडिया को कोटिंग और बदलते समय सावधान रहें।
  4. एक लैमिनर प्रवाह में एक माइक्रोस्कोप के तहत काम करें। एक Neurobasal माध्यम में लैमिनिन (20 μg / mL) के साथ डिवाइस कोट और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट।
    नोट: रात भर इनक्यूबेशन सिलिकॉन डिवाइस को सख्त कर देता है और आगे इसे SEM शीट पर सील करता है।
    1. एक P200 पिपेट का उपयोग करें एक शीर्ष में लैमिनिन समाधान के 100 μL जोड़ने के लिए अच्छी तरह से संभव के रूप में चैनल खोलने के करीब और ऊपर से अच्छी तरह से चैनल के माध्यम से नीचे अच्छी तरह से पारित तरल पदार्थ का निरीक्षण अच्छी तरह से. कुएं और चैनल के चारों ओर रिसाव के लिए जाँच करें।
    2. इसके बाद, नीचे अच्छी तरह से लैमिनिन समाधान के 100 μL जोड़ें और रिसाव के लिए जाँच करें। माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दोहराएं और डिवाइस के एक तरफ एक अतिरिक्त 100 μL के साथ समाप्त करें ताकि माइक्रोग्रूव्स को कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाया जा सके (उदाहरण के लिए, दाईं ओर 200 μL, बाईं ओर 300 μL)।
      नोट: रिसाव के मामले में, लैमिनिन कोटिंग को हटा दें, डिवाइस और एसईएम शीट को अलग करें और बाँझ पानी में दोनों को धो लें। उन्हें सूखने दें और चरण 4.3 के बाद से दोहराएं।
    3. अगले दिन, चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप की स्थिति द्वारा एक P200 पिपेट के साथ कुओं से कोटिंग को हटा दें। सभी कुओं के लिए DPBS जोड़ें और सेल सीडिंग के लिए आरटी पर लैमिनर प्रवाह में DPBS के साथ उपकरणों को छोड़ दें।
      नोट: इस बिंदु से, चैनलों से सीधे तरल (लैमिनिन कोटिंग, DPBS, मीडिया, निर्धारण समाधान, आदि) को हटाने के लिए न करें, क्योंकि यह हवा के बुलबुले के गठन का कारण बन सकता है। कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले हमेशा माइक्रोस्कोप के नीचे उपकरणों का निरीक्षण करें।

5. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NPCs के चढ़ाना - दिन 10

नोट: मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 15 के अनुसार, दिन 10 NPCs की चढ़ाना एक गुरुवार को होता है।

  1. रॉक अवरोधक (10 μL / mL) समाधान के साथ दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम (तालिका 2 और तालिका 3) के प्रति 10 मिलीलीटर प्रति 10 मिलीलीटर बैंक वाले NPCs की 1-2 शीशियों को पिघलाएं, और 4 मिनट के लिए 100 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. रॉक अवरोधक (10 μL / mL) समाधान के साथ दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम के 500-1000 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और किसी भी पसंदीदा गिनती विधि का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट: जैसा कि नीचे कहा गया है, एक इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए मीडिया की सही मात्रा में NPCs को पुन: निलंबित करना सुनिश्चित करें।
  3. एक P200 पिपेट और बीज 250,000 NPCs प्रति डिवाइस 60-100 μL दिन 10 मोटर न्यूरॉन मीडिया के साथ डिवाइस में microgrooves के एक तरफ दो कुओं से DPBS निकालें।
    1. शीर्ष दाईं ओर अच्छी तरह से, सेल निलंबन (125,000 कोशिकाओं) के बीज 30-50 μL एक 45 ° कोण पर चैनल खोलने के करीब और पिपेट टिप के साथ कुएं के केंद्र की ओर अच्छी तरह से फर्श के साथ शेष तरल पदार्थ को धीरे से खींचें।
    2. सेल निलंबन को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें, इसे कम अच्छी तरह से दोहराने से पहले (30-50 μL में 125,000 कोशिकाएं)। एक माइक्रोस्कोप के बिना डिवाइस के आसान अभिविन्यास के लिए seeded पक्ष "NPC" या समकक्ष चिह्नित करने के लिए एक पेन का उपयोग करें।
    3. डिवाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 एक अतिरिक्त दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम (कुल 200 μL / अच्छी तरह से) के साथ दो-बीज वाले कुओं को टॉप करने से पहले सेल अनुलग्नक की अनुमति दें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर फिर से इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक कुएं में 200 μL हो सकते हैं। दोनों कुओं और चैनलों में सीडिंग कोशिकाएं संस्कृति की एक मजबूत संरचना सुनिश्चित करती हैं, जिससे मीडिया परिवर्तनों के दौरान सेल टुकड़ी का खतरा कम हो जाता है। केवल चैनल में कम कोशिकाओं को बीज करना संभव है। हालांकि, यह प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के दौरान चैनलों के माध्यम से वॉल्यूम वर्तमान के लिए संस्कृति को अधिक संवेदनशील बना देगा।
  4. ताजा बीजवाले एनपीसी के विपरीत माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दो कुओं से DPBS को हटाने के लिए एक P200 पिपेट का उपयोग करें। 200 μL / दिन 10 मोटर न्यूरॉन मीडिया के कुएं जोड़ें और मीडिया को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए ऊपर और नीचे के बीच कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें। फिर, इनक्यूबेशन के दौरान माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए डिवाइस के चारों ओर प्रति 10 सेमी डिश प्रति 6 एमएल डीपीबीएस जोड़ें।
    नोट:: यदि आवश्यक हो तो संस्कृति अवधि के दौरान डिवाइस के आसपास अतिरिक्त DPBS जोड़ें।
  5. दिन 11 (शुक्रवार), दिन 14 (सोमवार), और दिन 16 (बुधवार) (तालिका 2 और तालिका 3) पर डिवाइस के दोनों डिब्बों में एक पूर्ण मोटर न्यूरॉन मध्यम परिवर्तन करें। मध्यम परिवर्तन के दिन ताजा मीडिया की खुराक जोड़ें।
    नोट:: पर इस बिंदु से, एक P200 पिपेट के साथ सभी मध्यम परिवर्तन निष्पादित करें। हमेशा पिपेट टिप को चैनल से दूर अच्छी तरह से किनारे पर रखें और सीधे चैनल से तरल को न हटाएं। सावधान रहें कि सिलिकॉन उपकरणों को अलग न करें। सेल टुकड़ी को रोकने के लिए माध्यम को हटाने और जोड़ने के लिए धीरे-धीरे किया जाना चाहिए।
    1. चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से दीवार के निचले किनारे पर P200 पिपेट टिप की स्थिति द्वारा NPCs के साथ दोनों कुओं में सभी मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें। धीरे-धीरे चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से दीवार के शीर्ष किनारे पर P200 पिपेट टिप की स्थिति द्वारा शीर्ष पर ताजा मोटर न्यूरॉन माध्यम के 50-100 μL जोड़ें।
    2. कुछ सेकंड के लिए रोकें ताकि माध्यम को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति मिल सके, इससे पहले कि नीचे अच्छी तरह से मोटर न्यूरॉन माध्यम के 50-100 μL जोड़ें। इस प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक दोहराएं जब तक कि दोनों कुओं में 200 μL / अच्छी तरह से न हो। कोशिकाओं के बिना पक्ष पर दोहराएँ।

6. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में एमएबी का चढ़ाना - दिन 17

  1. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (मोटर न्यूरॉन भेदभाव के दिन 10) में एमएबी को सीडिंग करने से लगभग 7 दिन पहले, एमएबी को पिघलाएं और उन्हें पर्याप्त सेल विस्तार की अनुमति देने के लिए कोलेजन के साथ लेपित टी 75 फ्लास्क में विकास माध्यम (तालिका 1) में बीज दें। अनुभाग 2 देखें।
  2. मोटर न्यूरॉन भेदभाव (गुरुवार) के 17 वें दिन, एमएबी को अलग करें जैसा कि चरण 2.4 में समझाया गया है, विकास माध्यम के ~ 500 μL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और किसी भी पसंदीदा गिनती विधि का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: जैसा कि नीचे कहा गया है, इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए मीडिया की सही मात्रा में एमएबी को फिर से निलंबित करना सुनिश्चित करें।
  3. एक P200 पिपेट के साथ डिवाइस में microgrooves के गैर-वरीयता प्राप्त पक्ष पर मोटर न्यूरॉन माध्यम निकालें, DPBS के साथ धीरे से धोएं, और विकास माध्यम के 60-100 μL में प्रति डिवाइस 200,000 MABs बीज।
    1. शीर्ष दाईं ओर अच्छी तरह से, सेल निलंबन (100,000 कोशिकाओं) के बीज 30-50 μL एक 45 ° कोण पर चैनल खोलने के करीब और पिपेट टिप के साथ कुएं के केंद्र की ओर अच्छी तरह से फर्श के साथ शेष तरल पदार्थ को धीरे से खींचें। निचले कुएं (30-50 μL में 100,000 कोशिकाओं) में दोहराने से पहले चैनल के माध्यम से कोशिकाओं के प्रवाह की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें।
    2. अतिरिक्त विकास माध्यम (कुल 200 μL / अच्छी तरह से) के साथ दो ताजा एमएबी-बीज वाले कुओं को टॉप करने से पहले सेल अनुलग्नक की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर डिवाइस को इनक्यूबेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर फिर से इनक्यूबेट करें।
      नोट: डिवाइस के मोटर न्यूरॉन पक्ष पर 17 वें दिन कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है। पहले प्रकाशित मोटर न्यूरॉन भेदभाव विधि 15 के अनुसार दिन 17 मध्यम परिवर्तन इसके बजाय 18 वें दिन (शुक्रवार) पर किया जाता है।

7. एमएबी डिब्बे की ओर मोटर न्यूरॉन न्यूराइट्स के विकास को बढ़ावा देने के लिए एक वॉल्यूमेट्रिक और कीमोटैक्टिक ग्रेडिएंट का कार्यान्वयन

  1. दिन 18 पर, दिन 18 मोटर न्यूरॉन माध्यम (200 μL / अच्छी तरह से) के साथ मोटर न्यूरॉन पक्ष पर एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें। चरण 5.5.1-5.5.2 में उल्लिखित मध्यम परिवर्तनों के लिए निर्देशों का पालन करें। डिवाइस के MAB डिब्बे में MAB विभेदन प्रारंभ करें (तालिका 2 और तालिका 4).
    1. मानव एग्रिन (200 μL / अच्छी तरह से) के 0.01 μg / mL के साथ पूरक प्रीहीटेड एमएबी भेदभाव माध्यम (तालिका 4) जोड़ने से पहले डीपीबीएस के साथ एक बार एमएबी डिब्बों को सावधानीपूर्वक धोएं।
      नोट: MABs फ्यूज और एक सप्ताह के समय पाठ्यक्रम में multinucleated myotubes फार्म होगा.
  2. दिन 21 पर, मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल (सोमवार) के अनुसार, कीमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट (तालिका 2 और तालिका 3) शुरू करें।
    1. मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF), ग्लियाल सेल लाइन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (GDNF) और सिलियरी न्यूरोट्रॉफिक कारक (CNTF), मानव एग्रिन (0.01 μg / mL), और लैमिनिन (20 μg / mL) के 30 ng / mL के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के 200 μL / अच्छी तरह से जोड़ें मायोट्यूब डिब्बे (पहले एमएबी डिब्बे के रूप में परिभाषित)। मोटर न्यूरॉन डिब्बे के लिए विकास कारकों के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम (100 μL / अच्छी तरह से) जोड़ें।
  3. मोटर न्यूरॉन भेदभाव के दिन 28 तक हर दूसरे दिन चरण 7.2 को दोहराएं। सप्ताहांत के दौरान किसी भी मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं होती है।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मोटर इकाई प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 22 की समयरेखा के अनुसार दिन 0 से दिन 28 तक भेदभाव समयरेखा और सह-संस्कृति अवलोकन। आईपीएससी से मोटर न्यूरॉन भेदभाव दिन 0 पर शुरू किया जाता है और जैसा कि पहले कहा गया है कि निम्नलिखित 10 दिनों के लिए किया जाता है। दिन 9 पर, डिवाइस को स्टरलाइज़ किया जाता है और पीएलओ-लैमिनिन के साथ लेपित किया जाता है। MABs T75 फ्लास्क में विस्तार के लिए thawed हैं। 10 वें दिन, मोटर न्यूरॉन-एनपीसी को दोनों कुओं और डिवाइस के एक डिब्बे (हल्के भूरे) के चैनल में चढ़ाया जाता है, जहां मोटर न्यूरॉन्स में उनका भेदभाव एक सप्ताह तक जारी रहता है। एमएबी को 17 वें दिन दोनों कुओं और विपरीत डिब्बे (गहरे भूरे) के चैनल में चढ़ाया जाता है। दिन 18 पर, मायोट्यूब में एमएबी भेदभाव शुरू हो जाता है। 21 वें दिन, डिवाइस के माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने के लिए एक वॉल्यूमेट्रिक और केमोटैक्टिक ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। मोटर न्यूरॉन डिब्बे को विकास कारकों (हल्के हरे रंग के डिब्बे) के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम का 100 μL / अच्छी तरह से प्राप्त हुआ, जबकि मायोट्यूब डिब्बे को 30 ng / mL विकास कारकों (गहरे हरे रंग के डिब्बे) (तालिका 2 और तालिका 3) के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम का 200 μL / अच्छी तरह से प्राप्त हुआ। संस्कृति को वॉल्यूमेट्रिक और केमोटैक्टिक ग्रेडिएंट के साथ अतिरिक्त 7 दिनों के लिए जारी रखा जाता है जब तक कि दिन 28 पर विश्लेषण नहीं किया जाता है। ब्राइट-फील्ड छवियां दिन 0, दिन 11, दिन 18, और दिन 28 पर सेल आकृति विज्ञान दिखाती हैं जो पूर्व-इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सुसंस्कृत होती हैं। स्केल बार, 100 μm. इस आंकड़े को Stoklund Dittlau, K. et al.18 से संशोधित किया गया है। कक्ष चित्र स्मार्ट सर्वर मेडिकल Art22 से संशोधित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

8. फिक्सेशन और आईसीसी

नोट: न्यूरोनल संस्कृतियों की टुकड़ी को रोकने के लिए सभी चरणों को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। निम्न चरणों के दौरान चैनलों से तरल को न निकालें।

  1. एक धुएं हुड या लैमिनर प्रवाह में निर्धारण करें: फिक्सेशन से पहले डीपीबीएस के साथ डिवाइस में सभी कुओं को एक बार ध्यान से धोएं। डीपीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके लैमिनर प्रवाह (100 μL / अच्छी तरह से) में आरटी पर 15-20 मिनट के लिए ठीक करें।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभालें।
    1. डिवाइस के शीर्ष कुएं में सावधानीपूर्वक 100 μL जोड़ें और नीचे अच्छी तरह से 100 μL जोड़ने से पहले फिक्सेशन समाधान को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें। दूसरी तरफ दोहराएं। इनक्यूबेशन बाद, पीएफए समाधान को हटा दें और धीरे से डीपीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं। भंडारण के लिए 200 μL / अच्छी तरह से DPBS में छोड़ दें और आईसीसी प्रयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए पैराफिल्म के साथ 10 सेमी पेट्री डिश को सील करें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि डिवाइस संग्रहण के दौरान सूख नहीं है।
  2. आईसीसी प्रक्रिया के दिन 1 पर आरटी में 20 मिनट के लिए DPBS में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के एक permeabilization समाधान (100 μL / अच्छी तरह से) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। Permeabilization समाधान निकालें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.1% Triton X-100 / DPBS समाधान (100 μL / अच्छी तरह से) में 5% सामान्य गधा सीरम जोड़ें।
  3. 5% सामान्य गधा सीरम समाधान निकालें, और 0.1% Triton X-100 / DPBS समाधान में 2% सामान्य गधा सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ उपकरणों को इनक्यूबेट करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. वॉल्यूम ग्रेडिएंट लागू करें. माइक्रोग्रूव्स के एक तरफ एंटीबॉडी समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें और दूसरे पर 150 μL / अच्छी तरह से (प्रति डिवाइस 500 μL कुल)।
      नोट: माइक्रोग्रूव्स के दोनों ओर विभिन्न एंटीबॉडी का उपयोग करना संभव है। इस मामले में, डिब्बों के बीच तरल पदार्थ अलगाव को बनाए रखने के लिए माइक्रोग्रूव्स में प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वॉल्यूम ग्रेडिएंट को लागू न करें। माइक्रोग्रूव्स में न्यूराइट्स ग्रेडिएंट के बिना दाग नहीं होंगे।
  4. अगले दिन (आईसीसी प्रक्रिया का दिन 2), प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 / डीपीबीएस समाधान के साथ 5 मिनट के लिए डिवाइस को सावधानीपूर्वक 3x धोएं।
    नोट: आसानी से detachable संस्कृतियों में, 5 मिनट के लिए 3x धोने 30 मिनट के लिए 1x के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  5. अब से अंधेरे में काम करें, क्योंकि द्वितीयक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) प्रकाश संवेदनशील हैं। 0.1% ट्राइटन X-100/ DPBS समाधान में 0.1% सामान्य गधे के सीरम में द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को RT पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 8.3.1 में बताए गए वॉल्यूम ग्रेडिएंट को लागू करें। इनक्यूबेशन बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें और DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
  6. DPBS (100 μL / अच्छी तरह से) में DAPI के साथ परमाणु डीएनए को RT पर 20 मिनट के लिए लेबल करें, इसके बाद 0.1% ट्राइटन X-100 / DPBS समाधान के साथ 5 मिनट धोने के 3x-4x के बाद। सभी कुओं से 0.1% ट्राइटन एक्स -100 / डीपीबीएस समाधान को हटा दें और सील करने के लिए प्रत्येक कुएं में फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ने से पहले संस्कृति को कुछ सेकंड के लिए सूखने दें।
    नोट:: बढ़ते मीडिया को सेट करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 24 ज के लिए डिवाइस क्षैतिज रखें। 24 घंटे के बाद, उपकरणों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड केस में संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ z-स्टैक में छवि।
    1. NMJs छवि करने के लिए, एक myotube एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ चिह्नित myotubes का पता लगाने के लिए एक 40x उद्देश्य का उपयोग करें और न्यूरोनल और मायोट्यूब ऊतक इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए z-स्टैक रिकॉर्डिंग करें। मामले में कई छवियों ले लो myotube भी एक ही फ्रेम में फिट करने के लिए बड़ा है.
    2. NMJ परिमाणीकरण के लिए, मैन्युअल रूप से प्रत्येक z-स्टैक के माध्यम से एक न्यूरोनल प्रीसिनेप्टिक मार्कर और एक एसीएचआर मार्कर के बीच सह-स्थानीयकरण की संख्या की गणना करें। z-स्टैक में मौजूद मायोट्यूब की संख्या के लिए सह-स्थानीयकरणों की संख्या को सामान्य करें।

9. निर्धारण और SEM के लिए डिवाइस की तैयारी

नोट: तरल पदार्थ बदलते समय, सेल पतन से बचने के लिए संस्कृति को कवर करने के लिए हमेशा एक छोटी राशि रखें। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक विषाक्त पदार्थों का उपयोग करता है, और पूरी प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षाउपकरणों के साथ और धुएं के हुड में काम करना आवश्यक है।

  1. फिक्सेशन और डिसअसेंबली: 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर (पीएच 7.6) में ताजा 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड (जीए) तैयार करें, 0.2 μm फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें, और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    सावधानी: GA और सोडियम cacodylate विषाक्त हैं: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभाल।
    1. मीडिया और सेल मलबे को हटाने के लिए DPBS के साथ डिवाइस को सावधानीपूर्वक एक बार धोएं और फिर आरटी पर 15 मिनट के लिए जीए समाधान के साथ उपसर्ग करें।
    2. संदंश के साथ डिवाइस को स्थिर करते समय डिवाइस की परिधि में SEM शीट को सावधानीपूर्वक काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि काटने के दौरान डिवाइस को अलग न करें। एक 3 सेमी पेट्री डिश के लिए संदंश की मदद से डिवाइस और SEM शीट ले जाएँ और आसान हैंडलिंग के लिए एक 10 सेमी डिश में 3 सेमी डिश जगह।
    3. उपसर्ग के 15 मिनट के बाद, संदंश का उपयोग करके SEM शीट से डिवाइस को सावधानीपूर्वक हटा दें। डिवाइस को एक कोने में अलग करें और धीरे-धीरे इसे विपरीत कोने की ओर एक विकर्ण दिशा में हटा दें। डिवाइस से अलग कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    4. 3 सेमी डिश में पूरे SEM शीट को कवर करने के लिए अतिरिक्त GA समाधान जोड़ें और RT पर या 4 °C पर रात भर में कुल 2 h के लिए निर्धारण जारी रखें।
      नोट: धीरे किसी भी सेल-कवर सतहों से बचने के द्वारा संदंश के साथ GA समाधान के तहत SEM पत्रक धक्का।
  2. SEM के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें। संक्षेप में, ओस्मियम टेट्रोक्साइड में इनक्यूबेट करें, इसके बाद इथेनॉल की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण होता है। महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के लिए एक coverslip धारक में SEM शीट डालें और कार्बन स्टिकर और कोटिंग के लिए समर्थन स्टब्स पर माउंट करें। 5 kV के त्वरित वोल्टेज और 7 मिमी की एक कामकाजी दूरी पर छवि के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

10. लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर NMJ कार्यक्षमता का आकलन

  1. तैयार डिवाइस: 200 μL के साथ मायोट्यूब डिब्बे को ताज़ा करें / दिन 18 मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के साथ 30 एनजी / एमएल बीडीएनएफ, जीडीएनएफ, और सीएनटीएफ के साथ और मोटर न्यूरॉन डिब्बे के साथ 200 μL / अच्छी तरह से मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम विकास कारकों के बिना (तालिका 2 और तालिका 3)।
    1. 5 μM की अंतिम एकाग्रता पर मायोट्यूब डिब्बे में Fluo-4 डाई विलायक में पतला Fluo-4 AM डाई जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में डिवाइस को इनक्यूबेट करें, 25 मिनट के लिए 5% CO2। जबकि डिवाइस इनक्यूबेशन के तहत है, 450 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर विकास कारकों के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम में पोटेशियम क्लोराइड को पतला करें।
      नोट: Fluo-4 AM एक कैल्शियम संकेतक है, जो कैल्शियम बाइंडिंग पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि को दर्शाता है। अब से अंधेरे में काम करें, क्योंकि डाई प्रकाश संवेदनशील है।
    2. 25 मिनट के बाद, 200 μL / दिन के अच्छी तरह से 18 मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के साथ मायोट्यूब डिब्बे को ताज़ा करें BDNF, GDNF, और CNTF के 30 ng / mL के साथ और मोटर न्यूरॉन डिब्बे के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के 100 μL / अच्छी तरह से विकास कारकों के बिना केमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट को फिर से स्थापित करने के लिए।
    3. NMJs को अवरुद्ध करने के लिए, AChR प्रतिस्पर्धी विरोधी ट्यूबोक्यूरारिन हाइड्रोक्लोराइड पेंटाहाइड्रेट के 19 μM के साथ मायोट्यूब कम्पार्टमेंट माध्यम को पूरक करें।
      सावधानी: Tubocurarine हाइड्रोक्लोराइड pentahydrate विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरणों के साथ एक धुएं हुड में संभाल।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 के लिए समायोजित एक इनक्यूबेटर के साथ सुसज्जित एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप के साथ रिकॉर्डिंग प्रदर्शन।
    1. एक 10x उद्देश्य के साथ, myotube डिब्बे में myotubes का पता लगाने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग करें। लेजर शक्ति को समायोजित करें, लाभ और 488 चैनल के लिए ऑफसेट एक स्तर पर जहां Fluo-4 प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत मायोट्यूब को चिह्नित करता है।
      नोट:: प्रतिनिधि परिणाम 5% की लेजर शक्ति, 60 (HV) का लाभ, और 0 का एक ऑफसेट करने के लिए सॉफ़्टवेयर की A1 सेटिंग्स में स्क्रॉल सलाखों को समायोजित करके प्राप्त किए गए थे।
  3. रिकॉर्डिंग समय को 1 s अंतराल के साथ 1 मिनट के लिए सेट करें। बेसलाइन होने के लिए 5-10 एस के लिए रिकॉर्ड करें, इसके बाद पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ मोटर न्यूरॉन्स को तुरंत उत्तेजित करें।
    1. रिकॉर्डिंग में 5-10 सेकंड के बाद, धीरे-धीरे 50 एमएम की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मोटर न्यूरॉन डिब्बे के एक कुएं में पोटेशियम क्लोराइड समाधान के 25 μL जोड़ें।
      नोट: पोटेशियम क्लोराइड समाधान को बहुत तेजी से जोड़ने से बचें क्योंकि यह चैनल के माध्यम से एक लहर बनाएगा, जिससे रिकॉर्डिंग पर कलाकृतियां पैदा होंगी।
  4. एक 2 मिनट के ठहराव के साथ दो बार मोटर न्यूरॉन उत्तेजना के साथ मायोट्यूब डिब्बे को रिकॉर्ड करें, इसके बाद मोटर न्यूरॉन विध्रुवीकरण से स्वतंत्र प्रत्यक्ष मायोट्यूब गतिविधि का आकलन करने के लिए मायोट्यूब डिब्बे के 25 μL पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना के बाद।
  5. परिमाणीकरण के लिए, रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर के साथ मैन्युअल रूप से प्रत्येक मायोट्यूब को सर्कल करें और 1-मिनट की समय अवधि में Fluo-4 फ्लोरोसेंट तीव्रता का विश्लेषण करें। कैल्शियम की आमद में वृद्धि को निर्धारित करने के लिए, पोटेशियम क्लोराइड के साथ उत्तेजना के बाद शिखर मूल्य से औसत आधारभूत मूल्य (यानी, पोटेशियम क्लोराइड उत्तेजना से पहले पहले पहले 10 एस से औसत) घटाएं। प्रतिनिधि परिणाम सॉफ़्टवेयर के समय मापन उपकरण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।

Representative Results

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NMJs का उत्पादन
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक एनएमजे के साथ एक मानव मोटर इकाई उत्पन्न करने के लिए, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और मानव एमएबी-व्युत्पन्न मायोट्यूब का उपयोग किया गया था। शुरुआती सेल सामग्री की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, और विशेष रूप से मायोट्यूब में एमएबी की संलयन क्षमता इस प्रोटोकॉल के सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। एमएबी को संस्कृति में रखना आसान है। हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (पूरक चित्रा 1 ए, बी) 18 पर लागू करने से पहले प्रत्येक बैच की संलयन क्षमता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। कोई भी बैच, जो भेदभाव के 10 दिनों के बाद मायोट्यूब गठन नहीं दिखाते हैं, का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। पूरक चित्रा 1 बी में संलयन सूचकांक प्रति छवि नाभिक की कुल संख्या के प्रत्येक मायोट्यूब मार्कर के लिए सकारात्मक मायोट्यूब्स के भीतर नाभिक के प्रतिशत की गणना करके निर्धारित किया गया था। हमने पाया कि एनएमजे उत्पन्न करने में हमारी सह-संस्कृति के लिए लगभग 8% का संलयन सूचकांक पर्याप्त था।

आईपीएससी की शुद्ध संस्कृति से मोटर न्यूरॉन भेदभाव शुरू करना हमेशा महत्वपूर्ण होता है। इनपुट जितना शुद्ध होगा - परिणाम उतना ही शुद्ध होगा। मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों को उत्पन्न करता है, जो आमतौर पर मोटर न्यूरॉन मार्करों (पूरक चित्रा 1 सी, डी) 18 के लिए 85% -95% सकारात्मक होते हैं। शेष कोशिकाएं आमतौर पर अविभाजित अग्रदूत कोशिकाएं होंगी, जो कुछ मामलों में व्यापक प्रसार से गुजरेंगी और इसके द्वारा संस्कृति की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा। इस प्रोटोकॉल का सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, डिवाइस में दिन 10 मोटर न्यूरॉन-एनपीसी को लागू करने से पहले मोटर न्यूरॉन भेदभाव दक्षता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एनपीसी मार्कर ओलिग 2 (पूरक चित्रा 1ई, एफ) की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए 11 वें दिन में एक एनपीसी गुणवत्ता जांच की जा सकती है।

प्रारंभ में, मोटर न्यूरॉन-एनपीसी और एमएबी को 10 वें दिन एक ही समय बिंदु पर मढ़वाया गया था। यहां, एमएबी भेदभाव 11 वें दिन शुरू किया गया था। दिन 14 पर लागू की गई मात्रा और विकास कारक ढाल ने हमें 21 वें दिन एनएमजे गठन का मूल्यांकन करने की अनुमति दी, जिससे प्रोटोकॉल को एक सप्ताह तक कम कर दिया गया। दिलचस्प बात यह है कि हम आईसीसी (पूरक चित्रा 2 ए) द्वारा विशेषता एनएमजे गठन का निरीक्षण कर सकते हैं। हालांकि, हम मोटर न्यूरॉन भेदभाव (डेटा नहीं दिखाया गया है) में इस शुरुआती लाइव-सेल कैल्शियम रिकॉर्डिंग के माध्यम से एक कार्यात्मक आउटपुट प्राप्त करने में सक्षम नहीं थे। हमने निष्कर्ष निकाला कि मोटर न्यूरॉन्स अभी तक मायोट्यूब के साथ कार्यात्मक एनएमजे कनेक्शन बनाने के लिए पर्याप्त परिपक्व नहीं थे, भले ही एनएमजे आकृति विज्ञान आशाजनक लग रहा था। यह हमारी पिछली टिप्पणियों के अनुरूप है कि मोटर न्यूरॉन्स में सहज कार्रवाई क्षमता, पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण के माध्यम से दर्ज की गई है, केवल मोटर न्यूरॉन भेदभाव 15 के दिन 35 पर होती है।

इसके अलावा, हमने एमएबी चढ़ाना करने से पहले 2 सप्ताह (दिन 24) के लिए डिवाइस में मोटर न्यूरॉन्स को परिपक्व करके मोटर न्यूरॉन परिपक्वता के साथ-साथ सह-संस्कृति स्थिरता को लम्बा खींचने का प्रयास किया। दुर्भाग्य से, माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से बड़ी मात्रा में सहज मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट क्रॉसिंग देखी गई थी, जिसके परिणामस्वरूप एमएबी लगाव (पूरक चित्रा 2 बी) का निषेध हुआ। चैनल में मायोट्यूब गठन की कमी के कारण, हम 36 वें दिन एनएमजे की पहचान करने में असफल रहे और इसलिए 28-दिवसीय प्रोटोकॉल (चित्रा 1) को लागू किया।

इन विट्रो NMJs की पहचान, परिमाणीकरण, और रूपात्मक लक्षण वर्णन
28-दिवसीय प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का पालन करने के बाद, पूरी तरह से कार्यात्मक NMJs प्राप्त किए जा सकते हैं। विवो और इन विट्रो दोनों में, एनएमजे को एक प्रीसिनैप्टिक मार्कर और पोस्टसिनैप्टिक मार्कर के सह-स्थानीयकरण के माध्यम से इम्यूनोहिस्टो- या इम्यूनोसाइटोकेमिकल रूप से विशेषता है। इस अध्ययन में, एक प्रीसिनेप्टिक मार्कर संयोजन के रूप में न्यूरोफिलामेंट हेवी चेन (NEFH) और SYP के संयोजन का उपयोग किया गया था, जिसने मोटर न्यूरॉन के सोमा से सबसे दूरस्थ प्रक्रिया की ओर एक एकल न्यूराइट के निम्नलिखित की अनुमति दी थी। मांसपेशियों की ओर, Btx व्यापक रूप से ACHR के लिए एक पोस्टसिनेप्टिक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है, और इसी तरह इस अध्ययन में भी उपयोग किया गया था। एग्रीन और लैमिनिन का पूरक सरकोलेमा 19,20,21 पर एसीएचआर के क्लस्टरिंग को बढ़ावा देता है, जिससे विट्रो में एसीएचआर की पहचान करना आसान हो जाता है और इसी तरह ACHRs और NMJs की संख्या बढ़ जाती है।

एक निष्पक्ष तरीके से NMJs का पता लगाने और गणना करने के लिए, प्रत्येक मायोट्यूब को मायोसिन हेवी चेन (MyHC) -सकारात्मकता के माध्यम से पहचाना जाता है और एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 40x आवर्धन पर z-स्टैक में चित्रित किया जाता है। बहुत लंबे समय तक मायोट्यूब के लिए, कई जेड-स्टैक का अधिग्रहण किया गया था। छवि विश्लेषण के लिए, NEFH / SYP और Btx के बीच सह-स्थानीयकरणों की संख्या को प्रत्येक z-स्टैक के माध्यम से मैन्युअल रूप से गिना जाता है, और सह-स्थानीयकरणों की संख्या को z-स्टैक (चित्रा 2A-C) 18 में मौजूद मायोट्यूब की संख्या के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। सभी मायोट्यूब में एनएमजे नहीं होंगे, जैसा कि इनरवेटेड मायोट्यूब (चित्रा 2 डी) के परिमाणीकरण में देखा गया है। नतीजतन, एक निष्पक्ष रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण करना महत्वपूर्ण है, जहां सभी मायोट्यूब को चित्रित किया जाता है, जो बीटीएक्स उपस्थिति से स्वतंत्र होता है।

इस इन विट्रो सिस्टम में दो प्रकार के आकारिकी की पहचान करना संभव है। NMJs या तो एकल संपर्क बिंदु NMJs के रूप में दिखाई देते हैं, जहां एक न्यूराइट एक इंटरैक्शन बिंदु पर ACHR के एक क्लस्टर पर छूता है, या कई संपर्क बिंदु NMJs, जहां एक न्यूराइट एक बड़ी सतह पर ACHR क्लस्टर के साथ प्रशंसक और संलग्न होगा। इन दो आकारिकी को इम्युनोसाइटोकेमिकल रूप से (चित्रा 2 ए) 18 और एसईएम (चित्रा 2 बी) 18 के साथ दोनों की पहचान की जा सकती है, और इसी तरह इसे परिमाणित किया जा सकता है (चित्रा 2 सी) 18। कुल मिलाकर, कई संपर्क बिंदु एक बड़ी मांसपेशी एम्बेडमेंट के माध्यम से एक व्यापक कनेक्शन की सुविधा प्रदान करते हैं, जो अधिक परिपक्व एनएमजे गठन की ओर इशारा करता है। इसके विपरीत, एकल संपर्क बिंदु NMJs को संस्कृति की प्रारंभिक विकासात्मक स्थिति के कारण कम परिपक्व माना जाता है।

इन विट्रो NMJs का कार्यात्मक मूल्यांकन
NMJs की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, लाइव-सेल कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग का उपयोग किया गया था (चित्रा 3)18। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तरल रूप से अलग-थलग प्रणाली का लाभ उठाते हुए, मोटर न्यूरॉन सोमा पक्ष को पोटेशियम क्लोराइड की एक उच्च एकाग्रता (50 एमएम) के साथ प्रेरित किया गया था, जबकि साथ ही साथ मायोट्यूब में कैल्शियम में एक आमद दर्ज की गई थी, जो कैल्शियम-संवेदनशील फ्लूओ -4 डाई (चित्रा 3 ए) से भरी हुई थी। मोटर न्यूरॉन सक्रियण पर लगभग तुरंत, हम एक विशेषता तरंग गठन के माध्यम से मायोट्यूब में कैल्शियम प्रवाह का निरीक्षण कर सकते हैं, जो मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट और मायोट्यूब (चित्रा 3 ए-सी) 18 के माध्यम से एक कार्यात्मक कनेक्शन की पुष्टि करता है। कोई सहज कैल्शियम तरंगें या सहज मायोट्यूब संकुचन नहीं देखे गए थे, हालांकि पोटेशियम क्लोराइड के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना पर मायोट्यूब संकुचन देखा गया था। कनेक्शन की विशिष्टता को आगे प्रतिस्पर्धी एसीएचआर प्रतिपक्षी, ट्यूबोक्यूरिन हाइड्रोक्लोराइड पेंटाहाइड्रेट (डीटीसी) को मायोट्यूब डिब्बे (चित्रा 3 ए) में जोड़कर पुष्टि की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप कैल्शियम प्रवाह (चित्रा 3 सी) का निषेध हुआ। इस प्रभाव ने पुष्टि की कि मोटर न्यूरॉन्स और मायोट्यूब के बीच कनेक्शन के परिणामस्वरूप पूरी तरह से कार्यात्मक एनएमजे हुए। एनएमजे उत्तेजना के माध्यम से सक्रिय मायोट्यूब की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए, इस डिब्बे में सक्रिय मायोट्यूब की कुल संख्या की पहचान करने के लिए मायोट्यूब डिब्बे को सीधे पोटेशियम क्लोराइड के साथ प्रेरित किया गया था। मायोट्यूब का लगभग 70% पोटेशियम क्लोराइड (चित्रा 3 डी) 18 के साथ मोटर न्यूरॉन-प्रेरित सक्रियण के माध्यम से सक्रिय था।

ये परिणाम इष्टतम NMJ गठन, संख्या, आकृति विज्ञान, और 28-दिवसीय प्रोटोकॉल के दौरान आईपीएससी-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और एमएबी-व्युत्पन्न मायोट्यूब के सह-संवर्धन के माध्यम से कार्यक्षमता की पुष्टि करते हैं।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NMJ गठन. (A) 28 वें दिन में पूर्व-इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NMJ गठन के Confocal micrographs. NMJs को प्रीसिनैप्टिक मार्करों (NEFH और SYP) के सह-स्थानीयकरण (एरोहेड्स) और MyHC-दाग मायोट्यूब पर पोस्टसिनेप्टिक एसीएचआर मार्कर (Btx) के माध्यम से पहचाना जाता है। NMJs को न्यूराइट्स और ACHR समूहों के बीच एकल या एकाधिक संपर्क बिंदु गठन के माध्यम से रूपात्मक रूप से पहचाना जाता है। DAPI लेबल नाभिक. स्केल बार, 25 μm. इनसेट एक NMJ का आवर्धन दिखाता है। इनसेट स्केल बार, 10 μm. (बी) दिन 28 पर सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NMJ आकृति विज्ञान के SEM। एरोहेड्स मायोट्यूब में न्यूराइट एम्बेडमेंट को दर्शाते हैं। स्केल बार, 2 μm. इनसेट NMJ का एक आवर्धन दिखाता है। इनसेट स्केल बार, 1 μm. (C) प्रति मायोट्यूब NMJs की कुल संख्या के साथ-साथ myotube प्रति एकल और एकाधिक संपर्क बिंदु NMJs की संख्या का परिमाणीकरण। ग्राफ़ को चार जैविक प्रतिकृतियों से माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि के रूप में दिखाया गया है। सांख्यिकीय महत्व मान-व्हिटनी परीक्षण के साथ निर्धारित किया जाता है * पी < 0.05 के साथ। (d) इनरवेटेड मायोट्यूब के प्रतिशत का परिमाणीकरण। ग्राफ़ को चार जैविक प्रतिकृतियों से माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि के रूप में दिखाया गया है। इस आंकड़े को Stoklund Dittlau, K. et al.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: NMJ कार्यक्षमता की पुष्टि। (ए) ट्यूबोक्यूरारिन (डीटीसी) 22 के साथ एनएमजे रुकावट से पहले और बाद में 28 वें दिन में पूर्व-इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में एनएमजे कार्यक्षमता की लाइव-सेल क्षणिक कैल्शियम रिकॉर्डिंग का योजनाबद्ध चित्रण। हल्के हरे रंग के डिब्बे में मोटर न्यूरॉन्स को 50 एमएम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) के साथ उत्तेजित किया जाता है, जो न्यूराइट्स के माध्यम से एक इंट्रासेल्युलर मोटर न्यूरॉन प्रतिक्रिया का कारण बनता है। यह मायोट्यूब में कैल्शियम (Ca2+) की आमद पैदा करता है, जिसे कैल्शियम-संवेदनशील फ्लुओ -4 डाई (गहरे हरे रंग के डिब्बे) के साथ लेबल किया जाता है। (बी) पूर्व-उत्तेजना, तीव्रता चोटी और एक मायोट्यूब की पोस्ट-उत्तेजना के फ्लुओ -4 प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ जो केसीएल के साथ मोटर न्यूरॉन उत्तेजना पर इंट्रासेल्युलर कैल्शियम वृद्धि की एक लहर को दर्शाते हैं। इनसेट एक आंतरिक सक्रिय मायोट्यूब के आवर्धन को दर्शाता है। स्केल सलाखों, 100 μm. इनसेट स्केल बार, 200 μm. (C) KCl (तीर) NMJ कार्यक्षमता की पुष्टि के साथ मोटर न्यूरॉन उत्तेजना के बाद मायोट्यूब में प्रतिनिधि कैल्शियम प्रवाह घटता है। मायोट्यूब 1-3 मोटर न्यूरॉन-मायोट्यूब इनर्वेशन के माध्यम से विशेषता कैल्शियम घटता दिखाता है, जबकि मायोट्यूब ए-सी डीटीसी डीटीसी के साथ एनएमजे ब्लॉकिंग के बाद घटता को दर्शाता है। (डी) सक्रिय मायोट्यूब की कुल संख्या पर मोटर न्यूरॉन-प्रेरित सक्रिय मायोट्यूब का अनुपात। इस आंकड़े को Stoklund Dittlau, K. et al.18 से संशोधित किया गया है। कक्ष चित्र स्मार्ट सर्वर मेडिकल Art22 से संशोधित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: मोटर न्यूरॉन सत्यापन, एमएबी संलयन सूचकांक, और एनपीसी गुणवत्ता नियंत्रण। (ए) एमएबी-व्युत्पन्न मायोट्यूब की कॉन्फोकल छवियां विभेदन की दीक्षा के 10 दिन बाद। मायोट्यूब को मायोट्यूब मार्करों के साथ लेबल किया जाता है: डेस्मिन, माईएचसी, मायोजेनिन (मायोजी) और टिटिन। नाभिक DAPI के साथ दाग कर रहे हैं. स्केल बार, 100 μm. (B) भेदभाव की शुरुआत के 10 दिनों के बाद MAB संलयन सूचकांक का परिमाणीकरण। भुखमरी पर, एमएबी मल्टीन्यूक्लिएटेड मायोट्यूब में फ्यूज करते हैं, जिन्हें मायोट्यूब मार्कर सकारात्मकता (एबी +) के लिए परिमाणित किया गया था। ग्राफ़ तीन जैविक प्रतिकृतियों से माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि को दर्शाता है। (सी) भेदभाव के दिन 28 पर आईपीएससी-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स की कॉन्फोकल छवियां, जिन्हें मोटर न्यूरॉन मार्करों NEFH, कोलीन एसिटाइलट्रांसफरेज़ (CHAT) और आइलेट -1 के अलावा पैन-न्यूरोनल मार्कर के अलावा लेबल किया जाता है। नाभिक DAPI के साथ दाग कर रहे हैं. स्केल बार, 75 μm. (D) कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण, जो मोटर न्यूरॉन और पैन-न्यूरोनल मार्करों (AB+) के लिए सकारात्मक हैं। ग्राफ़ तीन जैविक प्रतिकृतियों से माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि को दर्शाता है। (ई) मोटर न्यूरॉन भेदभाव के 11 वें दिन में आईपीएससी-व्युत्पन्न एनपीसी की कॉन्फोकल छवियां, जिन्हें एनपीसी मार्कर ओलिग 2 और पैन-न्यूरोनल मार्कर के साथ लेबल किया गया है, आईआईआई-ट्यूबुलिन (ट्यूबुलिन)। नाभिक DAPI के साथ दाग कर रहे हैं. स्केल बार, 50 μm. (F) NPCs की संख्या का परिमाणीकरण, जो Olig2 और πIII-ट्यूबुलिन (AB+) के लिए धनात्मक हैं। ग्राफ़ तीन जैविक प्रतिकृतियों से माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि को दर्शाता है। इस आंकड़े को Stoklund Dittlau, K. et al.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: सह-संस्कृति प्रोटोकॉल का अनुकूलन (ए) मोटर न्यूरॉन भेदभाव के दिन 21 पर एनएमजे गठन की कॉन्फोकल छवियों, जब एमएबी को दिन 10 में एनपीसी के रूप में एक ही समय बिंदु पर बीज दिया जाता है। NMJs को प्रीसिनैप्टिक मार्करों (NEFH और SYP) के सह-स्थानीयकरण (एरोहेड्स) और MyHC-दाग मायोट्यूब पर पोस्टसिनेप्टिक एसीएचआर मार्कर (Btx) के माध्यम से पहचाना जाता है। स्केल बार (बाएं), 10 μm. स्केल बार (दाएं), 5 μm. (बी) दिन 24 पर मायोट्यूब चैनल की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि सहज मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट क्रॉसिंग को दर्शाती है जो एमएबी के लगाव को बाधित करती है। स्केल बार, 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
IMDM 1x 80%
भ्रूण गोजातीय सीरम 15%
पेनिसिलिन/ 5000 U/mL 0.5%
L-glutamine 50x 1%
सोडियम पाइरूवेट 100 mM 1%
गैर-आवश्यक अमीनो एसिड 100x 1%
इंसुलिन ट्रांसफेरिन सेलेनियम 100x 1%
bFGF (ताजा जोड़ा गया) 50 μg/mL 5 ng/mL

तालिका 1: एमएबी विकास माध्यम। मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक रह सकता है bFGF उपयोग के दिन ताजा जोड़ा जाता है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
DMEM/F12 50%
न्यूरोबेसल माध्यम 50%
पेनिसिलिन/ 5000 U/mL 1%
L-glutamine 50x 0.5 %
N-2 पूरक 100x 1%
विटामिन ए के बिना बी -27 50x 2%
β-मर्केप्टोएथेनॉल 50 mM 0.1%
एस्कॉर्बिक अम्ल 200 μM 0.5 μM

तालिका 2: मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम। मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह तक रह सकता है।

दिन अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता डिब्बा
दिन 10/11 चिकना एगोनिस्ट 10 mM 500 nM दोनों
रेटिनोइक अम्ल 1 mM 0.1 μM
DAPT 100 mM 10 μM
BDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
GDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
दिन 14 DAPT 100 mM 20 μM दोनों
BDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
GDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
दिन 16 DAPT 100 mM 20 μM दोनों
BDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
GDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
CNTF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
दिन 18 BDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL मोटर न्यूरॉन
GDNF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
CNTF 0.1 mg/mL 10 ng/mL
दिन 21+ BDNF 0.1 mg/mL 30 ng/mL मायोट्यूब
GDNF 0.1 mg/mL 30 ng/mL
CNTF 0.1 mg/mL 30 ng/mL
एग्रीन 50 μg/mL 0,01 μg/mL
लैमिनिन 1 mg/mL 20 μg/mL
दिन 21+ कोई पूरक नहीं मोटर न्यूरॉन

तालिका 3: मोटर न्यूरॉन मध्यम की खुराक. पूरक मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के लिए उपयोग के दिन ताजा जोड़ा जाता है।

दिन अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता डिब्बा
दिन 18 DMEM/F12 97% MAB
सोडियम पाइरूवेट 100 mM 1%
घोड़ा सीरम 2%
एग्रीन 50 μg/mL 0.01 μg/mL

तालिका 4: MAB भेदभाव माध्यम. मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक रह सकता है। एग्रीन को उपयोग के दिन ताजा जोड़ा जाता है।

Discussion

प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत आसान-से-उपयोग विधि का वर्णन करता है, जो 30 दिनों से भी कम समय में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक एनएमजे के साथ मानव मोटर इकाइयों को उत्पन्न करता है। यह वर्णन किया गया है कि कैसे NMJs को आईसीसी और SEM जैसी मानक तकनीकों के माध्यम से रूपात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है और लाइव-सेल कैल्शियम रिकॉर्डिंग के माध्यम से कार्यात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ स्टेम सेल तकनीक का उपयोग है। यह पूर्ण अनुकूलन क्षमता के लिए अनुमति देता है जिसमें एनएमजे का मूल्यांकन स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से दाता प्रोफ़ाइल से। मॉडल पहले से ही एएलएस अनुसंधान में सफल और फायदेमंद साबित हुआ है, जहां हमने एफयूएस जीन 18 में उत्परिवर्तन के कारण उपन्यास फेनोटाइप के रूप में न्यूराइट आउटग्रोथ, रीग्रोथ और एनएमजे नंबरों में हानि की पहचान की है। इस मॉडल के साथ, एएलएस के छिटपुट रूपों को शामिल करने के लिए अनुसंधान का विस्तार करना संभव है, जहां एटियलजि अज्ञात है, छिटपुट एएलएस रोगियों से आईपीएससी का उपयोग करके। यह पारंपरिक पशु मॉडल पर एक लाभ प्रदान करता है, जो मानव रोग 23,24 को दोहराने के लिए उत्परिवर्तित जीन के ट्रांसजेनिक ओवरएक्सप्रेशन पर भरोसा करता है। इसके अलावा, हमारी पूरी तरह से मानव प्रणाली मानव-विशिष्ट शरीर विज्ञान और बीमारी के संभावित पुनरावृत्ति के लिए अनुमति देती है। पिछले अध्ययनों ने कृंतक और मानव एनएमजे आकृति विज्ञान 25 के बीच के अंतर का प्रदर्शन किया, जो बताता है कि मानव एनएमजे पैथोलॉजी को संबोधित करने के लिए कृन्तकों का उपयोग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। यद्यपि यह प्रणाली एक सापेक्ष सरल इन विट्रो सेटअप है, जिसमें इन विवो मॉडल की जटिलता का अभाव है, यह प्रदर्शित करना संभव था कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में प्रदर्शित एनएमजे आकृति विज्ञान मानव विच्छेदन 25 के एनएमजे जैसा दिखता है। इसके अलावा, यह मॉडल एनएमजे गठन और परिपक्वता के दौरान एनएमजे मूल्यांकन की अनुमति देता है, संभावित रूप से प्रारंभिक रोग फेनोटाइप का खुलासा करता है, जो मानव पोस्टमार्टम नमूनों में अनुपस्थित, अज्ञात या अनदेखी करते हैं।

एमएबी मायोट्यूब उत्पन्न करने के लिए एक वैध विकल्प प्रदान करते हैं, हालांकि 10 दिनों का उनका सीमित अस्तित्व सिस्टम का नुकसान है। मायोट्यूब अस्तित्व सतह के प्रति उनके लगाव पर निर्भर करता है, जो संभवतः मायोफाइबर के सहज संकुचन से समझौता किया जाता है। 10 से अधिक दिनों के बाद, अधिकांश मायोट्यूब अलग हो जाएंगे, एनएमजे संस्कृति को अनुपयोगी बना देंगे। आदर्श रूप से, मायोट्यूब को आईपीएससी से भी उत्पन्न किया जाएगा। हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल संलयन सूचकांक 27,28,29,30 में परिवर्तनशीलता के कारण 26 को पुन: पेश करना मुश्किल साबित हुआ है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके, हमने एक मानकीकृत प्रणाली उत्पन्न की, जो पूरी तरह से सुलभ है। अन्य NMJ मॉडल मौजूद हैं31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. हालांकि, वे आमतौर पर एकल डिब्बों पर भरोसा करते हैं, जिसमें सेल प्रकारों के बीच या कस्टम-निर्मित संस्कृति जहाजों के बीच कंपार्टमेंटलाइजेशन और तरल पदार्थ अलगाव की कमी होती है, जो उपलब्धता को कम करता है और संभावित रूप से पुनरुत्पादकता भी। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को विभिन्न लंबाई के माइक्रोग्रूव्स के साथ खरीदा जा सकता है, जो आगे के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जैसे कि चेताक्षीय परिवहन 43,44 या एक्सोटॉमी 18,45,46 जांच। डिब्बों के बीच तरल पदार्थ अलगाव आगे मोटर न्यूरॉन्स या मायोट्यूब के कंपार्टमेंटलाइज्ड ड्रग उपचार को सक्षम बनाता है, जो चिकित्सा विकास में अनुकूल हो सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स में विशेषज्ञता रखने वाली अधिक कंपनियां उभरी हैं, जो डिवाइस डिजाइन और सुविधाओं के बड़े चयन के लिए खुल गई हैं, आगे इन विट्रो अनुसंधान के लिए पहुंच को बढ़ावा देती हैं।

अंत में, हमने कार्यात्मक NMJs के साथ मानव मोटर इकाइयों को संस्कृति करने के लिए एक विश्वसनीय, बहुमुखी और आसान विधि प्रदान करने वाला एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।

Disclosures

L.V.D.B के पास Charcot-Marie-Tooth रोग (US-2013227717-A1) में एचडीएसी अवरोधकों के उपयोग पर पेटेंट है, जो ऑगस्टीन थेरेप्यूटिक्स के वैज्ञानिक सह-संस्थापक हैं, और इसके वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के सदस्य हैं। अन्य लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों ने लिमोन से निक्की कॉर्थआउट और सेबेस्टियन मुंक, रिसर्च ग्रुप मॉलिक्यूलर न्यूरोबायोलॉजी (VIB-KU Leuven) को लाइव-सेल कैल्शियम क्षणिक प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद दिया। इस शोध को बेल्जियम और लक्समबर्ग, केयू ल्यूवेन (सी 1 और "ओपनिंग द फ्यूचर" फंड) के लिए फुलब्राइट कमीशन द्वारा समर्थित किया गया था, वीआईबी, विज्ञान और प्रौद्योगिकी द्वारा नवाचार के लिए एजेंसी (आईडब्ल्यूटी); SBO-iPSCAF), "वैज्ञानिक अनुसंधान फ़्लैंडर्स के लिए फंड" (FWO-Vlaanderen), लक्ष्य ALS, ALS लिगा बेल्जियम (ALS के लिए एक इलाज), बेल्जियम सरकार (Interuniversity आकर्षण डंडे कार्यक्रम P7/16 बेल्जियम संघीय विज्ञान नीति कार्यालय द्वारा शुरू), Thierry Latran फाउंडेशन और "एसोसिएशन Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM)। T.V. और J.B. FWO-Vlaanderen द्वारा सम्मानित पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 Thermo Fisher Scientific B35451 Antibody (1:1000)
Acetic Acid CHEM-Lab NV CL00.0116.1000 Coating component. H226, H314. P280
Aclar 33C sheet (SEM sheet) Electron Microscopy Sciences 50425-25 Thickness: 7.8 mil
Agrin (recombinant human protein) R&D systems 6624-AG-050 Media supplement
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit Thermo Fisher Scientific A21206 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat Thermo Fisher Scientific A21432 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31570 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31571 Antibody (1:1000)
Ascorbic acid Sigma A4403 Media component
βIII-tubulin (Tubulin) Abcam ab7751 Antibody (1:500)
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 Media component. H317. P280.
B-27 without vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010 Media component
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-02B Growth factor
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) Peprotech 100-18B Growth factor
Choline acetyltransferase (ChAT) Millipore ab144P Antibody (1:500)
Collagen from calfskin Thermo Fisher Scientific 17104019 Coating component
CNTF (ciliary neurotrophic factor) Peprotech 450-13B Growth factor
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent Thermo Fisher Scientific R37605 Immunocytochemistry component
DAPT Tocris Bioscience 2634 Media supplement
Desmin Abcam Ab15200 Antibody (1:200)
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330032 Media component
DMSO Sigma D2650-100ML Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 no calcium, no magnesium
Ethanol VWR 20.821.296 Sterilization. H225. P280
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270106 Media component
Fluo-4 AM live cell dye Thermo Fisher Scientific F14201 Calcium imaging dye
Fluorescence Mounting Medium Dako S3023 Immunocytochemistry component
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-10B Growth factor
Glutaraldehyde Agar Scientific R1020 Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050122 Media component
Human alkaline phosphatase R&D systems MAB1448 Antibody
ImageJ software NIH ICC analysis
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440053 Media component
Insulin transferrin selenium Thermo Fisher Scientific 41400045 Media component
Islet-1 Millipore ab4326 Antibody (1:400)
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Cryopreservation component
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020-1MG Coating component and media supplement
Leica SP8 DMI8 confocal microscope Leica ICC confocal microscopy
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024 Media component
Myogenin (MyoG) Abcam Ab124800 Antibody (1:500)
Myosin heavy chain (MyHC) In-house, SCIL Antibody (1:20)
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048 Media component
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Coating and media component
Neurofilament heavy chain (NEFH) Abcam AB8135 Antibody (1:1000)
Nikon A1R confocal microscope Nikon Live-cell calcium imaging microscopy
NIS-Elements AR 4.30.02 software Nikon Live-cell calcium imaging analysis
Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140050 Media component
Normal donkey serum Sigma D9663-10ML Immunocytochemistry component
Olig2 IBL 18953 Antibody (1:1000)
Parafilm M Sigma P7793-1EA Storing equipment
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15070063 Media component
Petri dish (3 cm) nunc 153066 Diameter: 3 cm
Petri dish (10 cm) Sarstedt 833.902 Diameter: 10 cm
Plate (6-well) Cellstar Greiner bio-one 657160 Culture plate
Pluronic F-127 Thermo Fisher Scientific P3000MP Fluo-4 dye solvent
Poly-L-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Coating component
Potassium chloride CHEM-Lab NV CL00.1133.1000 Calcium imaging reagent
Retinoic acid Sigma R2625 Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell supplement Thermo Fisher Scientific A2644501 ROCK inhibitor solution
Smoothened agonist Merch Millipore 566660 Media supplement
Sodium cacodylate buffer Sigma C0250 Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Media component
Synaptophysin (SYP) Cell Signaling 5461S Antibody (1:1000)
T75 flask Sigma CLS3276 Culture plate
Titin Developmental Studies Hybridoma Bank 9D10 Antibody (1:300)
Triton X-100 Sigma T8787-250ML Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE express Thermo Fisher Scientific 12605010 MAB dissociation solution
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379-100G Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.
XonaChips pre-assembled microfluidic device Xona Microfluidics XC150 Microgroove length: 150 μm
Xona Silicone microfluidics device Xona Microfluidics SND75 Microgroove length: 75 μm

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 175
माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के साथ मानव मोटर इकाइयों का उत्पादन
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Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E. N., Fumagalli, L., Vandoorne, T., Baatsen, P., Kerstens, A., Giacomazzi, G., Pavie, B., Rossaert, E., Beckers, J., Sampaolesi, M., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (175), e62959, doi:10.3791/62959 (2021).

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