Summary
Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.
Abstract
Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) sono sinapsi specializzate tra l'assone del motoneurone inferiore e il muscolo che facilitano l'impegno della contrazione muscolare. Nei disturbi del motoneurone, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e l'atrofia muscolare spinale (SMA), gli NMJ degenerano, con conseguente atrofia muscolare e paralisi progressiva. Il meccanismo alla base della degenerazione NMJ è sconosciuto, in gran parte a causa della mancanza di modelli di ricerca traducibili. Questo studio mirava a creare un modello in vitro versatile e riproducibile di un'unità motoria umana con NMJ funzionali. Pertanto, i motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e i miotubi derivati dal mesoangioblasto primario umano (MAB) sono stati co-coltivati in dispositivi microfluidici disponibili in commercio. L'uso di microcomparti fluidicamente isolati consente il mantenimento di microambienti specifici per cellula, consentendo al contempo il contatto cellula-cellula attraverso microsopracci. Applicando un gradiente chemiotattico e volumetrico, è stata stimolata la crescita dei motoneuroni-neuriti attraverso i microsopravati che promuovono l'interazione miotubica e la formazione di NMJ. Questi NMJ sono stati identificati immunocitochimicamente attraverso la co-localizzazione del marcatore presinaptico del motoneurone sinaptofisina (SYP) e del marcatore del recettore postsinaptico dell'acetilcolina (AChR) α-bungarotossina (Btx) sui miotubi e caratterizzati morfologicamente utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). La funzionalità degli NMJ è stata confermata misurando le risposte al calcio nei miotubi dopo la depolarizzazione dei motoneuroni. L'unità motoria generata utilizzando dispositivi microfluidici standard e la tecnologia delle cellule staminali può aiutare la ricerca futura incentrata sugli NMJ in salute e malattia.
Introduction
Gli NMJ facilitano la comunicazione tra i motoneuroni spinali inferiori e le fibre muscolari scheletriche attraverso il rilascio di neurotrasmettitori1. Nei disturbi del motoneurone come la SLA e la SMA, gli NMJ degenerano, causando un'interruzione della comunicazione con i muscoli2,3,4,5,6,7. Ciò si traduce in pazienti che perdono gradualmente la loro funzione muscolare, il che li fa essere legati alla sedia a rotelle e alla fine dipendenti dal supporto vitale respiratorio a causa della progressiva atrofia dei gruppi muscolari vitali come il diaframma. Gli esatti meccanismi sottostanti responsabili di questa profonda perdita di NMJ in questi disturbi sono sconosciuti. Molti studi sono stati condotti su modelli animali transgenici, che ci hanno dato alcune informazioni sulla patogenesi della degenerazione NMJ5,6,8,9,10,11. Tuttavia, per comprendere appieno la patologia e contrastare la denervazione, è importante avere un sistema umano, che consenta la piena accessibilità.
Qui, il protocollo descrive un modo relativamente semplice per generare NMJ umani attraverso la co-coltura di motoneuroni derivati da hiPSC e miotubi primari umani derivati da MAB utilizzando dispositivi microfluidici disponibili in commercio. L'uso della microfluidica per polarizzare e isolare fluidicamente i somi e gli assoni dei neuroni è noto sin dalla prima descrizione delle camere "Campenot"12 alla fine del 1970. Da allora, sono stati fabbricati più progetti microfluidici, comprese le opzioni commerciali. I dispositivi utilizzati in questo protocollo contengono due scomparti e ogni compartimento è costituito da due pozzi collegati con un canale13. I due scomparti sono specchiati e collegati con diversi microsalchi. Questi microsacchiotti hanno una dimensione che facilita la crescita dei neuriti mantenendo l'isolamento fluidico tra i due compartimenti attraverso una pressione idrostatica capillare13,14. Utilizzando questo sistema, è possibile coltivare motoneuroni in un compartimento e cellule muscolari nell'altro, ciascuno nel proprio specifico terreno di coltura, pur facilitando una connessione fisica attraverso i neuriti che passano attraverso i microsonda e si impegnano con le cellule muscolari. Questo modello fornisce un sistema in vitro completamente accessibile e adattabile di un'unità motoria umana, che può essere utilizzato per studiare la patologia NMJ precoce in malattie come la SLA e la SMA.
Protocol
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti, che hanno fornito i loro campioni per la generazione di iPSC e la raccolta di MAB. La procedura è stata approvata dal comitato etico medico dell'Ospedale universitario di Lovanio (n° S5732-ML11268) e dal principale comitato etico di ricerca del Regno Unito nell'ambito del progetto StemBANCC. Tutti i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali e devono essere utilizzati sterili. I fluidi devono essere riscaldati a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso, se non diversamente specificato. Per una panoramica del protocollo di co-coltura, vedere la Figura 1.
1. Differenziazione dei progenitori del motoneurone dalle iPSC
- Seguire il protocollo di differenziazione dei motoneuroni15, adattato da uno studio precedente16, fino a raggiungere lo stato di progenitore neurale (NPC) del giorno 10. Secondo il periodo di tempo del protocollo, la differenziazione viene avviata di lunedì (giorno 0), il che si traduce in NPC del giorno 10 il giovedì.
- Crioconserva giorno 10 NPC in sostituzione del siero knock-out con il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) ad una densità di 2 x 106- 4 x 106 cellule per flaconcino.
ATTENZIONE: DMSO è tossico: maneggiare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.
NOTA: Circa il 50% del giorno 10 NPC dovrebbe essere vitale dopo lo scongelamento. Interrompere il protocollo di differenziazione dei motoneuroni in questo stato di "NPC del giorno 10" e crioconservare gli NPC per generare un gran numero di NPC, che possono essere bancati e utilizzati in seguito, riducendo la durata della timeline complessiva del protocollo di co-coltura da 28 giorni a 19 giorni totali.
2. Derivazione e mantenimento di MAB umani
NOTA: I MAB sono cellule staminali mesenchimali associate ai vasi, che in questo caso sono state raccolte da biopsie ottenute da un donatore sano di 58 anni. Sono disponibili fonti commerciali alternative. Il protocollo per ottenere i MAB è brevemente spiegato. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al protocollo dettagliato17. Tutti i supporti MAB devono essere riscaldati a 37 °C prima dell'uso.
- Tritare il tessuto bioptico e incubare su collagene (da pelle di vitello) rivestito di piatti di 6 cm in un mezzo di crescita (Tabella 1) per 2 settimane. Cambia il mezzo ogni 4 giorni.
- Per preparare il rivestimento di collagene, sciogliere 100 mg di collagene in 20 ml di acido acetico 0,1 M. Il collagene richiede tempo per dissolversi, quindi posiziona la miscela su una piattaforma a dondolo durante la notte a RT. Il giorno seguente, rabboccare con 80 mL di ddH2O per un volume finale di 100 mL.
ATTENZIONE: l'acido acetico è tossico; maniglia in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.
NOTA: il collagene del rivestimento in pelle di vitello può essere riutilizzato fino a 5 volte. Conservare a 4 °C. - Rivestire l'intera superficie del piatto o del pallone con collagene, chiudere e incubare per 20 minuti a RT all'interno di un flusso laminare. Dopo 20 minuti, recuperare il collagene in un contenitore fresco, chiudere il piatto/pallone vuoto e lasciare per 10 minuti a RT nel flusso laminare.
- Trasferire il piatto/pallone nell'incubatrice per l'incubazione notturna (o almeno 6 ore) (37 °C, 5% CO2). Lavare 5 volte con la soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio o magnesio (DPBS) prima di placcare le cellule.
- Per preparare il rivestimento di collagene, sciogliere 100 mg di collagene in 20 ml di acido acetico 0,1 M. Il collagene richiede tempo per dissolversi, quindi posiziona la miscela su una piattaforma a dondolo durante la notte a RT. Il giorno seguente, rabboccare con 80 mL di ddH2O per un volume finale di 100 mL.
- Dopo 14 giorni, FACS (fluorescent activated cell sorting) ordina i MAB per la fosfatasi alcalina umana17 seguita da un'ulteriore espansione. Mantenere i MAB su palloni T75 rivestiti di collagene nel terreno di crescita e cambiare il mezzo di crescita ogni 2 giorni (10 ml per pallone).
- Crioconserva, passaggio o semina MAB nei dispositivi quando raggiunge il 70% di confluenza.
NOTA: i MAB perdono il loro potenziale miogenico a causa di fusioni spontanee al contatto cellula-cellula. Assicurarsi di non superare il 70% di confluenza durante l'espansione dei LAB. Un pallone T75 confluente al 70% contiene circa 600.000-800.000 cellule, che possono essere crioconservate a 100.000 cellule per fiala. Ogni flaconcino può essere successivamente scongelato e seminato in un pallone T75 per l'espansione. - Per passare i MAB, lavarli delicatamente una volta con 7 mL di DPBS e quindi incubare in 7 mL di soluzione di dissociazione MAB per 3 minuti a 37 °C in 5% di CO2 per dissociare le cellule.
- Neutralizzare la soluzione di dissociazione MAB con 7 mL del mezzo di crescita, raschiare delicatamente le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 50 mL. Lavare delicatamente il matraccio con altri 5 ml del mezzo di crescita per raccogliere i MAB potenzialmente rimanenti.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 x g, quindi passare direttamente a un nuovo pallone T75 rivestito di collagene per l'espansione, crioconservare in sostituzione del siero knock-out con DMSO al 10% o contare per seminare in un dispositivo microfluidico.
NOTA: i passaggi vengono eseguiti 1x-2x a settimana per l'espansione cellulare fino a un numero massimo di passaggio di 13. Dopo la dissociazione, i MAB appaiono sferici e di forma grande se esaminati al microscopio.
3. Preparazione di dispositivi microfluidici preassemblati - Giorno 9
NOTA: Il protocollo è adattato dal protocollo del dispositivo neurone del produttore del dispositivo microfluidico ed è stato regolato per l'uso di dispositivi preassemblati e in silicone. Qui, i dispositivi preassemblati vengono utilizzati per l'immunocitochimica (ICC) e le registrazioni transitorie di calcio a cellule vive, mentre i dispositivi in silicone vengono utilizzati per SEM. La timeline del protocollo segue la timeline per il protocollo di differenziazione del motoneurone.
- Preparare i dispositivi microfluidici il giorno prima della semina delle cellule, poiché il rivestimento deve incubare durante la notte. Secondo il protocollo del motoneurone, questo sarà un mercoledì. Aggiungere ~ 10 ml di etanolo al 70% -100% a una capsula di Petri di 10 cm. Utilizzare una pinza per trasferire il dispositivo dal contenitore di spedizione alla capsula di Petri per la sterilizzazione.
- Immergere il dispositivo in etanolo per 10 s e trasferire il dispositivo con una pinza su un pezzo di carta per asciugarlo all'aria nel flusso laminare per ~ 30 minuti. Capovolgere il dispositivo un paio di volte per consentire a entrambi i lati di asciugarsi. Quando il dispositivo è asciutto, utilizzare una pinza per spostare ogni dispositivo su una singola capsula di Petri da 10 cm per una facile manipolazione
ATTENZIONE: l'etanolo è tossico; maniglia in cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale - Rivestire il dispositivo con Poly-L-ornitina (PLO) (100 μg/mL) in DPBS e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 3 h.
- Utilizzare una pipetta P200 per aggiungere 100 μL di PLO in DPBS in un pozzo superiore il più vicino possibile all'apertura del canale e osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore. Successivamente, aggiungere 100 μL di PLO in DPBS al pozzo inferiore.
- Ripetere l'operazione sull'altro lato dei microsalpi e terminare aggiungendo 100 μL su un lato del dispositivo per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire i microgroovi (ad esempio, lato destro 200 μL, lato sinistro 300 μL). Dopo 3 ore, lavare il dispositivo 3 volte per 5 minuti con DPBS. Utilizzare un sistema di aspirazione, se necessario.
NOTA: Assicurarsi di evitare qualsiasi formazione di bolle d'aria nei canali in qualsiasi punto durante il rivestimento o la coltura delle cellule. Anche le piccole bolle si espanderanno in breve tempo, inibendo così il rivestimento, la semina cellulare o il flusso di media attraverso il canale. Se il fluido si ferma nel canale durante il rivestimento, risospesciare la soluzione PLO direttamente nel canale da entrambi i lati. Se le bolle sono ancora presenti, utilizzare 200 μL di DPBS per lavare il canale e ripetere il processo di rivestimento come indicato sopra nei passaggi 3.3.1-3.3.2. Se le bolle compaiono dopo la semina cellulare, è impossibile recuperare il dispositivo, poiché il lavaggio del canale danneggerà le cellule.
- Rivestire il dispositivo con laminina (20 μg/mL) in un mezzo neurobasale e incubare durante la notte a 37 °C, 5% CO2. Seguire le stesse istruzioni per il rivestimento PLO dai passaggi 3.3.1-3.3.2.
- Il giorno seguente, utilizzare una pipetta P200 e posizionare la punta nel pozzetto opposto all'apertura del canale per rimuovere il rivestimento laminina dai pozzetti. Aggiungere DPBS a tutti i pozzetti e lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a RT per la semina cellulare.
NOTA: Da questo punto in poi, è importante non rimuovere il liquido (rivestimento in laminina, DPBS, media, soluzione di fissaggio, ecc.) direttamente dai canali, in quanto ciò potrebbe causare la formazione di bolle d'aria. Ispezionare sempre i dispositivi al microscopio prima di seminare le cellule.
4. Preparazione di dispositivi microfluidici in silicone - Giorno 9
- Preparare i dispositivi microfluidici in silicone il giorno prima della semina delle cellule, poiché il rivestimento deve incubare durante la notte. Secondo il protocollo del motoneurone, questo sarà un mercoledì.
- Aggiungere ~ 10 ml di etanolo al 70% -100% a una capsula di Petri di 10 cm. Utilizzare una pinza per trasferire il dispositivo dal contenitore di spedizione alla capsula di Petri per la sterilizzazione. Immergere il dispositivo in etanolo per 10 s e trasferire con pinza in un pozzo in una piastra a 6 pozzetti per asciugare all'aria nel flusso laminare per ~ 30 minuti. Posizionare il dispositivo su un lato per consentire a tutti i lati di asciugarsi.
- Ridurre i fogli SEM alle dimensioni del dispositivo (lasciare alcuni mm su ciascun lato). Ripetere la sterilizzazione come indicato sopra al punto 4.1.1. Quindi, trasferire con una pinza su una piastra di Petri di 10 cm per asciugare. Due-tre fogli SEM si adatteranno in un piatto.
- Rivestire i dispositivi e i fogli SEM con PLO (100 μg/mL) in DPBS e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 3 h.
- Aggiungere 1 mL di PLO in DPBS per pozzetto a ciascun dispositivo nella piastra a 6 pozzetti. Assicurarsi che il dispositivo galleggi sulla parte superiore della soluzione PLO con il canale e il lato del microgroove rivolti verso il basso nel liquido. Aggiungere 10 ml di PLO in DPBS per capsula di Petri da 10 cm e utilizzare una pinza per spingere verso il basso i fogli SEM nel liquido.
NOTA: i fogli SEM di solito galleggiano sopra la soluzione di rivestimento. Prima di assemblare il dispositivo e il foglio, ruotare il foglio SEM in modo che la superficie, che è stata a contatto con l'OLP, contatti il canale e la superficie del microsalto del dispositivo. - Dopo 3 ore, lavare il dispositivo e i fogli SEM 2 volte per 5 minuti con DPBS seguito da un altro lavaggio per 5 minuti con acqua sterile. Utilizzare un sistema di aspirazione, se necessario. Trasferire ogni foglio SEM su una singola capsula di Petri da 10 cm per una facile manipolazione.
NOTA: sia i dispositivi che i fogli SEM devono essere completamente asciutti prima del montaggio. Il lavaggio finale con acqua sterile rimuove potenziali cristalli di sale dal DPBS, che altrimenti potrebbero inibire il montaggio.
- Aggiungere 1 mL di PLO in DPBS per pozzetto a ciascun dispositivo nella piastra a 6 pozzetti. Assicurarsi che il dispositivo galleggi sulla parte superiore della soluzione PLO con il canale e il lato del microgroove rivolti verso il basso nel liquido. Aggiungere 10 ml di PLO in DPBS per capsula di Petri da 10 cm e utilizzare una pinza per spingere verso il basso i fogli SEM nel liquido.
- Lavora al microscopio in un flusso laminare. Utilizzare una pinza per montare il dispositivo in silicone con il canale e il microgroove rivolti verso il basso con un angolo di 90 ° sul foglio SEM, assicurando che tutti i lati siano allineati. Premere leggermente verso il basso sul dispositivo per assicurarsi di sigillare non solo i bordi esterni, ma anche intorno a pozzetti, canali e microsonda.
NOTA: le aree incollate appariranno grigie, mentre quelle non ancora montate appariranno chiare al microscopio. Assicurarsi che tutte le aree siano ben sigillate senza bolle d'aria per evitare il distacco del dispositivo durante la coltivazione. In caso di detriti o cristalli di sale che bloccano il montaggio, lavare nuovamente sia il foglio SEM che il dispositivo in acqua sterile e asciugare prima di riprovare la procedura di montaggio. Se i microsonda appaiono distorti dalla pressione troppo forte sul dispositivo, rimuovere completamente il dispositivo dal foglio SEM e riprovare a montare. Prestare attenzione quando si rivestono e si cambiano i supporti una volta montato il dispositivo. - Lavora al microscopio in un flusso laminare. Rivestire il dispositivo con laminina (20 μg/mL) in un mezzo neurobasale e incubare durante la notte a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: l'incubazione notturna indurisce il dispositivo in silicone e lo sigilla ulteriormente sul foglio SEM.- Utilizzare una pipetta P200 per aggiungere 100 μL della soluzione di laminina in un pozzo superiore il più vicino possibile all'apertura del canale e osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore. Verificare la presenza di perdite intorno al pozzo e al canale.
- Successivamente, aggiungere 100 μL di soluzione di laminina sul pozzetto inferiore e verificare la presenza di perdite. Ripetere l'operazione sull'altro lato dei microsalchi e terminare con ulteriori 100 μL su un lato del dispositivo per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire i microsalchi (ad esempio, lato destro 200 μL, lato sinistro 300 μL).
NOTA: In caso di perdite, rimuovere il rivestimento laminina, smontare il dispositivo e i fogli SEM e lavare entrambi in acqua sterile. Lasciarli asciugare e ripetere dal punto 4.3 in poi. - Il giorno seguente, rimuovere il rivestimento dai pozzetti con una pipetta P200 posizionando la punta nel pozzo di fronte all'apertura del canale. Aggiungere DPBS a tutti i pozzetti e lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a RT per la semina cellulare.
NOTA: Da questo punto in poi, non rimuovere liquidi (rivestimento laminina, DPBS, fluidi, soluzione di fissaggio, ecc.) direttamente dai canali, in quanto ciò potrebbe causare la formazione di bolle d'aria. Ispezionare sempre i dispositivi al microscopio prima di seminare le cellule.
5. Placcatura di NPC in dispositivi microfluidici - Giorno 10
NOTA: Secondo il protocollo di differenziazione dei motoneuroni15, la placcatura degli NPC del giorno 10 avviene di giovedì.
- Utilizzare NPC del giorno 10 appena dissociati15, o scongelare 1-2 fiale di NPC bancati per 10 ml del mezzo motoneurone del giorno 10 (Tabella 2 e Tabella 3) con soluzione di inibitore ROCK (10 μL / mL) e centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 4 min.
- Risospendare il pellet cellulare in 500-1000 μL del mezzo motoneurone del giorno 10 con soluzione di inibitore ROCK (10 μL / mL) e contare le cellule vive utilizzando qualsiasi metodo di conteggio preferito.
NOTA: come indicato di seguito, assicurarsi di risospescere gli NPC nella quantità corretta di supporti per ospitare un volume di semina ottimale. - Rimuovere DPBS da due pozzetti su un lato dei microgroovi nel dispositivo con una pipetta P200 e seminare 250.000 NPC per dispositivo in 60-100 μL del giorno 10 mezzo motoneurone.
- Nel pozzetto in alto a destra, seminare 30-50 μL della sospensione cellulare (125.000 celle) vicino all'apertura del canale con un angolo di 45° e trascinare delicatamente il fluido rimanente lungo il pavimento del pozzo verso il centro del pozzo con la punta della pipetta.
- Pausa di qualche secondo per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di ripeterlo nel pozzo inferiore (125.000 celle in 30-50 μL). Utilizzare una penna per contrassegnare il lato seminato "NPC" o equivalente per un facile orientamento del dispositivo senza un microscopio.
- Incubare il dispositivo a 37 °C, 5% DI CO2 per 5 minuti per consentire l'attaccamento cellulare prima di rabboccare i pozzetti a due semi con un ulteriore mezzo motoneurone del giorno 10 (totale 200 μL / pozzetto) e incubare di nuovo a 37 ° C, 5% CO2.
NOTA: Ogni pozzetto può contenere 200 μL. Le cellule di semina sia nei pozzetti che nei canali assicurano una struttura robusta della coltura, riducendo il rischio di distacco cellulare durante i cambiamenti dei fluidi. È possibile seminare meno cellule nel solo canale. Tuttavia, questo renderà la cultura più suscettibile alla corrente di volume attraverso i canali durante ogni cambio di mezzo.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere DPBS dai due pozzetti dall'altra parte dei microsalchi di fronte agli NPC appena seminati. Aggiungere 200 μL / pozzetto del giorno 10 motor neuron media e attendere alcuni secondi tra il pozzetto superiore e inferiore per consentire ai media di fluire attraverso il canale. Quindi, aggiungere 6 ml di DPBS per piatto da 10 cm attorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo durante l'incubazione.
NOTA: aggiungere ulteriori DPBS intorno al dispositivo durante il periodo di coltura, se necessario. - Eseguire un cambiamento completo del mezzo del motoneurone in entrambi i compartimenti del dispositivo il giorno 11 (venerdì), il giorno 14 (lunedì) e il giorno 16 (mercoledì) (Tabella 2 e Tabella 3). Aggiungi nuovi supplementi multimediali il giorno del cambio del mezzo.
NOTA: da questo punto in poi, eseguire tutte le modifiche del mezzo con una pipetta P200. Posizionare sempre la punta della pipetta lontano dal canale sul bordo del pozzetto e non rimuovere il liquido direttamente dal canale. Fare attenzione a non staccare i dispositivi in silicone. La rimozione e l'aggiunta del mezzo devono essere eseguite lentamente per prevenire il distacco delle cellule.- Rimuovere con attenzione tutti i supporti in entrambi i pozzetti con NPC posizionando la punta della pipetta P200 sul bordo inferiore della parete del pozzo di fronte all'apertura del canale. Aggiungere lentamente 50-100 μL di mezzo motoneurone fresco al pozzetto superiore posizionando la punta della pipetta P200 sul bordo superiore della parete del pozzo di fronte all'apertura del canale.
- Pausa per alcuni secondi per consentire al mezzo di fluire attraverso il canale prima di aggiungere 50-100 μL di mezzo motoneurone al pozzo inferiore. Ripetere attentamente questo processo fino a quando entrambi i pozzetti contengono 200 μL/pozzetto. Ripetere sul lato senza celle.
6. Placcatura di MAB in dispositivi microfluidici - Giorno 17
- Circa 7 giorni prima di seminare i MAB nei dispositivi microfluidici (giorno 10 di differenziazione dei motoneuroni), scongelare i FAB e seminarli nel terreno di crescita (Tabella 1) in un pallone T75 rivestito di collagene per consentire una sufficiente espansione cellulare. Vedere paragrafo 2.
- Il giorno 17 della differenziazione dei motoneuroni (giovedì), dissociare i MAB come spiegato nel passaggio 2.4, risospesere il pellet cellulare in ~ 500 μL di terreno di crescita e contare le cellule vive utilizzando qualsiasi metodo di conteggio preferito.
NOTA: come indicato di seguito, assicurarsi di risospescere i LAB nella quantità corretta di supporti per adattarsi al volume di semina ottimale. - Rimuovere il mezzo del motoneurone sul lato non seminato dei microgroovi nel dispositivo con una pipetta P200, lavare delicatamente con DPBS e seminare 200.000 MAB per dispositivo in 60-100 μL di terreno di crescita.
- Nel pozzetto in alto a destra, seminare 30-50 μL di sospensione cellulare (100.000 celle) vicino all'apertura del canale con un angolo di 45° e trascinare delicatamente il fluido rimanente lungo il pavimento del pozzo verso il centro del pozzo con la punta della pipetta. Pausa di qualche secondo per consentire il flusso di cellule attraverso il canale prima di ripetere nel pozzo inferiore (100.000 celle in 30-50 μL).
- Incubare il dispositivo a 37 °C, 5% DI CO2 per 5 minuti per consentire l'aggancio cellulare prima di rabboccare i due pozzetti appena seminati maB con un mezzo di crescita aggiuntivo (totale 200 μL / pozzetto). Incubare di nuovo a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: il giorno 17 non è necessario alcun cambio di mezzo sul lato del motoneurone del dispositivo. Il cambiamento medio del giorno 17 secondo il metodo di differenziazione del motoneurone precedentemente pubblicato15 viene invece eseguito il giorno 18 (venerdì).
7. Implementazione di un gradiente volumetrico e chemiotattico per favorire la crescita dei neuriti motoneuroni verso il compartimento MAB
- Il giorno 18, eseguire un cambiamento medio completo sul lato del motoneurone con il mezzo del motoneurone del giorno 18 (200 μL / bene). Seguire le istruzioni per le modifiche medie menzionate nei passaggi 5.5.1-5.5.2. Avviare la differenziazione MAB nel compartimento MAB del dispositivo (Tabella 2 e Tabella 4).
- Lavare accuratamente i compartimenti MAB una volta con DPBS prima di aggiungere un mezzo di differenziazione MAB preriscaldato (Tabella 4) integrato con 0,01 μg/mL di agrin umano (200 μL/pozzetto).
NOTA: i MAB si fondono e formano miotubi multinucleati nel corso di una settimana.
- Lavare accuratamente i compartimenti MAB una volta con DPBS prima di aggiungere un mezzo di differenziazione MAB preriscaldato (Tabella 4) integrato con 0,01 μg/mL di agrin umano (200 μL/pozzetto).
- Il giorno 21, secondo il protocollo di differenziazione dei motoneuroni (lunedì), iniziare il gradiente chemiotattico e volumetrico (Tabella 2 e Tabella 3).
- Aggiungere 200 μL/ pozzetto di mezzo basale del motoneurone con 30 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF) e fattore neurotrofico ciliare (CNTF), agrin umano (0,01 μg / mL) e laminina (20 μg / mL) al compartimento del miotubo (precedentemente definito come compartimento MAB). Aggiungere il mezzo basale del motoneurone (100 μL / pozzetto) senza fattori di crescita al compartimento del motoneurone.
- Ripetere il passo 7.2 ogni secondo giorno fino al giorno 28 della differenziazione del motoneurone. Non è necessario alcun cambiamento dei media durante i fine settimana.
Figura 1: Panoramica schematica del protocollo dell'unità motore nei dispositivi microfluidici. Cronologia della differenziazione e panoramica della co-coltura dal giorno 0 al giorno 28 secondo la sequenza temporale del protocollo di differenziazione del motoneurone22. La differenziazione dei motoneuroni dalle iPSC viene iniziata al giorno 0 ed eseguita come indicato in precedenza per i successivi 10 giorni15. Il giorno 9, il dispositivo viene sterilizzato e rivestito con PLO-laminina. I MAB vengono scongelati per l'espansione in palloni T75. Il giorno 10, i motoneuroni-NPC sono placcati sia nei pozzetti che nel canale di un compartimento (grigio chiaro) del dispositivo, dove la loro differenziazione in motoneuroni viene continuata per una settimana. I MAB sono placcati sia nei pozzetti che nel canale del compartimento opposto (grigio scuro) il giorno 17. Il giorno 18, viene iniziata la differenziazione dei MAB in miotubi. Il giorno 21, viene stabilito un gradiente volumetrico e chemiotattico per promuovere la polarizzazione motoneurone-neurite attraverso i microsonda del dispositivo. Il compartimento del motoneurone ha ricevuto 100 μL/pozzetto di mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita (compartimento verde chiaro), mentre il compartimento miotubo ha ricevuto 200 μL/pozzetto di mezzo basale del motoneurone con 30 ng/mL di fattori di crescita (compartimento verde scuro) (Tabella 2 e Tabella 3). La coltura viene continuata con il gradiente volumetrico e chemiotattico per altri 7 giorni fino all'analisi al giorno 28. Le immagini in campo luminoso mostrano la morfologia cellulare al giorno 0, al giorno 11, al giorno 18 e al giorno 28 coltivate in dispositivi microfluidici preassemblati. Barra della scala, 100 μm. Questa figura è stata modificata da Stoklund Dittlau, K. et al.18. Le illustrazioni delle celle sono state modificate da Smart Server medical Art22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
8. Fissazione e ICC
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti con attenzione per prevenire il distacco delle colture neuronali. Non rimuovere il liquido dai canali durante i seguenti passaggi.
- Eseguire la fissazione in una cappa aspirante o in un flusso laminare: lavare accuratamente tutti i pozzetti nel dispositivo una volta con DPBS prima della fissazione. Fissare utilizzando il 4 % di paraformaldeide (PFA) in DPBS per 15-20 minuti a RT nel flusso laminare (100 μL/pozzetto).
ATTENZIONE: il PFA è tossico: maneggiare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.- Aggiungere con attenzione 100 μL al pozzetto superiore del dispositivo e attendere alcuni secondi per consentire alla soluzione di fissaggio di fluire attraverso il canale prima di aggiungere 100 μL al pozzetto inferiore. Ripetere sull'altro lato. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di PFA e lavare delicatamente 3 volte per 5 minuti con DPBS. Lasciare in 200 μL/pozzetto DPBS per la conservazione e sigillare la capsula di Petri da 10 cm con parafilm da conservare a 4 °C fino all'esperimento ICC.
NOTA: assicurarsi che i dispositivi non si asciughino durante lo stoccaggio.
- Aggiungere con attenzione 100 μL al pozzetto superiore del dispositivo e attendere alcuni secondi per consentire alla soluzione di fissaggio di fluire attraverso il canale prima di aggiungere 100 μL al pozzetto inferiore. Ripetere sull'altro lato. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di PFA e lavare delicatamente 3 volte per 5 minuti con DPBS. Lasciare in 200 μL/pozzetto DPBS per la conservazione e sigillare la capsula di Petri da 10 cm con parafilm da conservare a 4 °C fino all'esperimento ICC.
- Incubare le cellule con una soluzione di permeabilizzazione (100 μL/pozzetto) di 0,1% Triton X-100 in DPBS per 20 minuti a RT il giorno 1 della procedura ICC. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e aggiungere il 5% di siero d'asino normale in soluzione di Triton X-100/DPBS allo 0,1% (100 μL/pozzetto) per 30 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione sierica di asino normale al 5% e incubare i dispositivi con anticorpi primari (Tabella dei materiali) in siero d'asino normale al 2% in soluzione Triton X-100/DPBS allo 0,1% e incubare a 4 °C durante la notte.
- Implementare una sfumatura di volume. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione anticorpale su un lato dei microsagrovi e 150 μL/pozzetto sull'altro (500 μL totali per dispositivo).
NOTA: È possibile utilizzare diversi anticorpi su entrambi i lati dei microsopracci. In questo caso, non implementare un gradiente di volume con anticorpi primari o secondari attraverso i microsalvi per sostenere l'isolamento fluidico tra i compartimenti. I neuriti nei microsalchi non saranno macchiati senza il gradiente.
- Implementare una sfumatura di volume. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione anticorpale su un lato dei microsagrovi e 150 μL/pozzetto sull'altro (500 μL totali per dispositivo).
- Il giorno seguente (giorno 2 della procedura ICC), rimuovere gli anticorpi primari e lavare accuratamente il dispositivo 3 volte per 5 minuti con la soluzione 0,1% Triton X-100/DPBS.
NOTA: in colture facilmente staccabili, il lavaggio 3x per 5 min può essere sostituito con 1x per 30 min. - Lavora al buio d'ora in poi, poiché gli anticorpi secondari (Table of Materials) sono sensibili alla luce. Incubare cellule con anticorpi secondari in siero d'asino normale al 2% in soluzione di Triton X-100/DPBS allo 0,1% per 1 ora a RT. Implementare un gradiente di volume come indicato nel passaggio 8.3.1. Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi secondari e lavare 3 volte per 5 minuti con DPBS.
- Etichettare il DNA nucleare con DAPI in DPBS (100 μL/pozzetto) per 20 minuti a RT seguito da 3x-4x di 5 min di lavaggio con soluzione Triton X-100/DPBS allo 0,1%. Rimuovere la soluzione Triton X-100/DPBS allo 0,1% da tutti i pozzetti e lasciare asciugare la coltura per alcuni secondi prima di aggiungere una goccia di supporto fluorescente in ciascun pozzetto per sigillare.
NOTA: tenere i dispositivi orizzontali per almeno 24 ore per consentire l'impostazione del supporto di montaggio. Dopo 24 ore, i dispositivi possono essere conservati in una custodia scorrevole a 4 °C. - Immagine in z-stack con un microscopio invertito.
- Per visualizzare NMJ, utilizzare un obiettivo 40x per localizzare i miotubi contrassegnati con un anticorpo miotubo (Table of Materials) ed eseguire registrazioni z-stack per garantire l'imaging del tessuto neuronale e miotubo. Scatta più immagini nel caso in cui il miotubo sia troppo grande per adattarsi a un singolo fotogramma.
- Per la quantificazione NMJ, contare manualmente il numero di co-localizzazioni tra un marcatore presinaptico neuronale e un marcatore AChR attraverso ogni z-stack. Normalizzare il numero di co-localizzazioni al numero di miotubi presenti nello z-stack.
9. Fissaggio e preparazione del dispositivo per SEM
NOTA: quando si cambiano i liquidi, tenere sempre una piccola quantità per coprire la coltura per evitare il collasso cellulare. Questo protocollo utilizza sostanze altamente tossiche ed è necessario lavorare con dispositivi di protezione individuale e in una cappa aspirante durante l'intero processo.
- Fissaggio e smontaggio: Preparare la glutaraldeide (GA) fresca al 2,5% in un tampone cacodilato di sodio da 0,1 M (pH 7,6), filtrare con un filtro da 0,2 μm e riscaldare fino a 37 °C.
ATTENZIONE: GA e cacodilato di sodio sono tossici: maneggiare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.- Lavare accuratamente il dispositivo una volta con DPBS per rimuovere i detriti del supporto e della cella e quindi prefissare la soluzione GA per 15 minuti a RT.
- Utilizzare un bisturi per tagliare con cura il foglio SEM al perimetro del dispositivo mentre si fissa il dispositivo con una pinza. Assicurarsi di non staccare il dispositivo durante il taglio. Spostare il dispositivo e il foglio SEM con l'aiuto di una pinza su una capsula di Petri da 3 cm e posizionare la piastra da 3 cm in una piastra da 10 cm per una facile manipolazione.
- Dopo 15 minuti di prefissazione, rimuovere con attenzione il dispositivo dal foglio SEM usando una pinza. Staccare il dispositivo in un angolo e rimuoverlo lentamente in direzione diagonale verso l'angolo opposto. Osservare le cellule staccarsi dal dispositivo.
- Aggiungere un'ulteriore soluzione GA per coprire l'intero foglio SEM nel piatto da 3 cm e continuare la fissazione per un totale di 2 ore a RT o durante la notte a 4 °C.
NOTA: spingere delicatamente il foglio SEM sotto la soluzione GA con una pinza evitando superfici coperte di cellule.
- Continuare con un protocollo standard per SEM. In breve, incubare in tetrossido di osmio seguito da disidratazione con una serie graduata di etanolo. Inserire il foglio SEM in un supporto per coperchio per l'essiccazione del punto critico e montarlo su mozziconi di supporto per adesivi e rivestimenti in carbonio. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione per visualizzare a una tensione di accelerazione di 5 kV e una distanza di lavoro di 7 mm.
10. Valutazione della funzionalità NMJ utilizzando l'imaging del calcio a cellule vive
- Preparare i dispositivi: Aggiornare il compartimento miotubo con 200 μL / pozzetto del giorno 18 del mezzo basale del motoneurone con 30 ng / mL di BDNF, GDNF e CNTF e il compartimento del motoneurone con 200 μL / pozzetto di mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita (Tabella 2 e Tabella 3).
- Aggiungere il colorante Fluo-4 AM diluito in solvente colorante Fluo-4 al compartimento del miotubo ad una concentrazione finale di 5 μM e incubare il dispositivo al buio a 37 °C, 5% CO2 per 25 min. Mentre il dispositivo è in incubazione, diluire il cloruro di potassio nel mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita ad una concentrazione finale di 450 mM.
NOTA: Fluo-4 AM è un indicatore di calcio, che mostra un aumento della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Lavora al buio d'ora in poi, poiché il colorante è sensibile alla luce. - Dopo 25 minuti, rinfrescare il compartimento miotubo con 200 μL/pozzetto del mezzo basale del motoneurone del giorno 18 con 30 ng/mL di BDNF, GDNF e CNTF e il compartimento del motoneurone con 100 μL/pozzetto di mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita per ristabilire il gradiente chemiotattico e volumetrico.
- Per bloccare gli NMJ, integrare il mezzo compartimentale miotubo con 19 μM dell'antagonista competitivo AChR tubocurarina cloridrato pentaidrato.
ATTENZIONE: Tubocurarina cloridrato pentaidrato è tossico: maneggiare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.
- Aggiungere il colorante Fluo-4 AM diluito in solvente colorante Fluo-4 al compartimento del miotubo ad una concentrazione finale di 5 μM e incubare il dispositivo al buio a 37 °C, 5% CO2 per 25 min. Mentre il dispositivo è in incubazione, diluire il cloruro di potassio nel mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita ad una concentrazione finale di 450 mM.
- Eseguire registrazioni con un microscopio confocale invertito dotato di un incubatore regolato a 37 °C, 5% CO2.
- Con un obiettivo 10x, utilizzare il canale del campo luminoso per individuare i miotubi nel compartimento del miotubo. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset del laser per il canale 488 a un livello in cui la fluorescenza Fluo-4 segna i singoli miotubi.
NOTA: i risultati rappresentativi sono stati acquisiti regolando le barre di scorrimento nelle impostazioni A1 del software su una potenza laser del 5%, un guadagno di 60 (HV) e un offset di 0.
- Con un obiettivo 10x, utilizzare il canale del campo luminoso per individuare i miotubi nel compartimento del miotubo. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset del laser per il canale 488 a un livello in cui la fluorescenza Fluo-4 segna i singoli miotubi.
- Impostare il tempo di registrazione su 1 minuto con intervalli di 1 s. Record per 5-10 s per avere una linea di base, seguita da immediata stimolazione dei motoneuroni con la soluzione di cloruro di potassio.
- Dopo 5-10 s nella registrazione, aggiungere lentamente 25 μL di soluzione di cloruro di potassio a un pozzetto del compartimento del motoneurone per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM.
NOTA: Evitare di aggiungere la soluzione di cloruro di potassio troppo velocemente poiché ciò creerà un'onda attraverso il canale, causando artefatti sulla registrazione.
- Dopo 5-10 s nella registrazione, aggiungere lentamente 25 μL di soluzione di cloruro di potassio a un pozzetto del compartimento del motoneurone per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM.
- Registrare il compartimento del miotubo con la stimolazione del motoneurone due volte con una pausa di 2 minuti, seguita dalla stimolazione diretta con 25 μL di soluzione di cloruro di potassio del compartimento del miotubo per valutare l'attività diretta del miotubo indipendentemente dalla depolarizzazione del motoneurone.
- Per le quantificazioni, cerchiare manualmente ogni miotubo con il software di registrazione e analizzare l'intensità fluorescente Fluo-4 nel periodo di tempo di 1 minuto. Per determinare l'aumento dell'afflusso di calcio, sottrarre il valore basale medio (cioè la media dai primi 10 s prima della stimolazione del cloruro di potassio) dal valore di picco dopo la stimolazione con cloruro di potassio. I risultati rappresentativi sono stati acquisiti utilizzando lo strumento time measurement del software.
Representative Results
Generazione di NMJ in dispositivi microfluidici
Per generare un'unità motoria umana con NMJ funzionali in dispositivi microfluidici disponibili in commercio, sono stati utilizzati motoneuroni umani derivati da iPSC e miotubi umani derivati da MAB. La qualità del materiale delle cellule di partenza è importante, e in particolare la capacità di fusione dei MAB nei miotubi è fondamentale per un esito positivo di questo protocollo. I MAB sono facili da mantenere nella cultura. Tuttavia, è importante valutare la capacità di fusione di ciascun lotto prima di applicarli ai dispositivi microfluidici (Figura supplementare 1A,B)18. Eventuali lotti, che non mostrano la formazione di miotubi dopo 10 giorni di differenziazione, non devono essere utilizzati. L'indice di fusione nella Figura supplementare 1B è stato determinato calcolando la percentuale di nuclei all'interno dei miotubi positivi per ciascun marcatore miotubo del numero totale di nuclei per immagine. Abbiamo scoperto che un indice di fusione di circa l'8% era sufficiente per la nostra co-coltura nella generazione di NMJ.
È sempre importante iniziare una differenziazione dei motoneuroni da una cultura pura di iPSC. Più puro è l'input - più puro è il risultato. Il protocollo di differenziazione dei motoneuroni genera colture di motoneuroni, che sono tipicamente positive all'85%-95% per i marcatori dei motoneuroni (Figura supplementare 1C,D)18. Le cellule rimanenti saranno di solito cellule precursori indifferenziate, che in alcuni casi subiranno un'ampia proliferazione e quindi avranno un impatto negativo sulla qualità della coltura. Per ottenere il miglior risultato di questo protocollo, l'efficienza di differenziazione del motoneurone deve essere valutata prima di applicare il giorno 10 motoneurone-NPC nel dispositivo. Inoltre, un controllo di qualità NPC può essere eseguito al giorno 11 per valutare l'espressione del marcatore NPC Olig2 (Figura supplementare 1E, F).
Inizialmente, i motoneuroni-NPC e i MAB sono stati placcati allo stesso punto temporale il giorno 10. Qui, la differenziazione MAB è stata avviata il giorno 11. Il gradiente del volume e del fattore di crescita implementato il giorno 14 ci ha permesso di valutare la formazione di NMJ al giorno 21, accorciando così il protocollo di una settimana. È interessante notare che abbiamo potuto osservare la formazione nmJ caratteristica da parte di ICC (Figura supplementare 2A). Tuttavia, non siamo stati in grado di acquisire un output funzionale tramite le registrazioni di calcio a cellule vive così presto nella differenziazione del motoneurone (dati non mostrati). Abbiamo concluso che i motoneuroni non erano ancora abbastanza maturi per formare connessioni NMJ funzionali con i miotubi, anche se la morfologia NMJ sembrava promettente. Ciò è in linea con le nostre precedenti osservazioni secondo cui i potenziali d'azione spontanei nei motoneuroni, registrati attraverso l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, si verificano solo al giorno 35 della differenziazione dei motoneuroni15.
Inoltre, abbiamo tentato di prolungare la maturazione dei motoneuroni, così come la sostenibilità della co-coltura, maturando i motoneuroni nel dispositivo per 2 settimane (giorno 24), prima di placcare i MAB. Sfortunatamente, è stata osservata una grande quantità di attraversamento spontaneo di motoneuroni-neuriti attraverso microgroove, che ha provocato l'inibizione dell'attaccamento MAB (Figura supplementare 2B). A causa della mancanza di formazione di miotubi nel canale, non siamo riusciti a identificare NMJ al giorno 36 e quindi abbiamo applicato il protocollo di 28 giorni (Figura 1).
Identificazione, quantificazione e caratterizzazione morfologica di NMJ in vitro
Dopo aver seguito il protocollo di 28 giorni (Figura 1), è stato possibile ottenere NMJ completamente funzionali. Sia in vivo che in vitro, gli NMJ sono caratterizzati immunoisto- o immunocitochimicamente attraverso la co-localizzazione di un marcatore presinaptico e di un marcatore postsinaptico. In questo studio, è stata utilizzata una combinazione di catena pesante del neurofilamento (NEFH) e SYP come combinazione di marcatori presinaptici, che ha permesso il seguito di un singolo neurite dal soma del motoneurone verso il processo più distale. Sul lato muscolare, Btx è ampiamente usato come marcatore postsinaptico per AChRs, ed è stato utilizzato anche in questo studio. L'integrazione di agrin e laminina promuove il raggruppamento degli AChR al sarcolemma19,20,21, rendendo più facile l'identificazione degli AChR in vitro e allo stesso modo aumenta il numero di AChR e NMJ presenti18.
Al fine di localizzare e calcolare gli NMJ in modo imparziale, ogni miotubo viene identificato attraverso la positività della catena pesante della miosina (MyHC) e ripreso in z-stack con ingrandimento 40x utilizzando un microscopio confocale invertito. Per miotubi molto lunghi, sono stati acquisiti più z-stack. Per l'analisi delle immagini, il numero di co-localizzazioni tra NEFH/SYP e Btx viene conteggiato manualmente attraverso ogni z-stack e il numero di co-localizzazioni è normalizzato al numero di miotubi presenti nello z-stack (Figura 2A-C)18. Non tutti i miotubi avranno NMJ, come si vede nella quantificazione dei miotubi innervati (Figura 2D). Di conseguenza, è importante eseguire un approccio di registrazione imparziale, in cui tutti i miotubi sono ripresi, indipendentemente dalla presenza di Btx.
È possibile identificare due tipi di morfologie in questo sistema in vitro . Gli NMJ appaiono come NMJ a punto di contatto singolo, in cui un neurite tocca un cluster di AChR in un punto di interazione, o NMJ a punto di contatto multiplo, dove un neurite si espanderà e si impegnerà con il cluster AChR su una superficie più ampia. Queste due morfologie possono essere identificate sia immunocitochimicamente (Figura 2A)18 che con SEM (Figura 2B)18, e possono anche essere quantificate (Figura 2C)18. Nel complesso, i punti di contatto multipli facilitano una connessione più ampia attraverso un grande incorporamento muscolare, che punta verso una formazione NMJ più matura. Al contrario, gli NMJ del punto di contatto unico sono considerati meno maturi a causa dello stato di sviluppo precoce della cultura.
Valutazione funzionale delle NMJ in vitro
Per valutare la funzionalità degli NMJ, sono state utilizzate registrazioni transitorie di calcio a cellule vive (Figura 3)18. Sfruttando il sistema fluidicamente isolato dei dispositivi microfluidici, il lato del soma del motoneurone è stato stimolato con un'alta concentrazione (50 mM) di cloruro di potassio mentre contemporaneamente registrava un afflusso di calcio nei miotubi, che sono stati caricati con il colorante Fluo-4 sensibile al calcio (Figura 3A). Quasi immediatamente dopo l'attivazione del motoneurone, abbiamo potuto osservare un afflusso di calcio nei miotubi attraverso una caratteristica formazione d'onda, che conferma una connessione funzionale attraverso il motoneurone-neurite e il miotubo (Figura 3A-C)18. Non sono state osservate onde spontanee di calcio né contrazioni spontanee del miotubo, sebbene sia stata osservata una contrazione del miotubo dopo stimolazione diretta con cloruro di potassio. La specificità della connessione è stata ulteriormente confermata con l'aggiunta dell'antagonista competitivo AChR, tubocurarina cloridrato pentaidrato (DTC) al compartimento miotubo (Figura 3A), che ha provocato un'inibizione dell'afflusso di calcio (Figura 3C). Questo effetto ha confermato che la connessione tra motoneuroni e miotubi ha portato a NMJ completamente funzionali. Per valutare il numero di miotubi attivi attraverso la stimolazione NMJ, il compartimento miotubico è stato stimolato direttamente con cloruro di potassio per identificare il numero totale di miotubi attivi in questo compartimento. Circa il 70% dei miotubi erano attivi attraverso l'attivazione stimolata dai motoneuroni con cloruro di potassio (Figura 3D)18.
Questi risultati confermano la formazione, il numero, la morfologia e la funzionalità ottimali di NMJ attraverso la co-coltura dei motoneuroni derivati da iPSC e dei miotubi derivati da MAB durante un protocollo di 28 giorni.
Figura 2: Formazione di NMJ in dispositivi microfluidici. (A) Micrografie confocali di formazione di NMJ in dispositivi microfluidici preassemblati al giorno 28. Gli NMJ sono identificati attraverso la co-localizzazione (punte di freccia) di marcatori presinaptici (NEFH e SYP) e marcatori AChR postsinaptici (Btx) su miotubi colorati di MyHC. Gli NMJ sono identificati morfologicamente attraverso la formazione di punti di contatto singoli o multipli tra neuriti e cluster AChR. Nuclei di etichette DAPI. Barra della scala, 25 μm. L'inserto mostra un ingrandimento di un NMJ. Barra della scala incassata, 10 μm. (B) SEM della morfologia NMJ nei dispositivi microfluidici in silicone al giorno 28. Le punte di freccia raffigurano l'incorporamento di neuriti nel miotubo. Barra della scala, 2 μm. L'inserto mostra un ingrandimento di NMJ. Barra della scala inserita, 1 μm. (C) Quantificazione del numero totale di NMJ per miotubo e del numero di NMJ a punto di contatto singolo e multiplo per miotubo. Il grafico è mostrato come ± errore standard della media da quattro repliche biologiche. La significatività statistica è determinata con il test di Mann-Whitney con * p < 0,05. (D) Quantificazione della percentuale di miotubi innervati. Il grafico è mostrato come ± errore standard della media da quattro repliche biologiche. Questa figura è stata modificata da Stoklund Dittlau, K. et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Conferma della funzionalità NMJ. (A) Illustrazione schematica delle registrazioni transitorie di calcio a cellule vive della funzionalità NMJ in dispositivi microfluidici preassemblati al giorno 28 prima e dopo il blocco NMJ con tubocurarina (DTC)22. I motoneuroni nel compartimento verde chiaro sono stimolati con 50 mM di cloruro di potassio (KCl), che provoca una risposta intracellulare del motoneurone attraverso i neuriti. Ciò evoca un afflusso di calcio (Ca2+) nei miotubi, che sono etichettati con colorante Fluo-4 sensibile al calcio (compartimento verde scuro). (B) Micrografie a fluorescenza Fluo-4 di pre-stimolazione, picco di intensità e post-stimolazione di un miotubo raffiguranti un'onda di aumento del calcio intracellulare sulla stimolazione del motoneurone con KCl. L'inserto mostra un ingrandimento di un miotubo attivo innervato. Barre di scala, 100 μm. Barra della scala inset, 200 μm. (C) Curve rappresentative di afflusso di calcio nei miotubi dopo stimolazione del motoneurone con KCl (freccia) che conferma la funzionalità NMJ. Il miotubo 1-3 mostra curve di calcio caratteristiche attraverso l'innervazione del motoneurone-miotubo, mentre il miotubo A-C DTC raffigura le curve dopo il blocco NMJ con DTC. (D) Rapporto tra miotubi attivi stimolati dai motoneuroni sul numero totale di miotubi attivi. Questa figura è stata modificata da Stoklund Dittlau, K. et al.18. Le illustrazioni delle celle sono state modificate da Smart Server medical Art22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: verifica dei motoneuroni, indice di fusione MAB e controllo di qualità NPC. (A) Immagini confocali di miotubi derivati da MAB 10 giorni dopo l'inizio del differenziamento. I miotubi sono marcati con marcatori miotubi: desmina, MyHC, miogenina (MyoG) e titina. I nuclei sono colorati con DAPI. Barra di scala, 100 μm. (B) Quantificazione dell'indice di fusione MAB 10 giorni dopo l'inizio della differenziazione. Dopo la fame, i MAB si fondono in miotubi multinucleati, che sono stati quantificati per la positività dei marcatori miotubi (AB +). Il grafico raffigura ± errore standard della media da tre repliche biologiche. (C) Immagini confocali di motoneuroni derivati da iPSC al giorno 28 di differenziazione, che sono marcati con marcatori di motoneuroni NEFH, colina acetiltransferasi (ChAT) e Islet-1 oltre al marcatore panneurale βIII-tubulina (Tubulina). I nuclei sono colorati con DAPI. Barre di scala, 75 μm. (D) Quantificazione del numero di cellule, che sono positive per i marcatori del motoneurone e panneurone (AB+). Il grafico raffigura ± errore standard della media da tre repliche biologiche. (E) Immagini confocali di NPC derivati da iPSC al giorno 11 di differenziazione dei motoneuroni, che sono marcati con il marcatore NPC Olig2 e il marcatore panneurale βIII-tubulina (Tubulina). I nuclei sono colorati con DAPI. Barre di scala, 50 μm. (F) Quantificazione del numero di NPC, che sono positivi per Olig2 e βIII-tubulina (AB+). Il grafico raffigura ± errore standard della media da tre repliche biologiche. Questa figura è stata modificata da Stoklund Dittlau, K. et al.18. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Ottimizzazione del protocollo di co-coltura (A) Immagini confocali della formazione di NMJ al giorno 21 della differenziazione dei motoneuroni, quando i MAB vengono seminati nello stesso punto temporale degli NPC al giorno 10. Gli NMJ sono identificati attraverso la co-localizzazione (punte di freccia) di marcatori presinaptici (NEFH e SYP) e marcatori AChR postsinaptici (Btx) su miotubi colorati di MyHC. Barra della scala (a sinistra), 10 μm. Barra della scala (a destra), 5 μm. (B) Immagine in campo luminoso del canale miotubo al giorno 24 raffigurante l'incrocio spontaneo motoneurone-neurite che inibisce l'attaccamento dei MAB. Barra della scala, 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
| Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale |
| IMDM · | 1x | 80% |
| Siero bovino fetale | 15% | |
| Penicillina/Streptomicina | 5000 U/mL | 0.5% |
| L-glutammina | 50 volte | 1% |
| Piruvato di sodio | 100 metri | 1% |
| Aminoacidi non essenziali | 100x | 1% |
| Insulina transferrina selenio | 100x | 1% |
| bFGF (aggiunto fresco) | 50 μg/mL | 5 ng/ml |
Tabella 1: Mezzo di crescita MAB. Il mezzo può durare 2 settimane a 4 °C. bFGF viene aggiunto fresco il giorno dell'uso.
| Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | 50% | |
| Mezzo neurobasale | 50% | |
| Penicillina/Streptomicina | 5000 U/mL | 1% |
| L-glutammina | 50 volte | 0.5 % |
| Supplemento N-2 | 100x | 1% |
| B-27 senza vitamina A | 50 volte | 2% |
| β-mercaptoetanolo | 50 metri quadrati | 0.1% |
| Acido ascorbico | 200 μM | 0,5 μM |
Tabella 2: Mezzo basale del motoneurone. Il mezzo può durare 4 settimane a 4 °C.
| Giorno | Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Scompartimento |
| Giorno 10/11 | Agonista levigato | 10 mM | 500 nM | Ambedue |
| Acido retinoico | 1 mM | 0,1 μM | ||
| DAPT · | 100 metri | 10 μM | ||
| BDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| GDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| Giorno 14 | DAPT · | 100 metri | 20 μM | Ambedue |
| BDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| GDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| Giorno 16 | DAPT · | 100 metri | 20 μM | Ambedue |
| BDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| GDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| CNTF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| Giorno 18 | BDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | Motoneurone |
| GDNF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| CNTF · | 0,1 mg/mL | 10 ng/ml | ||
| Giorno 21+ | BDNF · | 0,1 mg/mL | 30 ng/ml | Miotubo |
| GDNF · | 0,1 mg/mL | 30 ng/ml | ||
| CNTF · | 0,1 mg/mL | 30 ng/ml | ||
| Agrin · | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL | ||
| Laminina | 1 mg/ml | 20 μg/mL | ||
| Giorno 21+ | Senza supplementi | Motoneurone |
Tabella 3: Integratori medi di motoneurone. Gli integratori vengono aggiunti freschi il giorno dell'uso al mezzo basale del motoneurone.
| Giorno | Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Scompartimento |
| Giorno 18 | DMEM/F12 | 97% | MAB | |
| Piruvato di sodio | 100 metri | 1% | ||
| Siero di cavallo | 2% | |||
| Agrin · | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
Tabella 4: Mezzo di differenziazione MAB. Medium può durare 2 settimane a 4 °C. Agrin viene aggiunto fresco il giorno dell'uso.
Discussion
Il protocollo descrive un metodo relativamente facile da usare, che genera unità motorie umane con NMJ funzionali in dispositivi microfluidici disponibili in commercio in meno di 30 giorni. Viene descritto come gli NMJ possono essere valutati morfologicamente attraverso tecniche standard come ICC e SEM e funzionalmente attraverso registrazioni di calcio a cellule vive.
Un grande vantaggio di questo protocollo è l'uso della tecnologia delle cellule staminali. Ciò consente una piena adattabilità in cui gli NMJ possono essere valutati sia in salute che in malattia, indipendentemente dal profilo del donatore. Il modello si è già dimostrato efficace e utile nella ricerca sulla SLA, dove abbiamo identificato le menomazioni nella crescita dei neuriti, nella ricrescita e nei numeri NMJ come nuovi fenotipi dovuti a mutazioni nel gene FUS18. Con questo modello, è possibile espandere la ricerca per includere forme sporadiche di SLA, in cui l'eziologia è sconosciuta, utilizzando iPSC da pazienti sporadici con SLA. Ciò fornisce un vantaggio rispetto ai modelli animali tradizionali, che si basano sulla sovraespressione transgenica di geni mutati per ricapitolare la malattia umana23,24. Inoltre, il nostro sistema completamente umano consente una potenziale ricapitolazione della fisiologia e della malattia specifiche dell'uomo. Studi precedenti hanno dimostrato le differenze tra la morfologia NMJ del roditore e umana25, il che suggerisce che è necessario prestare attenzione quando si utilizzano roditori per affrontare la patologia NMJ umana. Sebbene questo sistema sia una configurazione in vitro relativamente semplice, che manca della complessità di un modello in vivo, è stato possibile dimostrare che la morfologia NMJ visualizzata nei dispositivi microfluidici assomigliava a NMJ di amputati umani25. Inoltre, questo modello consente la valutazione NMJ durante la formazione e la maturazione di NMJ, rivelando potenzialmente fenotipi di malattia precoci, che sono assenti, non identificabili o trascurati nei campioni umani post-mortem.
I MAB forniscono una valida opzione per generare miotubi, sebbene la loro limitata sopravvivenza di 10 giorni sia uno svantaggio del sistema. La sopravvivenza del miotubo si basa sul loro attaccamento alla superficie, che è probabilmente compromesso da contrazioni spontanee delle miofibre. Dopo più di 10 giorni, la maggior parte dei miotubi si sarà staccata, rendendo inutilizzabile la cultura NMJ. Idealmente, i miotubi sarebbero generati anche da iPSC. Tuttavia, i protocolli attuali si sono dimostrati difficili da riprodurre26 a causa della variabilità dell'indice di fusione27,28,29,30.
Utilizzando dispositivi microfluidici disponibili in commercio, abbiamo generato un sistema standardizzato, che è completamente accessibile. Esistono altri modelli NMJ31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Tuttavia, in genere si basano su singoli compartimenti, che mancano della compartimentazione e dell'isolamento fluidico tra i tipi di cellule, o su vasi di coltura su misura, il che riduce la disponibilità e potenzialmente anche la riproducibilità. I dispositivi microfluidici utilizzati per questo protocollo possono essere acquistati con microgroovi di varie lunghezze, che consentono ulteriori analisi come il trasporto assonale43,44 o l'assotomia18,45,46 indagini. L'isolamento fluidico tra i compartimenti consente inoltre il trattamento farmacologico compartimentato di motoneuroni o miotubi, che può essere favorevole nello sviluppo della terapia. Sono emerse altre aziende specializzate in microfluidica, che si sono aperte a un'ampia selezione di design e funzionalità dei dispositivi, promuovendo ulteriormente l'accessibilità per la ricerca in vitro.
In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo che fornisce un metodo affidabile, versatile e facile per coltivare unità motorie umane con NMJ funzionali.
Disclosures
L.V.D.B. ha un brevetto sull'uso di inibitori HDAC nella malattia di Charcot-Marie-Tooth (US-2013227717-A1), è co-fondatore scientifico di Augustine Therapeutics e membro del suo comitato consultivo scientifico. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Nikky Corthout e Sebastian Munck di LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) per i loro consigli sulle registrazioni di fluorescenza transitoria del calcio a cellule vive. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Commissione Fulbright in Belgio e Lussemburgo, KU Leuven (C1 e Fondo "Opening the Future"), VIB, l'Agenzia per l'innovazione per la scienza e la tecnologia (IWT; SBO-iPSCAF), il "Fondo per la ricerca scientifica nelle Fiandre" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, la ALS Liga België (Una cura per la SLA), il governo belga (Programma interuniversitario dei poli di attrazione P7/16 avviato dall'Ufficio federale belga per la politica scientifica), la Fondazione Thierry Latran e l'"Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. e J.B. sono supportati da borse di dottorato assegnate da FWO-Vlaanderen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
| Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
| Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
| Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
| Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
| Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
| βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
| B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
| BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
| bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
| Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
| Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
| CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
| DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
| DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
| Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
| Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
| Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
| GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
| Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
| ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
| Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
| Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
| Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
| Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
| Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
| Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
| NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
| Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
| Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
| Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
| Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
| Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
| Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
| Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
| Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
| Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
| RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
| Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
| Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
| Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
| T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
| Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
| TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
| Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
| XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
| Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |
References
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